微生物限度检查法汇总

微生物限度检查法汇总
微生物限度检查法汇总

微生物限度检查法

1 范围

本标准适用于非规定灭菌制剂及其原料、辅料检查项目包括细菌数、霉菌及酵母菌数、控制菌检查及活螨的检查。

2 依据标准

《中华人民共和国药典》

《药品微生物学检验手册》

YBB00132002药品包装用复合膜、袋通则

3 人员资质及培训

3.1 从事药品微生物检验工作的负责人应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。

3.2 检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训,在确认可以承担某一试验前,不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训,经考核合格后方可上岗,同时,实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划。

3.3 检验人员必须熟悉相关检验方法、程序、检测目的和结果评价。

3.4 实验室应通过参加内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法客观评价检验人员的能力,必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时,有必要在检测前确认微生物检测人员的操作技能。

4 培养基

4.1 培养基的制备

4.1.1 培养基可按处方配制。也可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基。

4.1.2 在制备培养基时,应选择质量符合要求的脱水培养基或单独配方组分进行配制。脱水培养基应附有处方和使用说明,配制时应按使用说明上的要求操作以确保培养基的质量符合要求,不得使用结块或颜色发生改变的脱水培养基。

4.1.3 脱水培养基或单独配方组分应在适当的条件下贮藏,如低温、干燥和避光,所有的容器应密闭,尤其是盛放脱水培养基的容器。商品化的成品培养基除了应附有处方和使用说明外,还应注明有效期、贮藏条件、适用性检查试验的质控菌和用途。

4.1.4 为保证培养基质量的稳定可靠,各脱水培养基或各配方组分应准确称量,并要求有一定的精确度。配制培养基最常用的溶剂是纯化水,特殊情况下,可能需要去离子水和蒸馏水。应

记录各称量物的重量和水的使用量。

4.1.5 配制培养基所用容器和配套器具应洁净,可用纯化水冲洗玻璃器皿以消除清洁剂和外来物质的残留。对热敏感的培养基如糖发酵培养基其分装容器一般应预先进行灭菌,以保证培养基的无菌性。

4.1.6 脱水培养基应完全溶解于水中,再进行分装和灭菌。配制时若需要加热助溶,应注意不要过度加热,以避免培养基颜色变深。如需要添加其它组分时,加入后应充分混匀。

4.1.7 应按照生产商提供或使用者验证的参数进行培养基的灭菌。培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术,特殊培养基可采用薄膜过滤法除菌。培养基灭菌程序应采用验证的灭菌程序灭菌,培养基灭菌方法和条件,应通过无菌性和促生长试验进行验证。此外,对高压灭菌器的蒸汽循环系统也要加以验证,以保证在一定装载方式下的正常热分布,温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基的过热,过度灭菌可能会破坏大多数的细菌和真菌培养基促生长的质量。灭菌器中培养基的容积和装载方式也将影响加热的速度。因此,应根据灭菌培养基的特性,进行全面的灭菌程序验证。

4.1.8 应确定每批培养基灭菌后的pH值(冷却至室温25℃测定)。若培养基处方中未列出pH 值的范围,除非经验证表明培养基的pH值允许的变化范围很宽,否则,pH值的范围不能超过规定值±0.2。

4.1.9 制成平板或分装于试管的培养基应进行下列检查:容器和盖子不得破裂,装量应相同,尽量避免形成气泡,固体培养基表面不得产生裂缝和涟漪,在冷藏温度下不得形成结晶,不得污染微生物等。应记录批数量、有效期,并进行培养基的无菌检查。

4.2 培养基的贮藏

4.2.1 自制的培养基应标记名称、批号、配置日期等信息,并在已验证的条件下贮藏。商品化的成品培养基标签上应标有名称、批号、生产日期、失效期及培养基的有关特性,生产商和使用者应根据培养基使用说明书上的要求进行贮藏,所使用的贮藏和运输条件应使成品培养基最低限度的失去水分并提供机械保护。

4.2.2 培养基应避光保存,若要长期保存,应置于密闭容器中以防止水分流失。琼脂平板最好现配现用,如置冰箱保存,一般不超过1周,且应密闭包装,若延长保存限期,保存期需经验证确定。

4.2.3 固体培养基灭菌后的再融化只允许1次,以避免因过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。培养基的再融化一般采用水浴或流通蒸汽加热。若使用微波炉,应避免培养基过度受

热及水分的蒸发,更要注意安全。融化的培养基应置45℃~50℃的水浴中,不得超过8小时。倾注培养基时,应擦干培养基容器外表面的水分,避免容器外壁的水滴进行培养基中造成污染。

4.2.4 使用过的培养基(包括失效的培养基)应与未使用的培养基分开摆放,并按照规定程序及时进行处理。

4.3 培养基的质量控制试验

4.3.1 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。实验室配制的培养基的常规监控项目是pH、适用性检查试验,定期的稳定性检查以确定有效期。培养基在有效期内应依据适用性检查试验确定培养基质量是否符合要求。有效期的长短将取决于在一定存放条件下(包括容器特性及密闭性)的培养基其组分的稳定性。

4.3.2 除另有规定外,在实验室中,若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控,那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。如果培养基的制备过程未经验证,那么每一批培养基培养基均要进行适用性检查试验,试验的菌种可根据培养基的用途从相关附录中进行选择,也可增加从生产环境及产品中常见的污染菌株。

4.3.3 培养基的质量控制试验若不符合规定,应寻找不合格的原因,以防止问题重复出现。任何不符合要求的培养基均不能使用。

5 菌种

5.1 药品微生物检验用的试验菌应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株,或使用与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。

5.2 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。从国内或国外菌种保藏机构获得的标准菌株经过复活并在适宜的培养基生长后,即为标准储备菌株。标准储备菌株应进行纯度和特性确认。标准储备菌株保存时,可将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中,并分装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻(低于-30℃)等方法保存。低于-70℃或低温冷冻干燥方法可延长菌种保存时间。标准储备菌株可用于制备每月或每周1次转种的工作菌株。冷冻菌种一旦解冻转种制备工作菌株后,不等重新冷冻和再次使用。

