细胞培养规格及接种密度

牛血清在细胞培养中的作用与质量要求

牛血清在细胞培养中的作用与质量要求

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牛血清在细胞培养中的作用与质量要求生物技术已经被世界各国视为一种高技术,在整个科学技术中占据了特殊的显著地位,特别是生命科学的发展更离不生物技术,生命科学的发展备受各国的重视。我国在很多大学中都设立了生命科学院。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术,而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系,特别是在医药领域的发展,细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养,杂交瘤单克隆抗体,完全是通过细胞培养来实现的,既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现,发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。总之,细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。细胞培养的发展,培养基的质量又是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用。在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的,所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一。保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节。? 一、牛血清在细胞培养基中的主要功能 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。?1.提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营 2. 提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物养物。? 质活力。 3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。? 4.是细胞贴壁、铺展在塑 5.起酸碱度缓冲液作用。? 6.提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时料培养基质上所需因子来源。? 使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。 二、牛血清的主要成份 血清是一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知,但还有一部分尚不清楚,而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。?1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白,球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着; α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着;转铁蛋白 能结合铁离子,减少其毒性和被细胞利用。?2.多肽:血小板促生长因子能促细胞分裂,是多肽家庭的主要成员之一,是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因

细胞培养基质量标准及检验方法

细胞培养基质量标准及检验方法 中国医药生物技术协会 二0一一年四月

编写说明 一、根据中国医药生物技术协会2010年9月20日组织召开的《动物细胞培养基生产管 理及质量控制学术研讨会》纪要,结合我国的实际情况制定本标准。 二、本标准以《中国药典》2010版和《哺乳类动物细胞培养基》(HG/T 3935-2007)行业 标准为依据,结合生物制品对细胞培养基原材料的特殊要求制定,增加了牛血清白蛋白残留量、抗生素残留量等检测项目。 三、本标准分为细胞培养基检验项目和每个项目的检验方法两部分,为评判细胞培养基产 品质量提供了依据和方法,从而规范我国细胞培养基行业健康发展。 四、结果评定 依据本标准和方法对细胞培养基样品进行全项检验,所有项目均符合标准要求,判定该样品为合格;若有一项不符合标准要求,则判定样品为不合格。

细胞培养基质量标准及检验方法一、细胞培养基质量标准 细胞培养基质量应符合表1所示的技术要求。 表1 技术要求

二、检验方法 除非另有说明,检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。澄清度的测定 称取每升标示量的实验室样品,置于1 000ml烧杯中,加水950ml,搅拌至溶解,补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。 pH值的测定 称取每升标示量的实验室样品,置于1 000ml烧杯中,加水950ml,搅拌至溶解,补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤA进行。 干燥减量的测定 按中华人民共和国药典2010年版三部附录Ⅶ L 干燥失重测定法进行。 渗透压的测定 称取每升标示量的实验室样品,置于1 000ml烧杯中,加水950ml,搅拌至溶解,补加水至1000ml, 搅拌均匀。按中华人民共和国药典2010年版三部附录ⅤH渗透压摩尔浓度测定法进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果,两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5%。 细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典2010年版三部附录Ⅻ E 细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。 微生物限度的测定 按中华人民共和国药典2010年三部附录Ⅻ G微生物限度检查法进行,检查项目为细菌数、霉菌数。检查法采用平皿法。 细胞生长试验 贴壁型细胞生长试验 方法提要

细胞培养基种类

细胞培养基的选择及常用数据库 日期:2012-04-13来源:未知作者:网友点击:次细胞实验技术 经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的,其中增加了组分的范围及 浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的,现在常用于 贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸,它可广泛应用于各种细 胞类型,包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆ Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的,现在也广泛应用于 克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用,得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的,现在已广泛应用于悬浮细胞 的培养。 以前经常听到有人问,这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单,也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库,那很简单,问供应商就行了。或者找到相关的文献,作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具,也很好用。选择你感兴趣的细胞类型,它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等,有时还有优化好的转染步骤,很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert,包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等,它还

