子宫上皮肿瘤细胞能量代谢重编程及其临床意义

子宫上皮肿瘤细胞能量代谢重编程及其临床意义

温鑫

【摘要】在致癌因素的作用下，子宫上皮细胞稳态失调，出现能量代谢重编程。子宫上皮细胞代谢出现瓦博格氏效应，导致细胞内低氧和还原态微环境，激活氧感受器和缺氧信号传导通路，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子和第二信使-活性氧族活性增高，改变细胞色素等细胞蛋白的极性量值，使位居蛋白疏水核中的还原态铁原卟啉自由体（FH）析出。FH干扰细胞的微环境，催生多种自由基，引起细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等的氧化损伤，使子宫上皮细胞周期中的DNA损伤检查点失去阻滞作用，引起染色体端粒附近DNA序列丢失以及染色体的重排和基因扩增，细胞发生恶变。这种子宫上皮细胞能量代谢重编程，导致宫颈渗液中FH物质含量增加，FH析出量与子宫上皮细胞癌变程度呈正相关。测定宫颈渗液中FH物质含量，即可显示细胞是否稳定，是否存有细胞癌变及其程度。因此，FH 物质检测技术可以应用于子宫癌筛查和诊断领域。

【关键词】瓦博格氏效应；肿瘤细胞能量代谢；细胞周期；低氧诱导因子；活性氧族；p53基因；还原态铁原卟啉自由体；

充足的营养和能量供应是肿瘤细胞得以无限增殖、浸润和转

移的基础和前提。肿瘤细胞的葡萄糖、氨基酸和脂肪代谢都与正常细胞不同,存在着能量代谢重编程，ATP生成受阻。

细胞代谢依赖ATP提供能量。细胞产生ATP的方式主要有两种, 糖酵解（glycolysis）和氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）。糖酵解是指在细胞质中分解葡萄糖生成丙酮酸（pyruvate）的过程, 此过程仅产生2个ATP。正常细胞从糖酵解中获取大约20%~30%自身代谢所需的能量。在有氧条件下, 丙酮酸被转运至线粒体内进一步氧化分解生成乙酰CoA进入三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）, 经氧化磷酸化完全分解成水和二氧化碳并产生ATP （此过程可产生36个ATP）和NADPH。这一过程提供了细胞代谢所需能量的70%。在有氧的情况下，有氧氧化过程对糖酵解产生抑制，称为Pasteur效应。诺贝尔奖获得者德国生物化学家奥托.海因里希.瓦博格（Otto Heinnich Warburg ）发现肿瘤细胞主要通过有氧糖酵解、磷酸戊糖途径产能，使肿瘤细胞的耗糖速度是正常细胞的10倍，却仅产生1/10的能量。即便在有氧情况下有氧氧化过程也不能对糖酵解产生抑制，这称为瓦博格氏效应（Warburg effect）【1-2】。

磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway）是指从6磷酸葡萄糖（G-6-P）脱氢反应开始，经一系列代谢反应生成磷酸戊糖等中间代谢物，然后再重新进入糖氧化分解代谢途径的一条旁路

代谢途径。该旁路途径的起始物是G-6-P，返回的代谢产物是3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖，其重要的中间代谢产物是5-磷酸核糖和还原态尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，即还原性辅酶Ⅱ（NADPH）。整个代谢途径在细胞液中进行。关键酶是6-磷酸葡萄糖脱氢酶。磷酸戊糖途径的主要特点是葡萄糖直接氧化脱氢和脱羧，不经过糖酵解和三羧酸循环，脱氢酶的辅酶不是氧化态尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）而是氧化态尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，产生的NADPH作为还原力供生物合成之用，而不是传递给O2，无ATP的产生和消耗。

【总反应式】

3 G-6-P+6NADP+ →3 CO2+6 NADPH +2 F-6-P

+3-P-甘油醛

中国科学技术大学生命科学学院吴缅教授和美国宾夕法尼亚大学医学院杨小鲁教授的合作研究结果“p53 regulates biosynthesis through direct inactivation of glucose-6-phosphate dehydrogenase”【3】显示，这种代谢异常与抑癌基因p53等突变有关。p53基因是人类肿瘤中突变率最高的基因。它因编码是一种分子质量为53 kDa的蛋白质而得名，是一种抑癌基因。其表达产物为基因调节蛋白（p53蛋白）。当DNA受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦p53基因发生突变，p53蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变。