5.3 工作菌株的传代次数应严格控制,不得超过5代(从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代),以防止过度的传代增加菌种变异的风险。1代是指将活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养,任何亚培养的形式均被认为是转种或传代1次。必要时,实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。

5.4 工作菌株不可替代标准菌株,标准菌株的商业衍生物仅可用作工作菌株。

5.5 实验室必须建立和保存其所有菌株的进出、收集、贮藏、确认试验以及销毁的记录,应有菌种管理的程序文件(从标准菌株到工作菌株),该程序包括:标准菌株的申购记录;从标准菌株到工作菌株操作及记录;菌种必须定期转种传代,并做纯度、特性等实验室所需关键指标的确认,并记录;每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数;菌种生长的培养基和培养条件;菌种保藏的位置和条件;其他需要的文件。

6 微生物限度检验实验室

6.1 微生物限度检查的全过程,均应遵守无菌操作,严防再污染。因此,微生物限度检查通常应在环境洁净度C级下的局部A级的单向流空气区域内进行;限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间或传递窗(柜)。应按相关并定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证和日常监测。

6.2 实验室对所有的消毒剂种类应定期更换,使用的消毒剂应无菌。

6.3 注意进出洁净区时,相邻两门不能同时打开,并在人流和物流通道房间增加气锁。

7 设备

7.1 实验室配备与检验能力和工作量相适应的仪器设备,其类型、测量范围和准确度等级应满足检验所采用标准的要求,设备的安装和布局应便于操作,易于维护、清洁和校准。

7.2 实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能,并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用,使用要有记录。为保证设备处于良好工作状态,应定期维护和期间核查,并保存相关记录。

8 人员进出洁净区的要求

8.1 进入洁净区的人员应身体健康,不得有传染病、皮肤病或体表伤口以及其它不适宜进入洁净区的身体状况。检验人员若有身体不适应按及时报告,按《职工主动报告身体不适应生产情况管理办法》记录和处理。

8.2 进入洁净区的人员不得化妆,不允许佩戴饰物。

8.3 人员按洁净区操作规程要求进出洁净区。

8.4 洁净区内的人数应当严加控制,检查和监督应当尽可能在检验的洁净区外进行,特殊情况确需进入的,应当事先对个人卫生、更衣等事项进行指导、办理审批手续,经批准后由本岗位人员陪同方可进入洁净区。

9 物品进出洁净区要求

9.1 试验所需的无菌器具及洁净服应按操作规程要求清洗、包装、灭菌、传递,并在灭菌有效

期内按先进先出的原则使用。

9.2 被检样品应按操作规程要求贮藏、标记、消毒、传递,并能够保证其完整性而其性状不改变。

9方法验证

9.1 验证的基本要求

符合下列条件之一的,应当对检验方法进行验证:①采用新的检验方法;②若产品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时;③采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法;④法规规定的其他需要验证的检验方法。

9.1.1 根据样品特性,制订检验方法和检验条件,并写出验证方案,保证验证试验所用的仪器、培养基和试剂等均符合试验要求,并按制订的方法进行试验。

9.1.2 根据验证结果,判断是否符合设立的验证标准。若符合,按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查;若不符合,应重新设立验证方案,再进行验证,直至验证结果符合设立的验证标准。

9.1.3 验证试验的菌株使用3~5代(从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)。

9.2 微生物限度检查法验证

9.2.1 检验量

9.2.1.1 固体及半固体(黏稠性供试品)制剂检验量为10g。

9.2.1.2 液体制剂检验量为10ml。

9.2.1.3 包装膜、袋等包装材料除另有规定外,每项检验量为100cm2。

9.2.1.4 特殊贵重或微量包装的药品,检验量可酌减。除另有规定外,口服固体制剂不低于3g,液体制剂采用原液者不得少于6ml,采用供试液者不得少于3ml,外用药品不得少于5g。

9.2.1.5 要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml用于阳性对照试验)。

9.2.2 供试液的制备

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。如使用了乳化剂、分散剂、中和剂或灭活剂,其用量应证明是有效的,并对微生物的生长和存活无影响性。供试液的制备若需要用水浴加温时,温度不应超过45℃,30min。供试液从制备至加入检验用培养基不得超过1小时。除另有规定外,常用的供试品制备方法如下:

9.2.2.1 液体供试品:取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为供试液。油剂可先加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀,然后再加0.9%无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。可溶性液体制剂可用混合的供试品原液作为供试液。

9.2.2.2 固体、半固体或黏稠液供试品:取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪(3000~5000r/min、2min~4min)或其他有效的方法,混匀,作为供试液。必要时加适量的灭菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。蜜丸等需剪碎,放入匀浆杯。

9.2.2.3膜、袋等包装材料供试品:用开孔面积为20cm2的灭菌金属模板放在试样的内层面上,将无菌棉签用无菌0.9%氯化钠溶液稍沾湿,在板孔范围内擦拭,在板孔范围内擦拭5次,换

1支棉签再擦拭5次,每个位置用2支棉签共擦拭10次,擦拭5个位置共100cm2,每支棉签

擦拭后立即剪断,投入盛有30ml无菌氯化钠溶液的大试管中。全部擦抹棉签均投入管中后,将管迅速摇晃1分钟,即得1:10供试液。

9.2.2.4 具抑菌活性的供试品

当供试品具有抑菌活性时,应消除供试液的抑菌活性后,再依法检查。常用的方法如下:9.2.2.4.1 稀释法:取规定量的供试液,加至较大量的培养基中,使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。用平板法测定菌数时,1ml供试液可等量分注多个平皿;控制菌检查时,可加大增菌培养基的用量。培养基稀释法适用于抑菌作用不强的制剂。