微生物的高密度培养

微生物的高密度培养 定义一[1] 高密度培养指应用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度,使菌体密度较普通培养有显著的提高,最终提高特定产物的比生产率。单位:细胞干重/升(DCW/L)。凡是细胞密度比较高,以至接近其理论值的培养均可称为高密度培养,,一般认为其上限值为150~200g (DWC/L),下限值为20~30g(DCW/L)。 定义二[2] 细胞高密度培养(high cell density culture,HC-DC)是指在人工条件下模拟体内生长环境,使细胞在细胞生物反应器中高密度生长,使液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上,最终达到提高特定代谢产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量) 的目的,用于发酵生产生物制品的技术。 用途[1] 各种微生物(乳酸杆菌、芽孢杆菌、大肠杆菌等)的生产中,改进发酵工艺,提升其现代化发酵进程,增加单位体积培养液中菌体的数量,提高生产效率,加速微生物制剂的商品化进程。 发展状况[2] 细胞高密度培养不仅是生产高质量的浓缩型细胞和代谢产物的重要环节,是工程菌和非工程菌能否以低成本实现规模生产的关键性因素,也是细胞和代谢产物工业化生产过程中必需达到的重要目标与方向。随着市场需求的日益扩大,高密度培养技术广泛地应用于各种细胞( 植物、动物、微生物) 的生产中,它不仅可以改进发酵工艺,提升其现代化发酵进程,而且对于增加单位体积培养液中菌体数量,提高生产率,加速微生物制剂的商品化进程,更好地满足市场需求,具有重要而深远的意义。但是目前细胞高密度培养仍然是我国生物制品难以攻下的课题,只有对细胞高密度培养关键技术进行不断的研究、改进,科学系统地运用,才能对我国传统的生物制品生产技术进行升级和科技创新。 谷胱甘肽(GSH)的生产[3] 谷胱甘肽(GSH)是一种重要的生化药物,具有独特的抗氧化、抗衰老特性,近年来作为食品添加剂,其需求渐增。迄今国内尚未有工业化生产GSH的报道,为了打破进口品的垄断地位,迫切需要加大开发GSH的力度。本研究室[4~6]近来深入研究了影响面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产GSH的各种重要因素,目前仍在进行有关高菌种选育、发酵过程优化和产物提取的研究工作。构建具有高GSH合成活性的重组E.coli是近十年来GSH 生物合成研究中的一个新方向,其关键在于将分别编码GSHⅠ和GSHⅡ的基因gshⅠ和gshⅡ在宿主菌中高效表达。重组或非重组的S.cerevisiae相比,重组E.coli具有生长速度更快、产物提取更容易等优点。 Murata等[7,8]通过在细胞中扩增gshⅠ和gshⅡ成功地获得了具有较强GSH合成能力的重组E.coli,但没有深入研究高细胞密度培养技术。实际上,与其它胞内重组蛋白一样,GSH的体积生产率通常随着发酵液中的细胞密度增大而增加,故研究生产菌株的高密度培养方法,在保证GSH合成活性的前提下使反应器中工程菌的细胞密度尽可能高,不仅有利于提高生产率,也有利于后提取与纯化的进行。本文报道高密度培养重组大肠杆菌生产GSH的研究结果。 1 材料与方法 1.1 试剂 谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase)、还原型辅酶Ⅱ (NADPH)、5′-三磷酸腺苷( ATP)和DTNB (5, 5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid))均为Sigma公司产品。 GSH 和GSSG购自华美生物工程公司。酵母膏为Oxoid产品。葡萄糖购自无锡润生淀粉油脂公司。