吴缅教授等研究发现：在正常状态下，阻抑蛋白p53与磷酸

戊糖途径上第一步反应的关键酶“葡萄糖-6-磷酸脱氢酶”相结合，抑制它的活性，阻止磷酸戊糖旁路的进行。细胞中的葡萄糖主要通过三羧酸循环途径代谢，产生细胞生长所需的大量能量。但在p53发生突变或缺失的肿瘤细胞中，失去了p53与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶结合能力和对该酶的抑制，大量的葡萄糖通过磷酸戊糖途径代谢，产生大量NADPH，只能进行大量的生物合成，使肿瘤细胞快速、无限生长。

NADPH在人体内的化学反应中起递氢体的作用，作为GSH 还原酶的辅酶，它可以使氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原成为还原型谷胱甘肽（GSH）,使肿瘤细胞内GSH含量增高。谷胱甘肽过氧化物酶以还原型谷胱甘肽(GSH)作为供氢体来分解H2O2，生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使细胞内GSH:GSSG的比率下降。形成肿瘤细胞的低氧和还原态微环境。细胞内环境的改变激活氧感受器和缺氧信号传导通路。细胞内氧化型/还原型谷胱甘肽(GSSG/GSH)的改变作用于氧感受器分子，使其构象发生改变，导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，促使缺氧特异性转录因子-低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor；HIF）HIF-1a的磷酸化并与HIF-1b结合而形成一个完整的HIF-1转录复合体。HIF-1转录复合体对糖代谢基因的调控是肿瘤能量代谢重编程的重要机制之一，它对肿瘤细胞糖代谢进行调控，对谷氨酸替代途径调节，与相应靶基因上的缺氧反应元件（HRE）结合，促进基因的表达.并通过第二信使-活性氧族（ROS）与激酶系统发生联

系并激活该激酶系统【4】。

谷胱甘肽过氧化物酶使细胞内GSH:GSSG的比率下降。H2O2与细胞内的铁离子作用，通过Feton反应，产生OH·。OH·和GSSG都可与蛋白质分子上的巯基相互作用，影响蛋白质构象。Semenza GL等【5】最早提出细胞氧感受器是含FH的蛋白。低氧时H2O2浓度下降，使OH·的浓度随之下降，同时使GSH的浓度升高，导致蛋白质的巯基由氧化型向还原型转变，使一些转录因子（如HIF-1）的构象发生改变，激活其结合DNA的活性，促进低氧敏感基因EPO的转录表达。过氧化氢酶催化H2O2过程中可间接激活鸟苷酸环化酶（soluble guanylate cyclase，sGC），增加cGMP（鸟嘌呤核糖苷-3',5'-环磷酸酯）的水平。而cGMP 抑制低氧敏感基因的表达。低氧时H2O2浓度下降，使这条信号途径的活性降低。

Guhaniyngi等【6】（2001）提出，在氧含量正常的条件下，由NAD（P）H所脱下的电子迅速传递给氧分子，产生超氧阴离子，这在细胞浆中造成了一种相对高的氧化状态。超氧阴离子歧化生成过氧化氢，最终导致活性氧（ROS）的增加，在结合铁离子的部位容易引起feton反应（人体内的过氧化物与低Fe反应生成氧自由基的反应)，诱导调节蛋白的位置专一性氧化【7】。在低氧条件下，氧含量的减少将引起这一系统氧转运率的降低，由此降低了ROS的产生速率，导致细胞内环境处于一个低氧和相对还原性的状态。低氧时血红素氧合酶及一氧化氮合成酶（NOS）

活性受到抑制，使内源性CO及NO产生量下降，调控cGMP的产生下降，从而对低氧敏感基因EPO的抑制作用减弱。

缺氧可使线粒体出现线粒体单价电子渗漏（univalent leak）；胞内Ca2+超载，触发线粒体摄取Ca2+并使Ca2+在线粒体内积聚；抑制线粒体内脱氢酶的功能；以上改变可使线粒体肿胀、嵴断裂崩解、钙盐沉积、外膜破裂和基质外溢。线粒体损伤导致含还原态铁原卟啉自由体（FH）的蛋白，诸如细胞色素、氧感受器、FixL跨膜蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）、NAD（P）H氧化酶、鸟氨酸氧化酶（guanylatc cyclase,GC）和一氧化氮合成酶（nityic oxide syathase,NOS）等外溢、游离、构象改变【8】。