9.2.2.4.2 离心沉淀集菌法:取规定量的供试液, 500r/min,离心3min,取全部上清液混合,用于细菌检查。

9.2.2.4.3 薄膜过滤法:采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45微米,直径一般为50毫米,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后,若需要冲洗液冲洗滤膜,每张滤膜每次冲洗量为100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,(即用1:10的供试液10ml)加至滤杯中过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml 进行试验。(即用1:102的供试液各10ml)加至滤杯中,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数依据每种供试品的特性而定。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。

9.2.2.4.4 中和法:凡含贡、砷或防腐剂等的供试品,可用相应的试剂钝化、中和其抑菌活性,

制成供试液。

9.2.3 供试液的稀释

9.2.3.1 取3~4支灭菌试管,分别加入9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。加稀释剂后,试管应立即塞上。

9.2.3.2 另取1支1ml灭菌吸管吸1:10均匀供试液1ml,加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中,混匀,即1:100供试液以此类推,根据供试品污染程度,可稀释至1:103、1:104等适宜的稀释级(3~4)。每递增1稀释级,必须另换一支吸管。

9.2.4 细菌、霉菌和酵母菌检查法的验证

9.2.4.1 计数方法验证

9.2.4.1.1 验证用菌株大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(B)98001]、黑曲霉[CMCC(B)98003]。

接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,培养18~24h;黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基,培养5天~7天。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含50cfu~100cfu的菌悬液。

9.2.4.1.2 验证方法验证试验分四组,至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算供试品组和对照试验组的菌回收率。

9.2.4.1.2.1 试验组:取最低稀释级的供试液,按每1ml供试液加入50cfu~100cfu试验菌,按菌落计数方法测定其菌数。平皿法计数时,取试验菌液、供试液1ml分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基;薄膜过滤法计数时,取供试液2ml过滤,冲洗液冲洗,并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。

9.2.4.1.2.2 菌液组:取上述试验菌液,测定其加入的试验菌菌数。

9.2.4.1.2.3 供试品对照组:取最低稀释级的供试液1ml,按菌落计数方法测定其所含菌数。

9.2.4.1.2.4 稀释剂对照组:为考察供试液制备过程对微生物的影响程度,可用相应的稀释液替代供试液,加入试验菌,使最终菌浓度为每1ml含50cfu~100cfu,按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。

试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数

9.2.4.1.2.5 试验组的菌回收率(%)= ×100%

菌液组的平均菌落数

稀释剂对照组的平均菌落数

9.2.4.1.2.6 稀释剂对照组的菌回收率(%)= ×100%

菌液组的平均菌落数

9.2.4.1.3结果判断:稀释剂对照组的菌回收率菌应不低于70%。若试验组的菌回收率均不低于70%,则可按该供试液制备方法和菌落计数法测定供试品的细菌、霉菌或酵母菌数;若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%,应建立新的方法,消除供试品的抑菌活性,并重新验证。9.2.4.1.4 验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

9.2.4.2 操作方法

9.2.4.2.1 平皿法

一般取适宜的连续2~3个稀释级的供试液进行细菌、霉菌和酵母菌数测定。

取供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

阴性对照试验:取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板,菌不得有菌生长。

培养:一般细菌计数平板倒置于30℃~35℃培养箱中培养3天。霉菌、酵母菌计数平板倒置于23℃~28℃培养箱中培养5天。菌落计数。

9.2.4.2.2 薄膜过滤法

取相当1g或1ml供试品的供试液直接过滤,或加至适量稀释剂中,混匀,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。滤膜贴于平板上时不得有空隙或气泡,否则影响微生物生长。

阴性对照:取试验用的稀释剂1ml同法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

9.2.4.2.3 培养基稀释法

取低稀释级供试液(原液或1:10供试液)2份,每份各1ml,分别注入5个或5个以上平皿的中(每皿0.2ml或<0.2ml),每1个平皿倾注营养琼脂培养基约15ml,混匀,凝固后,倒置培养,计数。

每1ml供试液等量分注5个或5个以上平板点计的菌落数之和,即为每1ml的菌落数,共得2组数据。以2份低稀释级供试液菌落数的平均数乘以稀释倍数的值报告。

9.2.4.2.4 结果报告

按细菌、霉菌及酵母菌的报告规则计数,当结果满足[8.2.4.1.3]的要求时,照此检查法和检查条件进行供试品的微生物限度检查。如结果不满足[8.2.4.1.3]的要求时,需改进后重新进

行方法验证。

9.2.5 控制菌检查法的验证

9.2.5.1 验证用菌株及菌液制备

9.2.5.1.1 验证用菌种

大肠埃希菌[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]

乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B)50094]

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]

生孢梭菌[CMCC(B)64941]

菌液制备:分别取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的营养琼脂斜面培养物少许,各接种至5ml营养肉汤培养基内,置35℃~37℃培养18h~24h,取均匀培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10cfu~100cfu的菌悬液,其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布,经培养后计数确定。生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,培养18h~24h。用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1ml含菌10cfu~100cfu的菌悬液。

9.2.5.2 供试液的制备[见SOP-QC-SW-101微生物限度检查法6.2.2细菌、霉菌和酵母菌计数] 9.2.5.3 验证方法:除另有规定外,控制菌培养温度为30℃~35℃。

9.2.5.3.1 试验组:取规定量供试液及10cfu~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应控制菌检查法进行检查。验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为试验菌。当采用薄膜过滤法时,取规定量供试液,过滤,冲洗,试验菌应加在最后一次冲洗液中,过滤后,取出滤膜接入增菌培养基中。

9.2.5.4 结果判定:若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法作该供试品的控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应参照[8.2.2.4]中具抑菌活性的供试品项下操作,以消除供试品的抑菌活性。建立新的方法,并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

9.2.5.5 大肠埃希菌检查法验证

9.2.5.5.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,加入含10cfu~100cfu的大肠埃希菌悬液做试验组,培养18h~24h时,必要时可延长至48小时。