细胞培养基种类与基本成分

细胞培养基种类与基本成分 是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。其具体的特征及应用如下: 1、BME细胞培养基 基础Eagle 培养基 (Basal Medium Eagle),1955 年Eagle 设计,BSS+ 12 种氨基酸+谷氨酰胺+ 8种维生素。简单、便于添加,适于各种传代细胞系和特殊研究用,在此基础上改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。 2、MEM细胞培养基 又称低限量Eagle 培养基 (Minimal Essential Medium) ,1959 年在Eagle's基础培养基 (BME )上修改而来,删去赖氨酸、生物素,氨基酸浓度增加,适合多种细胞单层生长,有可高压灭菌品种,是一种最基本、试用范围最广的培养基,但因其营养成分所限,针对生产之特定细胞培养与表达时,并不一定是使用效果最佳或者最经济的培养基。 3、DMEM细胞培养基 DMEM 是由Dulbecco 改良的Eagle 培养基, 起初是为小鼠成纤维细胞设计的。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L, 这就是大家常说的低糖和高糖了。 低糖适于依赖性贴壁细胞培养,特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。高糖更适合高密度悬浮细胞培养,也适用于附着性较差,但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养,也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。例如CHO细胞表达生产乙肝疫苗、CHO细胞表达EPO。 4、IMDM细胞培养基 Guilber 和Iscove 将Dulbecco' Medium 改良为Iscove's Medium,用于培养红细胞 和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES o并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM 还能够促进小鼠B淋巴细胞,LPS 刺激的

培养皿规格细胞计数

https://www.360docs.net/doc/7b6665208.html,/item.htm?id=131********&ad_id=&am_id=&cm_id=&pm_id= 培养器皿面积(cm2)培养液量(ml)细胞量 96 孔培养板0.32 0.1 105 24孔培养板 2 1.0 5×105 12孔培养板 4.5 2.0 106 6孔培养板9.6 2.5 2.5×106 3.5 cm 培养皿8 3.0 2×106 6 cm 培养皿21 5.0 5.2×106 10 cm 培养皿55 10.0 13.7×106 25cm2 培养瓶25 5.0 5×106 75cm2 培养瓶75 15~30 2×107 细胞计数(转载) 来源:苌生科的日志 实验原理:当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。 具体操作: 一、准备工作: 取一瓶传代的细胞,待长成单层后以备使用。 二、细胞悬液制备: 细胞悬液的制备方法是用0.25%的胰蛋白酶液消化、PBS液洗涤后,加入培养液(或Hanks液或PBS等平衡盐溶液),吹打制成待测细胞悬液。 三、细胞计数: 1.盖好盖玻片:取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 2.制备计数用的细胞悬液:用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中,加入5滴台盼蓝染液(0.4%)或苯胺黑,活细胞不会被染色,加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。 3.将细胞悬液滴入计数板:将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。 4.统计四个大格的细胞数:将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察,并移动计数板,当看到镜中出现计数方格后,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中没有被染液染上色的细胞数目。 5.计算原细胞悬液的细胞数L:按照下面公式计算细胞密度: (细胞悬液的细胞数)/ml=(四个大格子细胞数/4)×2×104 说明:公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液与染液是1:1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为1.0mm(长)×1.0mm(宽) ×0.1mm(高)=0.1mm3 而 1ml=1000mm3。 四、细胞计数要点: 1.进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中;

细胞培养基生产企业达标检查标准及实施细则

附件1: 细胞培养基生产企业达标检查标准及实施细则 (征求意见稿) 二0一0年十一月

编写说明 一、根据2010年9月20日《动物细胞培养基生产管理及质量控制学术研讨会纪要》,结合我国的实际情况制定本标准。 二、本标准以2010年新版《药品生产质量管理规范》为依据,结合生物制品对细胞培养基原材料的特殊要求制定。 三、本标准所涉及的生产企业应包括国内细胞培养基生产企业/分装厂及进口细胞培养基在国内的分装企业。 四、本标准共分质量管理、机构与人员、厂房与设施、设备、物料与产品、确认与验证、文件管理、生产管理、质量控制与质量保 证、委托生产与委托检验、产品发运与召回、自检等十二个部分,共158项,其中否决项目(△)16项,重要项目(*)74项,一般项目68项。 五、检查中发现不符合要求的项目统称为“缺陷项目”。其中,重要项目(*)不符合要求者称为“严重缺陷”,一般项目不符合要 求者称为“一般缺陷”,否决项目(△)不符合要求者称为“否决”。 六、在检查过程中,企业隐瞒有关情况或提供虚假材料的,按否决处理。检查组应调查取证并详细记录。 七、企业在申请达标检查时还应提交以下资料 1、企业营业执照(正本)复印件; 2、企业组织机构代码证复印件; 3、企业通过权威认证机构进行质量认证的审计报告和认证证书(如ISO9001证书)复印件; 4、企业组织机构图; 5、企业最近两年的产品清单(不足两年的企业提供所有生产的产品清单)。 八、结果评定 1、未发现“否决”,且“严重缺陷”≤10%,且“一般缺陷”≤20%,各类缺陷项目能够立即改正的,企业必须立即改正; 不能立即改正的,企业必须提供缺陷整改报告及整改计划,方可通过达标认证。 2、发现“否决”或“严重缺陷”>10%或“一般缺陷”>20%的,不予通过达标认证。