FH位于上述细胞蛋白的肽链靠近表面的一个疏水核内，它主要依靠Fe2+与F8His的咪唑氮配位而挂在Pr链上【9】。但是它之所以能固定在蛋白质的固定位置上而且取向一定，主要是因为还有大约21个残基逼近FH，距离在4A°之内，这些残基中有60多处与FH比较靠近，可以发生极性与非极性的相互作用，足以保持FH在细胞蛋白中的位置。FH的极性部分丙酸基侧链伸向亲水的表面，在生理pH下解离成负离子，在α链中，有一个丙酸基与CD3His相连；在β链中，FH的两个丙酸基分别与CD3Ser和

E10Lys相连。FH与肽链之间的静电引力对于维持FH在细胞蛋白中的位置有很大作用。第二信使-ROS与激酶系统使一种亲脂性物质（Hydrophilic fatty molecules）进入细胞蛋白疏水核内，它

所带的负电荷中和了肽链上His、Lys所带的正电荷，使它们不再与FH丙酸基侧链保持静电吸引，从而使FH在细胞蛋白中析出。

还有的学者认为【10】亲脂性物质进入细胞蛋白疏水核，与FH 中心的Fe2+通过Fenton反应产生．OH，．OH具有极高的氧化还原势，反应力极强，几乎可以和生物细胞内所有类型的分子以109～1011mol-1 ．s-1的反应速率（相当于几个飞秒，1飞秒只有1秒的一千万亿分之一）作用。但它寿命短暂，因而最靠近．OH 的部位受到攻击的可到性也最大，同Fe2+络合的FH卟啉环由于在空间位置上的态势，首先受到．OH的攻击，共价键断裂，其结构遭到不可逆转的破坏，FH析出。

FH物质是还原态铁原卟啉自由体（Free body of Iron protoporphyrin reduced state ）的简称，它广泛存在于人体的每个细胞内，FH与不同蛋白质结合具有不同的生理功能。它在线粒体内存在最多。研究发现：FH物质是一种对细胞具有氧化损伤作用的活性基团，它干扰细胞增殖周期，破坏细胞的稳定性，使细胞增殖加速、凋亡减少，分化降低。

细胞的增殖（cell proliferation）、分化（cell differetiation）和凋亡（cell apoptosis）始终贯穿于生命的全过程，它们相互伴随，相互关联，既受细胞外信号的影响，又依靠细胞内的级联反应进行调控，使细胞的增殖、分化或凋亡有序地进行，这就是机体的稳态调节（steady-state adjust ）。细胞始终处于增殖和死亡的动态平衡中，不断地增殖以补充衰老脱落或死亡的细胞，这种更新

称为稳态更新（steady-state renewing）【11】。

正常状态下，通过细胞增殖增加细胞的数量，通过细胞分化形成特定形态、结构和生理功能的子代细胞；通过细胞凋亡参与胚胎的发育和形态的造就，清除体内无能的、有害的、突变的或受损的细胞，以保证细胞的数量和质量。细胞的增殖、分化和凋亡始终贯穿于生命的全过程，它们相互伴随，相互关联，在机体的稳态调节中发挥重要的作用。它们即受细胞外信号的影响，又依靠细胞内的级联反应进行调控，使细胞的增殖、分化或凋亡有序的进行。如果其中的任一环节发生障碍，可使机体内特定的细胞、组织和器官的结构、功能和代谢异常，导致疾病的发生【12】。

细胞增殖周期分为四个阶段：G1期（first gat phase，DAN合成前期）、S期（synthetic phase，DNA合成期）、G2期（second gap phase，DNA合成后期）和M期（mitotic phase，有丝分裂期）。其中最关键的是S期，此期细胞进行DNA倍增和染色体复制。

细胞周期有如下特点：（1）单向性：细胞只能沿着G1 、S 、G2 、M方向推进而不能逆行。（2）阶段性：各期细胞形态和代谢特点有明显差异。（3）在各期交叉处存在着检查点（checkpoint），包括DNA损伤检查点（DNA damage checkpoint）、DNA复制检查点（DNA replication checkpoint）和纺锤体组装检查点（spindle assembly checkpoint）。（4）细胞周期是否顺利推进与细胞微环境密切相关【11】。细胞周期的主要检查点是DNA损伤检查点，分别位于G1/S和G2/M交界处。当它探测到DNA损