9.2.5.5.2 MUG-Indole检查:取上述培养物,用灭菌吸管吸取0.2ml接种至含5mlMUG培养基管内培养,同时取1支5mlMUG培养基管接种阳性对照培养物0.2ml,分别在5小时、24小时,取未接种的MUG培养基管本底对照,将各管置365nm紫外光观察有无荧光。阳性对照应呈现荧光,MUG阳性,否则试验失败。供试液的MUG管呈现荧光,MUG阳性,无荧光,MUG阴性。然后加靛基质(Indole)试液4~5滴于上述MUG管内,观察液面颜色,呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。供试液按照表1的结果进行判断或做进一步的检查。

表1 结果分析

9.2.5.5.3 分离培养

取供试液增菌液及阳性对照培养液轻轻摇动,以接种环沾取培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18h~24h,当阳性对照的平板呈典型菌落生长,若供试液的平板上无菌落生长、或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。

表2大肠埃希菌菌落形态特征

9.2.5.6 大肠菌群检查法验证

9.2.5.6.1 取装量10ml的胆盐乳糖发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1:1000的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml),加入含10~100cfu的大肠埃希菌悬液做试验组,培养18h~24h。

9.2.5.6.2 胆盐乳糖发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18h~24h。

9.2.5.6.3 若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验。

表3大肠菌群菌落形态特征

9.2.5.6.4 确证试验从上述分离平板上挑选取4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24h~48h。若产酸产气,判该胆盐乳糖发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。9.2.5.7 铜绿假单胞菌检验法验证

9.2.5.7.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,加入含10cfu~100cfu的铜绿假单胞菌悬液做试验组,培养18h~24h。

9.2.5.7.2 取上述培养物,划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平板上,培养18h~24h。

9.2.5.7.3 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有篮绿色素扩散。若平板上无菌落生长,或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌。

9.2.5.8 沙门菌检验法验证

9.2.5.8.1 取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至适量(不少于200ml)的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其它适宜的方法混匀,加入含10cfu~100cfu的沙门菌悬液做试验组,培养18h~24h。

9.2.5.8.2 取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后,分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18h~24h(必要时延长至40h~48h)。

9.2.5.8.3 若平板上无菌落生长,或生长的菌落不同于表4所列的特征,判供试品未检出沙门菌。

9.2.5.8.4 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2~3

个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18h~24h,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色,底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。

表4 沙门菌菌落形态特征

9.2.5.9 金黄色葡萄球菌检验法验证

9.2.5.9.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的亚碲酸钠(钾)肉汤(或营养肉汤)培养基中,加入含10~100cfu的金黄色葡萄球菌悬液做试验组,培养18h~24h,必要时可延长至48小时。

9.2.5.9.2 取上述培养物,划线接种于卵黄高盐琼脂培养基或甘露醇高盐琼脂培养基的平板上,培养24h~72h。

9.2.5.9.3 若平板上无菌落生长,或生长的菌落不同于表5所列的特征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

9.2.5.10 梭菌的检验法验证

9.2.5.10.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)2份,其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却,上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的0.1%新鲜庖肉培养基中,加入含10cfu~100cfu的生孢梭菌悬液做试验组各培养基管在厌氧条件下培养72h~96h。

9.2.5.10.2 如试验管不出现浑浊、产气、消化碎、臭肉等现象,判供试品未检出梭菌;否则,应取上述培养物0.2ml,涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,在厌氧条件下培养48h~72h。

9.2.5.10.3 若平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌。

9.2.5.11 白色念珠菌的检验法验证

9.2.5.11.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2)直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的沙氏葡萄糖液体培养基中,培养18~72小时。

9.2.5.11.2 取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。

9.2.5.11.3 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色,偶见淡黄色,表面光滑有浓酵母气味,培养时间稍久则菌落增大,颜色变深、质地变硬或有皱褶。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出白色念珠菌。若平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上,培养24~48小时(必要时延长至72小时)。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长,判供试品未检出白色念珠菌。

9.2.5.11.4 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色,挑取相符或疑似的菌落接种于1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上,培养24~48小时。取培养物进行染色、镜检及芽管试验。

9.2.5.11.5 牙管试验

挑取1%聚山梨酯80-玉米琼脂培养基上的培养物,接种于加有一滴血清的载玻片上,盖上载玻片,置湿润的平皿内,于35℃~37℃培养1~3小时,置显微镜下观察孢子上有否长出短小芽管。

若上述疑似菌为革兰氏阳性菌,显微镜下未见厚膜孢子、假菌丝、芽管,判供试品未检出白色念珠菌。

9.2.5.11 结果判断

若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。

若试验组未检出试验菌,应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性,并重新验证。

10 制定检验方法SOP

10.1 各品种经方法验证后制定该品种的微生物限度检验方法SOP。

10.2 检验操作依现行的微生物限度检验方法SOP规定进行。

11 检验方法

11.1供试液的制备

一般供试品的检验量为10g或10ml;膜、袋等包装材料100cm2;贵重药品、微量包装药品

的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g或10ml 用于阳性对照试验)。

根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。除另有规定外,常用供试液制备方法如下。

11.1.1液体供试液

取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

11.1.2固体、半固体或粘稠性供试品

取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1:10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。特殊情况按客户提供方法制备,新增品种按验证的方法制备。

11.1.3非水溶性供试品

取供试品5g(5ml),加至溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻璃棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1:20的供试液。

11.1.4膜、袋等包装材料供试品

用开孔面积为20cm2的灭菌金属模板放在试样的内层面上,将无菌棉签用无菌0.9%氯化钠溶液稍沾湿,在板孔范围内擦拭,在板孔范围内擦拭5次,换1支棉签再擦拭5次,每个位置用2支棉签共擦拭10次,共擦拭5个位置100cm2,每支棉签擦拭后立即剪断(或烧断),投入盛有30ml 无菌氯化钠溶液的大试管中。全部擦抹棉签均投入管中后,将管迅速摇晃1分钟,即得供试液。

11.2细菌、霉菌及酵母菌计数

除另有规定外,细菌培养温度为30~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。检查结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为报告,特殊品种可以最小包装单位报告。

计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1:10、1:102等稀释级的供试液。

11.2.1 平皿法

11.2.1.1供试品检验:

根据菌落报告规则取相应稀释级的供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中,注入15ml~20ml 温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母进出粉胨葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

11.2.1.2阴性对照试验:取试验用的稀释液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基至少制备2个平板,均不得有菌生长。

11.2.1.3培养和计数:除另有规定外,细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落成长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数,点计菌落数后,计算各稀释级供试液的平均菌落数,按菌落报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的平均数不小于15,则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

一般营养琼脂培养基用于细菌计数;玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数;酵母浸出粉栋葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下,若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌,则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数,与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较,以菌落数高的培养基中的菌落为计数结果。

含蜂蜜、王浆的液体制剂,用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数,用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数,合并计数。

11.2.1.4 菌数报告规则

细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数在小于100cfu的稀释级,作为菌数报告(取两位有效数字)的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g、1ml或10cm2供试品中所含的菌数。

如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于

1时,以<1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。若两个稀释级的菌落数均超出范围,需重试。11.2.2 薄膜过滤法

11.2.2.1 供试品检验:

采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大于0.45微米,直径一般为50毫米,若采用其他直径的滤膜,冲洗量应进行相应的调整。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以湿润滤膜。油类供试品,其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率,应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经滤膜过滤后,若需要冲洗液冲洗滤膜,每

张滤膜每次冲洗量为100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

取相当于每张滤膜含1g、1ml或10cm2供试品的供试液,(即用1:10的供试液10ml)加至滤杯中过滤。若供试品每1g、1ml或10cm2所含的菌数较多时,可取适宜稀释级的供试液1ml 进行试验。(即用1:102的供试液各10ml)加至滤杯中,过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其他适宜的冲洗液冲洗滤膜,冲洗次数依据每种供试品的特性而定。冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基制备一张滤膜。

11.2.2.2 阴性对照试验:取试验用的稀释液1ml,照上述薄膜过滤法操作,作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

11.2.2.3 培养和计数:培养条件和计数方法同平皿法,每片滤膜上的菌落数应不超过100cfu。

11.2.2.4 菌数报告规则:

(1)若每张滤膜上的菌落数在100cfu以内,以相当于1g、1ml或10cm2供试品的菌落数报告菌数;

(2)若滤膜上无菌落生长,以<1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm2供试品),或<1乘以稀释倍数的值报告菌数;

(3)若两张滤膜上均有菌生长,以菌数在100以内的菌落数乘以稀释倍数报告菌数,但菌数均在100以上,需重试。

11.3 控制菌检查

除另有规定外,控制菌的培养温度为30~35℃。

11.3.1大肠埃希菌(Escherichia coli)

11.3.1.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。另取一瓶胆盐乳糖培养基加入含10cfu~100cfu的菌悬液做阳性对照,同步培养。

11.3.1.2 MUG-Indole检查:取上述培养物,用灭菌吸管吸取0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,同时取1支5mlMUG培养基管接种阳性对照培养物0.2ml,于5小时、24小时, 在置366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基管做本底对照。若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性,无荧光,为MUG阴性。阳性对照应呈现荧光,MUG阳性,否则试验失败。观察后,沿培养管的管壁加入数滴(约4~5滴)靛基质(Indole)试液,观察液面颜色,

呈玫瑰红色为靛基质阳性,呈试剂本色为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。按照表1的结果进行判断或做进一步的检查。

表1 结果分析

11.3.1.3 分离培养

取供试液增菌液及阳性对照培养液轻轻摇动,以接种环沾取1~2环培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18~24小时,当阳性对照的平板呈典型菌落生长,供试液的平板上无菌落生长或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。若有相符或疑似大肠埃希菌的菌落生长,需进一步进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,确认是否为大肠埃希菌。

表2 大肠埃希菌菌落形态特征

11.3.2 大肠菌群(Coliform)

11.3.2.1 取装量10ml的乳糖胆盐发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml(含供试品0.1g或0.1ml)、1:100的供试液1ml(含供试品0.01g或0.01ml)、1:1000的供试液1ml(含供试品0.001g或0.001ml),另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18~24小时。

11.3.2.2 乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气,判该管未检出大肠菌群;若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板,培养18~24小时。

11.3.2.3 若平板上无菌落生长或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌,判该管未检出大肠菌群;若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似,且为革兰阴性无芽孢杆菌,应进行确证试验。

表3 大肠菌群菌落形态特征

11.3.2.4 确证试验从上述分离平板上挑选取4~5个疑似菌落,分别接种于乳糖发酵管中,培养24~48小时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群,否则判未检出大肠菌群。

11.3.2.5 根据大肠菌群的检出管数。按表4报告1g或1ml供试品中的大肠菌群数。

表4 可能的大肠菌群数表

11.3.3 沙门菌(Salmonella)

11.3.3.1 取供试品10g或10ml,直接或处理后接种至200ml的营养肉汤培养基中,用匀浆仪或其它适宜的方法混匀,培养18~24小时。

11.3.3.2 取上述培养物1ml,接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中,培养18~24小时后,分别划线接种于胆盐硫乳琼脂(或沙门、志贺菌属琼脂)培养基和麦康凯琼脂(或曙红亚甲蓝琼脂)培养基的平板上,培养18~24小时(必要时延长至40~48小时)。

11.3.3.3 若平板上无菌落生长,或生长的菌落不同于表5所列的特征,判供试品未检出沙门菌。

11.3.3.4 若平板上生长的菌落与表5所列的菌落形态特征相符或疑似,用接种针挑选2~3

个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种,培养18~24小时,如斜面未见红色、底层未见黄色;或斜面黄色,底层无黑色,判供试品未检出沙门菌。否则,应取三糖铁琼脂培养物进行适宜的鉴定试验,确认是否为沙门菌。

表5 沙门菌菌落形态特征

11.3.4 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

11.3.4.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培养基中,培养18~24小时。

11.3.4.2 取上述培养物,划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的平板上,培养18~24小时。

11.3.4.3 铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润,灰白色,周围时有蓝绿色素扩散。若平板上无菌落生长,或生长的菌落与上述菌落形态特征不符,判供试品未检出铜绿假单胞菌。若平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰氏染色、镜检及氧化酶试验。