高密度细胞库建立和灌注培养

一种新的细胞扩大方法 使用高密度细胞库,一次性生物反应器和灌注技术 by Benjamin Wright, Mike Bruninghaus, Mike Vrabel, Jason Walther, Neha Shah, Seul-A Bae,Timothy Johnson, Jin Yin, Weichang Zhou, and Konstantin Konstantinov 一个典型的细胞培养过程从细胞解冻复苏开始,随后通过连续传代培养对细胞进行扩增,可选用的培养设备包括摇瓶、细胞培养转瓶、WAVE波浪袋生物反应器和机械搅拌生物反应器等(1)。当细胞培养体积和细胞密度达到预定标准时,细胞将转入到生物反应器中继续生长并表达产物。这种方法目前还面临着一些挑战。 摇瓶和转瓶是细胞放大培养初期使用的主要设备,这两种设备都需要在超净工作台中手动操作,这种情况下容易出现污染,而且易受操作者失误影响。此外,传统的细胞库保存细胞时,冻存管内细胞数量较少,细胞在放大过程中耗时较长。生产用生物反应器体积非常大,需要许多中间型号的培养设备来将种子细胞按比例放大,这将导致需要更长的放大培养时间,并使情况变得更加复杂。生物反应器接种活细胞密度通常低于× 106cell/mL,接种细胞后需要培养生长5-10天。在细胞生长期内,由于细胞密度达不到标准不能表达产物或产物含量低,这段时间不能产生实用价值。 有研究表明,建立高密度细胞库可以减少细胞放大的步骤并提高细胞放大成功率。Tao et al.等人建立了高密度细胞库,每冻存管中活细胞量达到× 108个,细胞复苏后直接接种到20L的WAVE 波浪袋生物反应器中(2)。这项研究表明,使用高密度细胞库可以减少中间摇瓶放大步骤并且节约9天的细胞扩大培养时间。Heidemann et al. 等人使用高密度细胞库配合几种不同大小的一次性生物反应器对细胞进行放大培养,减少了60–70%的培养时间(3)。 一次性生物反应器相比不锈钢生物反应器具有许多优点,例如灵活性大大增强,节省安装、清洗和灭菌时间,减少资本投资等(4-6).GE公司的一次性WAVE波浪生物反应器常常用于种子细胞的扩大培养,该种反应器可以大大减少污染风险(通常不需要在层流罩下工作),而且不需要安装、清洗和灭菌等操作(7)。 目前工业化生产中,细胞灌注培养越来越受到人们关注。一些公司已经成功的将细胞灌注培

细胞培养基的生产和过程控制

细胞培养基的生产和过程控制 细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一,其质量对生物制品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材料选用、生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品质量具有直接影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培养基产品的质量及安全性,选择合适的物料是实现细胞培养基功能过程中需要解决的基础问题。生产工艺的选择(如原料的研碎、混合技术等)及生产过程中的质量控制等直接影响产品的溶解性、批生产量及批次间差异,进而影响产品的质量。 cGMP稽查员在对国内细胞培养基生产企业进行cGMP审计时指出,细胞培养基的生产工艺及设备应经过验证,原材料必须做鉴别试验,记录应真实反映生产过程的实际情况,生产过程偏差处理应包括对出现偏差之前涉及到的批次均应进行调查等等。这些要求是基于FDA对生物制药用原料的质量要求方面提出,远远高于国内对药用原料的要求。随着对人用和动物保健用生物制品安全性要求的提高,严格执行GMP规范进行细胞培养基生产是国内细胞培养基行业发展的必然趋势。 1.1细胞培养基的原料选择及质量控制 1.1.2原材料的原料选择 由于动物细胞培养基产品属于药用原料,《哺乳类动物细胞培养基行业标准》对细胞培养基产品的微生物限度、内毒素含量进行了限定,所以细胞培养基所用原料宜采用注射级、药用级原料。对于部份没有注射级和药用级的原料,细胞培养基制造者针对自身产品质量要求,制定一些重要指标(微生物限度、内毒素、重金属等)进行原材料的质量控制。 1.1.2原材料的质量控制 细胞培养基生产企业建立完善的原材料质量标准,对于原材料的来源、检验、使用、及销毁等有明确的可追溯记录。在质量控制过程中,药用级原材料的质量标准应参考中国药典

