16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程

16SrDNA 鉴定菌株的标准操作规程

1. 适用范围

本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA 片段进行PCR 扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。

本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。

2. 方法和原理

16SrDNA 鉴定是指用利用细菌16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、 DNA 测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。

细菌rRNA （核糖体RNA ）按沉降系数分为3种，分别为5S 、16S 和23S rRNA 。 16S rDNA 是细菌染色体上编码16S rRNA 相对应的DNA 序列。16S rDNA 由于大小适中，约1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。

在16S

rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S

rDNA 片段扩增出来，禾U 用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。

16SrDNA 序列的前500bp 序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500bp 序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前 500bp 无法鉴别的情况，需要进行16SrD NA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA 的序列信息。

由于测序仪一次反应最多只能测出700bp 的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA 全长序列分成3部分进行测序。

357F ------------------------------------------- ?

----------------------------------------- 1115R

926F ----------------------------------- ?

斗 1492R

3对引物正反向测通后，拼接成1500bp 左右的16SrDNA 序列。

3. 设备和材料

3.1

器材

移液器(lOOO^L 200卩 L

、1001、10uD ；涡旋振荡器；Eppendof

16SrDNA

519R

27F

■

MixMate ;离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000;基因分析仪：AB3500、AB3130

3.2试剂

DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra ;琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10>Taq Buffer(Mg2+), dNTPs, ddH2O等；ExoSAP-IT;测序试剂：BigDye Terminator, 5XSequencing Buffer； BigDye XTerminator Purification Kit ；3.3耗材

移液器吸头：1000 卩、200 卩、10 卩、离心管：1.5mL、200 ^L； Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate； Micro Amp TM Optical Adhesive Film ；

3.4引物

4.操作流程

核酸提取基因扩增一＞产物纯化一浄测序反应一为序列比对

5.实验方法

5.1核酸提取：

挑取单菌落，然后置于装有100pLPrepMan

Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100C水浴10mi n后，以离心机最大转速离心3min，取10卩上清液与490卩、

ddH2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。提取的DNA于- 20 T保存。

5.2基因扩增

5.2.1 PCR反应体系

板使用量。PCR反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却3~5min，最后放于PCR仪

上进行反应，这种冷启动法可增强PCR扩增的特异性。

522 PCR反应条件

94 C： 10mi n

94 C： 30s '

58 C： 30s 卜30Cyc

72 C： 45s J

72 C： 5min

4C：g

5.2.3电泳

称取1g琼脂糖置于100mL TAE电泳缓冲液中，加热融化，待温度降至 60 C 左右时，均匀铺板，制成 1%的琼脂糖凝胶。PCR反应结束后，加样，以100V电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录实验结果。

5.3产物纯化

5.3.1每5卩LPC产物加入2卩L ExoSAPT试剂，混匀。

5.3.2放入PCR仪中，37C温育 15min, 80C温育 15min。

5.3.3纯化后的PCR产物做为下一步测序反应的模板。

5.4测序反应

5.4.1测序反应体系

5.4.2测序反应条件

96C： 2min

96C： 30s 1 1

55C： 15s ；30Cyc

60C： 4min

4C：g

3 / 9

543 测序反应纯化(BigDye XTerminator Purification Kit)

543.1 每管加入 27 ^LSAM Solution 和 6 ^LBigDye XTerminator Solution。

543.2放在 Eppendorf MixMate 上 2000rpm 震荡 30min。

5.4.3.3在离心机上以1000X g离心2min。

543.4每管吸取10^L上清液于96孔板中，放入测序仪中测序。

5.5序列比对

基因测序仪得到的测序结果，在 MicroSEQ微生物鉴定系统中进行比对，得到菌种的种属信息。

6.关键说明

6.1提取细菌基因组DNA时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑取一菌

环菌株，置于100 yL ddH2O

中，混匀，沸水热变性10min后，离心3min分离，稀释50咅后做为PC R

模板。必要时做梯度PCR确认最佳的模板量。

6.2PCR及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系应在冰中配置；然

后置于低温冰箱中冷却3~5min,最后放于PCR仪上进行反应，这种冷启动

法可增强PCR扩增的特异性。

6.316SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特

异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500b

p序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴

别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的

16SrDNA的序列信息。具体参照附录。

PCR出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调

换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93 C变性，65 C左右退火与延伸)。

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过

多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。

用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。

10ul 体系100ngDNA

附录

（资料性附录）1.细菌16SrDNA三部分的PCR结果电泳图

M 1 —2 3

2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100bp

M: DL2000 ;

1:引物27F和519R的PCR产物（第1部分500bp）

2:引物357F和1115R的PCR产物（第2部分750bp）

3:引物926F和1492R的PCR产物（第3部分560bp ）

2.细菌16SrDNA鉴定结果

2.1 16SrDNA前500bp即可反映细菌的种属信息:

菌株TL140924的鉴定结果

2.2 16SrDNA 前500bp 不足以反映细菌的种属信息:

菌株70528的鉴定结果

-￡9 M

CM E CM CM

—J * ULI — U 6

浮

隸弄卑 6

尊

C o n a e n

L e n g t h

昏

导

寻

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Z CM 0 Z f T s

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l A r a r y E n t y N a m e

创呃e f e e n t e (c a e n r g r i c 3*

(A T C C =13312)

S a k n o n e f e e n t e r i c a e n t a r c a * {A T C C =13076)

S a l i ^x 血 ^t i ：A 的悒 f i c A ^A T C C =1W 30)

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二

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二

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2.3 16SrDNA 的全序列信息：

菌株70528的鉴定结果

如附录2.2、2.3所示，当待测菌株的16SrDNA前500bp序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其 16SrDNA全长序列以将其区分