11.3.4.4 氧化酶试验

取洁净滤纸片置于平皿内,用无菌玻璃棒挑取斜面培养物涂于滤纸片上,滴加新配制的1%盐酸二甲基对苯二胺试液,在30秒内若纸片上的培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性,否则为阴性。

若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性,均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则,应进行绿脓菌素试验。

11.3.4.5 绿脓菌素试验

取营养琼脂斜面培养物接种于绿脓菌素测定用培养基(PDP)琼脂培养基斜面上,培养24小时,加三氯甲烷3ml~5ml至培养管中,以无菌玻璃棒搅碎培养基并充分振摇。静置片刻,将三氯甲烷相移至另一试管中,加入1mol/L盐酸试液约1ml,振摇后,静置片刻,观察。若

盐酸溶液呈粉红色,为绿脓菌素试验阳性,否则为阴性。同时用未接种的PDP琼脂培养基斜面同法作阴性对照,阴性对照试验应呈阴性。

若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性,判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性,应继续进行适宜的生化试验,确认是否为铜绿假单胞菌。

11.3.5 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

11.3.5.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml、10cm2),直接或处理后接种至100ml的营养肉汤培养基中,培养18~24小时,必要时可延长至48小时。

11.3.5.2 取上述培养物,划线接种于甘露醇高盐琼脂培养基的平板上,培养24~72小时。

11.3.5.3 若平板上无菌落生长,或生长的菌落不同于表6所列的特征,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似,应挑选2~3个菌落,分别接种于营养琼脂培养基斜面上,培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色,并接种于营养肉汤培养基中,培养18~24小时,作血浆凝固酶试验。

表6 金黄色葡萄球菌菌落形态特征

11.3.5.4 血浆凝固酶试验

取灭菌小试管3支,各加入血浆和无菌水溶液(1:1)0.5ml,再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养液(或由营养琼脂培养基斜面培养物制备的浓菌悬液)0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml,即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养,3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如,阳性对照管血浆应凝固,若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性,否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时,应另制备血浆,重新试验。

若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性,判供试品未检出金黄色葡萄球菌。

11.3.6 梭菌(Clostridium)

11.3.6.1 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)2份,其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中。置厌氧条件下培养48小时。

微生物限度检查方法及其验证报告(修改)

文件编号:73021微生物限度检查方法及其验证报告

目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果

1 样品相关信息 1.1 基本信息(三批) 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基

2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种

3 试验环境 《中国药典》2015版规定,微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测,静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部:(通则1105)非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法、(通则1106)非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法、(通则1107)非无菌药品微生物限度标准及(通则1121)抑菌效力检查法规定,本品微生物限度标准为:1g供试品中,需氧菌总数不得过1000cfu,霉菌和酵母菌总数不得过100cfu,大肠埃希菌不得检出。

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批,验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请,验证方案编制完成后,填写《确认和验证方案审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后,方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告,并填写《验证报告审批表》,经验证小组会签,报验证委员会审核,由生产负责人和质量负责人批准后,验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件,按制定的方案进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合,按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查;若不符合,重新建立制订检验方法和检验条件,再进行验证,直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株

铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 黑曲霉[CMCC(F)98 003] 白色念珠菌[CMCC(F)98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中,于30~35℃培养18~24小时。取上述培养物各1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液,备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中,于20~25℃培养2~3天。取上述培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液,备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上,于20~25℃培养5~7天,加入含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液,将孢子洗脱。然后,用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内,用含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液,备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。分散力较差的供试品,可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用一稀释液将

微生物限度检查记录 版

表:微生物限度检查记录(通用) 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、麦康凯液体培养基(配制批号:)麦康凯琼脂培养基(配制批号:)

微生物限度检查记录 (30~35℃,3~5天) 20℃~25℃,5~7天) 沙氏葡萄糖琼脂培养基(配制批号:) 三、控制菌检查(30-35℃)

表: 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、麦康凯液体培养基(配制批号:)麦康凯琼脂培养基(配制批号:) (30℃~35℃) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、RV沙门增菌液体培养基(配制批号:),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号:)、三糖铁琼脂(配制批号:) 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、肠道菌增菌液体培养基(配制批号:),紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(配制批号:)

表: (含药材原粉的片剂) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、麦康凯液体培养基(配制批号: )麦康凯琼脂培养基(配制批号: ) (30℃~35℃) 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、RV 沙门增菌液体培养基(配制批号: ),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号: )、三糖铁琼脂(配制批号: ) 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号: )、肠道菌增菌液体培养基(配制批号: ),紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基(配制批号: )

表:微生物限度检查记录(蛇胆川贝液) 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基(配制批号:)、RV沙门增菌液体培养基(配制批号:),木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基(配制批号:)、三糖铁琼脂(配制批号:)

微生物限度检查办法验证方法

精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查,包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案,通过比较试验菌的恢复生长结果,来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计,所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL )、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG )等脱水培养基,按照相应的配制说明,用纯化水配制、分装后,在2小时内,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌15 min ,在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备:取在有效期内的试剂,按照相应的配制方法,配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(ml/ml )聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等,用纯化水配制,加热使溶,过滤,分装,在121℃,灭菌15 min ,在3周内使用。

4.4.2 试验菌的制备和稀释: 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液: 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液: 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组: 4.4.4.2.1 平皿法:分1:20的供试液1ml和试验菌液(含菌50~100CFU)1ml,注入同一直径90mm的灭菌平皿中,每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4

4.4.4.4.1 平皿法:取1:20供试液1ml,注入直径90mm的灭菌平皿中,每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组:若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时,需增加稀释剂对照组,以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率= 结果判定:在3次独立的平行试验中,稀释剂对照组的回收率应均不低于%。试 菌回收率低于70%,则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性,并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果:

制药企业微生物限度控制菌检查培养基适用性检查记录表式样

控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备(需要的菌种在□内划“√”): □(1)大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(2)金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(3)乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(4)铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; □(5)生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml,9ml0.9%无菌NaCl溶液,10倍递增稀释; 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法:取稀释后的菌液1ml(剩余的菌液冷藏保存),置直径90mm的无菌平皿中,注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基(细菌类别计数选用该培养基)或玫瑰红钠琼脂培养基(霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基),混匀,凝固,倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃~35℃;霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃~28℃。细菌类别培养3天,霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果:需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查

分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌。 检验标准:与对照培养基管比较,被检培养基管试验菌应生长良好。 结论: □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准:被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论: □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养,试验菌。 检验标准:试验菌应不得生长。 结论: □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中,在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准:被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论: 结论: 检验人:复核人:

微生物限度检查法应用指导原则

微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法(附录ⅪJ),特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定,也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定,及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中,如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂,在确定其能否适用于所检样品及其用量时,除应证明该试剂对所检样品的处理有效外,还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出(即无毒性),因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株,而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法,且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品,在供试品溶液性状允许的情况下,应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法(附录ⅪJ)收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌(细菌)检查用的供试液,规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时,供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小,转速等直接影响着样品中微生物的回收,易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此,供试液制备时尽量避免使用该方法,更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基,用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时,若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败,应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行,但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则,如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu,那么最高稀释级是1:10-3。

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查,包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案,通过比较试验菌的恢复生长结果,来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计,所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行,若因特殊原因确需变更时,应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围: 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件: 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求,由于某些供试品具有抗菌活性,在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时,可能影响检验结果的准确性,必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施: 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备:将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜(孔径0.22um、直径50mm)、平皿、空三角瓶、称量纸等,用牛皮纸包扎 好后,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌30 min,在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)等脱水培养基,按照相应的配制 说明,用纯化水配制、分装后,在2小时,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭 菌15 min,在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备:取在有效期的试剂,按照 相应的配制方法,配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、

无菌检查和微生物限度检查操作规范

无菌检查和微生物限度检查操作规范 (中国药品生物制品检定所) 一、无菌室的要求: 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备,面积不小于6平米,高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁,不吸潮,无凸起,耐腐蚀,易清洗。无菌室内部应六面光滑,无缝隙,里面连接处应呈凹凸形,不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对,缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大,照明灯应镶嵌在天花板内,光照应分布均匀,光照度不低于300lux,电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯,每立方米2-2.5瓦,距实验台高度不超过1米,并应定期检查辐射强度,距1米处应不低于70微瓦/平方厘米,无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置,控制温度18-26℃,相对湿度40%-60%,操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压,不低于4.9帕。操作区洁净度100级,操作间洁净度10000级,洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物,如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面,开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度,常用的沉降菌测定方法为:取营养肉汤琼脂平板3个,置无菌室的操作区台面左、中、右位置上,开盖暴露30分钟,在30-35℃培养2天后,计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室,细菌总数应小于3个,浮游菌每立方米应小于5个,否则,不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备: 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基,加水溶化后,调节PH值,使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3,真菌培养基的PH值为6.2-6.6,分装、盖塞、灭菌,待用。 2、培养基灵敏度试验: 培养基是无菌试验的基准物质,关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度,因此,培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基,才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下:取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液,分别10倍递增稀释,制成每ml 含10-100个菌,并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天,每株菌接种的培养基不少于2管生长,则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查: (1)无菌检查:各种培养基在规定温度培养3天,应无菌生长。 (2)新鲜程度检查:需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5,否则,不能使用。应煮沸去氧,只限加热一次。 4、培养基的保存时限: 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏: 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕,在刻痕处过火焰数次,用无菌湿棉球炸裂后打开,然后,加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部,将菌种稀释、混匀,并吸出菌液,接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性,如无发现异常,即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法: 取复苏好的菌种一支,接种于规定的培养基数管,培养后,置冰箱中保藏。取出使用的菌种,经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变,菌种应尽量避免不必要的接种和传代。

微生物限度方法学验证

微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法(中国药典2015年版四部1105);控制菌检查法(中国药典2015年版四部1106);非无菌药品微生物限度标准(中国药典2015年版四部1107);抑菌效力检查法(中国药典2015年版四部1121)检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表1菌种

表2培养基

表3对照用培养基

表4试剂

稀释液: (1)pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml,摇匀,既得。 (2)0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml,过滤,分装、灭菌。 (3)0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml,用0.9%无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml,滤过,分装,灭菌,备用。 (4)靛基质试液

取对二甲氨基苯甲醛1.0g,加入95%乙醇95ml,充分振摇,使完全溶解后,取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,培养24小时;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上,培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上,培养7天,加入5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱,然后吸出孢子悬液(用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管)用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置,应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~ 100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用,若保存在2~8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证

2010年版药典微生物限度检查法

附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23℃~28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。 除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml),加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g,加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中,必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量,充分振摇,使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,振摇5~10分钟,萃取,静置使油水明显分层,取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2,剪碎,加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液),浸泡,振摇,作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g,加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml,置

微生物限度检查法验证方案模板

文件编号:SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司

1/11
验 证 文 件
目 录
1 2 3 4 5 6 7 8 9
适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表

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验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法,并对其有效性进行评价,确保试验方法的 完整性,保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分,文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点,按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中(6)制备供试 液。“细菌,霉菌,酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌,霉菌及酵母 菌的计数方法验证,控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间:************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点

微生物限度检查办法验证方法

微生物限度检查方法验证方案 1. 目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查,包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,特制定本验证方案,通过比较试验菌的恢复生长结果,来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性,以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计,所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行,若因特殊原因确需变更时,应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围: 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件: 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求,由于某些供试品具有抗菌活性,在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时,可能影响检验结果的准确性,必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施: 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备:将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜(孔径 0.22um、直径50mm)、平皿、空三角瓶、称量纸等,用牛皮纸包扎好后,放于湿热灭菌器中,在121℃,灭菌30 min,在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备:取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基(BL)、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)等脱水培养基,按照相应的配制说明,用纯化水配制、分装后,在 2 小时内,放于湿热灭 菌器中,在121℃,灭菌15 min,在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备:取在有效期内的试剂,按照相应的配制方法, 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%(ml/ml )聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等,用纯化水配制,加热使溶,过滤,分装,在121℃,灭菌15 min,在3