细胞培养-培养基类型

常用培养基及基本特性 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞,杂交瘤细胞的培养,是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium(MEM) 也称最低必需培养基,它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单,可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型,而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、DMEM-高糖(标准型)是一种应用十分广泛的培养基,可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差,但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养,也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、DMEM-低糖(标准型)是一种应用十分广泛的培养基,可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养,特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂,含有多种微量元素,和DMEM以1:1结合,称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium),作为开发无血清

配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力,改良之一是在DMEM/F12(1:1)中加入15mMHEPES缓冲液。 6、McCoy’s 5A McCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计,可支持多种(如骨髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长,除适于一般的原代细胞培养外,主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 7、Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM) Guilber 和Iscove将Dulbecco’Medium 改良为Iscove’s Medium,用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞,LPS刺激的B细胞,骨髓造血细胞,T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液,因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。 8、M-199 Medium 1950年,Morgan成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液,即M-199,主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞,并能培养转染的细胞。

细胞培养常用培养基讲解学习

细胞培养常用培养基

细胞培养常用培养基 高博,苏州大学医学部药学院药理学系 1、R PMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞,杂交瘤细胞的培养,是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培 养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤 细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、M inimum Essential Medium (MEM) 也称最低必需培养基,它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单,可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha —般用于培养一些难培养细胞类型,而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、D MEM-高糖(标准型) 是一种应用十分广泛的培养基,可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差,但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养,也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、D MEM-低糖(标准型) 是一种应用十分广泛的培养基,可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养,特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。

5、D MEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂,含有多种 微量元素,和DMEM 以1:1结合,称为DMEM/F12培养基(DME/F12 medium),作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和 DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力,改良之一是在DMEM/F12 (1:1)中加入15 mM HEPES缓冲液。 6、M cCoy s 5A McCoy s 5A Medium主要为肉瘤细胞的培养所设计,可支持多种(如骨 髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长,除适于一般的原代细胞培养 外,主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长 支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。 7、Iscove ' s Modified Dulbecco Medium (IMDM) Guilber 和Iscove将Dulbecco ' Mediu改良为Iscove ' s Medium用于培养红 细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠 和HEPES。并用硝酸钾取代了硝酸铁。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞,LPS 刺激的B细胞,骨髓造血细胞,T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液,因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。

细胞培养基检验项目及检验方法 - 中国医药生物技术协会

附件2: 细胞培养基质量标准及检验方法 (征求意见稿) 二0一0年十一月

编写说明 一、根据中国医药生物技术协会2010年9月20日组织召开的《动物细胞培养基生产管 理及质量控制学术研讨会》纪要,结合我国的实际情况制定本标准。 二、本标准以《哺乳类动物细胞培养基》(HG/T 3935-2007)行业标准为依据,结合生物 制品对细胞培养基原材料的特殊要求制定,增加了细胞培养基安全性检测项目。 三、本标准分为细胞培养基检验项目和每个项目的检验方法两部分,为评判细胞培养基产 品质量提供了依据和方法,从而规范我国细胞培养基行业健康发展。 四、结果评定 依据本标准和方法对细胞培养基样品进行全项检验,所有项目均符合标准要求,判定该样品为合格;若有一项不符合标准要求,则判定样品为不合格。