伤包括基因组或纺锤体损伤时，就会打断细胞周期进程。正是在检查点的正确调控下，确保细胞周期精确和有序地进行【12】。

P53基因是人类肿瘤中突变率最高的基因。在G1/S交界处，P53作为一个DNA损伤检查分子，能保证细胞在DNA损伤后，停顿于G1期，以使DNA在复制前有充分的时间对DNA进行修复。如果DNA损伤修复失败，P53则过度表达，通过直接激活bax凋亡基因或下调bcl-2抗凋亡基因表达而诱导凋亡。这样可以消除癌前病变细胞不恰当地进入S期，否则促进癌症的发生和发展。正常中心粒的复制开始于G1/S转变期。P53缺失时，通过FH的氧化损伤作用，使一个细胞周期可产生多个中心粒，最终导致有丝分裂时染色体分离异常，又导致染色体数目和DNA 倍数改变，细胞进一步逃避免疫监视而演变成恶性肿瘤细胞，同时可见肿瘤侵袭性和转移性的增加。DNA双链断裂还可在G2/M 转变期激活DNA损伤检查点，阻止细胞进入有丝分裂，以增加修复时间和诱导修复基因转录，完成DNA断裂损伤的修复。FH 物质使G2/M检查点失去阻滞作用，引起染色体端粒附近DNA 序列丢失以及染色体的重排和基因扩增。

P53缺失，FH物质析出，FH催生羟自由基、氧自由基、亚硝基自由基等多种自由基，引起细胞膜脂质、脂蛋白、细胞骨架、DNA等的氧化损伤，干扰细胞的微环境，干扰细胞周期，使组织细胞发生恶变。细胞增殖过度还与周期素D（cyclinD, bcl-1）过量表达有关。bcl-1是一种生长因子感受器，可导致基因扩增、

染色体倒位或易位。另外，细胞增殖过度还与周期素依赖性蛋白激酶（cyclin dependent kinase ，CDK）增多、CDK抑制因子（cyclin dependent kinase inhibitor,CDI）表达不足和突变有关【13】。bcl-2是第一个被确认有抗凋亡作用的基因。主要通过抗氧化、抑制线粒体释放凋亡诱导因子（AIF）、抑制凋亡蛋白酶（caspases）的激活等发挥细胞抗凋亡作用。另外，p53突变失去促进细胞凋亡的作用，反之驱动细胞周期。由于凋亡不足使肿瘤发生、发展和转移。

除了细胞的无限增殖和凋亡不足之外，FH还使细胞表面特征改变，细胞骨架紊乱，核质比显著高于正常细胞（可达1:1），出现巨核、双核或多核，染色体呈非整倍性（aneuploidy），线粒体肿胀增生、呈多形性等。细胞的增殖和分化脱耦联导致细胞异常分化：（1 ）低分化：表现为形态上的幼稚性，失去正常排列极性和细胞功能异常；（2 ）去分化或反分化：表现为表型返回到原始的胚胎细胞表型；（3 ）趋异性分化：主要表现为肿瘤细胞分化程度和分化方向的差异性。

FH物质在肿瘤的演进中扮演重要角色，表现于肿瘤细胞永生化、基因组不稳定性、肿瘤血管生成、肿瘤细胞能量代谢、肿瘤自分泌生长因子信号转导、肿瘤侵袭转移以及肿瘤耐药等各层面。细胞癌变经历细胞过度增生、细胞异样增生、癌前病变、原位癌、浸润癌几个阶段。随着细胞的上述演变，细胞膜损伤（膜通透性增强、流动性下降和受体功能障碍）愈重，溶酶体内蛋白

水解酶溢出引起细胞自溶愈重，加之瓦博格氏效应愈加明显，FH 物质渗出愈多。

如上所述：恶性肿瘤细胞能量代谢重编程，导致局部组织渗液中FH物质含量增加，在细胞自稳调节失调早期即可出现，且随着细胞癌变程度的加剧而增多。FH析出量与细胞癌变程度呈正相关。测定局部组织渗液中FH物质含量，即可显示该组织细胞是否稳定，是否存有细胞癌变及其程度。因此，FH物质检测技术可以应用于肿瘤筛查和诊断领域。当前，临床袭用的无创手段可以采集到宫颈、直肠、鼻咽部、支气管肺和前列腺等器官的组织渗液，检测其内含有的FH物质，分别用于子宫癌、直肠癌、鼻咽癌、肺癌和前列腺癌的筛查和诊断。

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