微生物限度检查法

微生物限度检查法 细菌及控制菌培养温度为30~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23~28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g或20ml(其中10g 或10ml用于阳性对照试验)。 检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。 常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1:10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 阴性(-)对照试验取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml,置无菌平皿中,注入培养基,凝固,倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板,均不得有菌生长。 阳性(+)对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查,对照菌(检测的控制菌)的加菌量为10~100cfu(加对应控制菌制成的溶液1ml)。阳性对照试验应检出相应的控制菌。 培养和计数除另有规定外,细菌培养3天,霉菌、酵母菌培养5天,逐日观察菌落生长情况,点计菌落数,必要时,可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

2015年版中国药典微生物限度检查方法验证的方案.doc

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审

1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊,产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105:微生物计数法,以及1106:控制菌检查法的规定,本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分,文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性,对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶,可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试,首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查;如常规倾注平皿法不适用,则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件,按制定的方法进行试验,根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性,对其有效性进行评价,保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊,进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草,由质量部审核,最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后,由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告,由质量部审核,最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后,,由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作,并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差,质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表

微生物限度检查法

微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作,防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时,如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂,应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外,本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃~35℃;霉菌、酵母菌培养温度为23℃~28℃。检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10c㎡为单位报告,特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml 或c㎡)。 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml;膜剂为100c㎡;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品,其检验量应增加20g 或20ml (其中10g或者10ml 用于阳性对照试验)。 检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4丸,膜剂还不得少于4 片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3 倍量供试品。 供试液的制备 供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时。 除另有规定外,常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,混匀,作为1∶10 的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80 使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g,加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,用匀浆仪或其他适宜的方法,混匀,作为1∶10 的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80,并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品

微生物限度检查方法适用性验证方案

word格式文档 微生物限度检查方法适用性试验方案

验证方案组织与实施 微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织,质量管理部门有关人员组成验证小组,参与实施。 方案起草 方案审核 方案批准

目录 一、概述 二、验证目的和风险评估 三、验证内容 四、方法判定 五、再验证周期 六、参考文献 七、结果评价及结论

1、概述: 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时,应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验,以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。 依照中国药典2015版,需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估: 验证目的:确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。 风险评估: 3、验证内容: 3.1、培养基来源: 确认人:确认日期: 3.2、检查用培养基配制方法:

确认人:确认日期:3.3、使用仪器 确认人: 确认日期:3.4、验证试验用菌种: 确认人:确认日期: 3.5试验方法:

取供试品10 ml加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。 3.6菌液的制备: 3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵,加入胰酪大豆胨液体培养基中置30~35℃培养箱中培养18~24h,取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中,制成10-1 的菌液,依法10倍稀释至10~7,分取各菌悬液1ml注入平皿中,立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法培养计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.6.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物,加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20~25℃培养箱中培养24~48h,取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中,制成10-1 的菌液,依法10倍稀释至10~7,取菌悬液1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法培养计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.6.3取黑曲霉的新鲜培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上,20-25℃培养5-7天,加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中,制成10-1的菌液,依法10倍稀释至10~7,取,取菌悬液1ml注入平皿中,立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml,各菌悬液平行制备两个平皿,平皿法培养计数,取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。 3.7需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验: 3.7.1供试液制备: 取供试品10 ml,加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。 3.7.2实验条件: 需氧菌培养温度:30~35℃ 3~5天培养箱: 霉菌和酵母菌培养温度:20~25℃ 5~7天培养箱: 3.7.3试验方法: 3.7.3.1试验组: 3.7.3.1.1分别取供试液9.9ml,分别加入0.1ml浓度为1000CFU的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌,混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml,置30~35℃或培养箱中培养不超过3天,计数,每株试验菌平行制备2个平皿。 3.7.3.1.2分别取供试液9.9ml,分别加入0.1ml浓度为1000CFU白色念珠菌、黑曲霉菌液,混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml,置30~35℃或培养箱中培养不超过

微生物限度检查方法验证方案样本

微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查, 包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查, 特制定本验证方案, 经过比较试验菌的恢复生长结果, 来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性, 以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计, 所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行, 若因特殊原因确需变更时, 应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围: 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件: 根据《中国药典》二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求, 由于某些供试品具有抗菌活性, 在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时, 可能影响检验结果的准确性, 必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施: 4.4.1 试验前的准备:

4.4.1.1 试验用具的准备: 将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜( 孔径0.22um、直径50mm) 、平皿、空三角瓶、称量纸等, 用牛皮纸包扎好后, 放于湿热灭菌器中, 在121℃, 灭菌30 min, 在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备: 取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基( BL) 、改良马丁琼脂培养基、 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基( MUG) 等脱水培养基, 按照相应的配制说明, 用纯化水配制、分装后, 在2小时内, 放于湿热灭菌器中, 在121℃, 灭菌15 min, 在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备: 取在有效期内的试剂, 按照相应的配制方法, 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、 0.9%无菌氯化钠溶液、 0.05%( ml/ml) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等, 用纯化水配制, 加热使溶, 过滤, 分装, 在121℃, 灭菌15 min, 在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释: 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液: 4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中, 在30~35℃培养18~24小时; 取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中, 在23~28℃培养24~48小时; 取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上, 23~28℃培养5~7天。

微生物限度检查法标准操作规程

目的建立微生物限度检查法标准操作规程,规操作,保证结果的准确性。 围成品、辅料、包装袋及纯化水的检验。 责任微生物限度检验人员 容本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105非无菌产品微生物限度检查:微生物计数法》和《通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验,以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备 4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋),并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验。

4.2菌液制备按规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物,用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液;取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置,应在2小时使用;若保存在2-8℃,可在24小时使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃,在验证过的贮存期使用。 4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。 4.4培养基适用性检查按照表规定,接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下

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