细胞培养基质量标准及检验方法 一、细胞培养基质量标准 动物细胞培养基质量应符合表1所示的技术要求。 表1 技术要求 注:细胞生长试验应根据细胞培养基种类选择相应的检测用细胞。 二、检验方法 除非另有说明,检验中仅使用确认为分析纯的试剂和中华人民共和国药典2010年版中规定的纯化水。 2.1 澄清度的测定 称取每升标示量的实验室样品,置于1 000ml烧杯中,加水1 000ml,搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。 2.2 pH值的测定 称取每升标示量的实验室样品,置于1 000ml烧杯中,加水1 000ml,搅拌至溶解。按中华人民共和国药典2010年版附录Ⅵ H进行。 2.3 干燥减量的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅷ L 干燥失重测定法进行。 2.4 渗透压的测定

细胞培养 细胞传代培养

细胞传代培养 1. 细胞生长至高密度时,即须分殖至新的培养瓶中,一般稀释比例为1:3 至1:6,依细胞种类而异。 2. 材料: 2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010) 2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20 oC,使用前放在37 oC 水槽 回温。 2.3. 新鲜培养基 2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 3. 步骤: 3.1. 附着型胞(adherent cell) 3.1.1. 吸掉旧培养液。 3.1.2. 用D-PBS 洗涤细胞一至二次。 3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),37 oC 作用数分钟,于倒 立显微镜下观察,当细胞将要分离而呈现圆粒状时,吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA,则在trypsin-EDTA 作用后,加入适量含血清 之新鲜培养基终止trypsin 作用,离心后再吸掉上清液。) 3.1. 4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落,加入适量之新鲜培养基,以吸管上下吸放数 次以打散细胞团块,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常 培养条件培养。 3.2. 悬浮型细胞(suspension cell) 3.2.1. 吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。 3.2.2. 吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的 培养瓶中,以正常培养条件培养。 3.3. 融合瘤(hybridoma) 3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体,若是更换培养基,则可 能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基,直接添加新鲜培养基 稀释细胞浓度即可。若体积太大,可倾斜放置,或分殖至新培养瓶中。

常见的细胞培养方式

六、常见细胞的培养方式 1885年,W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽;1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养,标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。细胞培养是指从体内组织取出细胞膜,模拟体内生存环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。目前细胞培养方式主要 包括以下三种: 6.1 贴壁培养 贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞.此类需要相互依赖,需贴附于不起化学作用的物质(玻璃或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持,并最终在附着面生长至单层,铺满平面时便会发生接触抑制.大多数 动物细胞,包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型,他们需要附着于适量正电荷的 固体或半固体的表面胜仗。 6.2 悬浮培养 来源于血液、淋巴组织的细胞,及许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞,细胞为非贴壁依赖性细胞,无需支撑面,细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖.悬浮培养是大 规模细胞培养的理想方式,可采用类似于微生物的方法进行悬浮培养。 6.3 固定化培养 动物细胞较微生物脆弱,易受剪切力等的影响,而细胞固定化技术可较好的保护细胞免受机械力及环境变 化的影响,提高细胞的耐受力,促使细胞高密度培养,提高目的产物的产率。在传统的固定化酶技术中, 常采用戊二醛、聚丙烯酰胺、聚氨酯等作为固定化细胞载体。但在动物细胞培养中,一般使用较温和的固 定方法,如吸附、包埋、中空纤维或胶囊化等,具有剪切力低、传递效果好和抗污染能力强、细胞生长密 度高、产物易于收集和分离纯化等特点. 由于所培养的细胞的不同,固定化培养的方式也有不同,一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋,而 对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。 6.3.1 吸附 6.3.1.1 多孔陶瓷 KC.Biologicals公司开发了一种完全自动化的细胞培养系统。该系统的核心是陶质矩形蜂窝状生物反应器。反应器构型是一圆筒内装置有许多陶质矩形通道的蜂窝状圆柱体。通道长30cm,截面积是长方形,约为1mm2,壁厚0.12mm,可提供4.25m2 的生长表面积。这种结构的生物反应器,既可用于培养悬浮生长的细胞,又 可用于培养贴壁依赖性细胞。 6.3.1.2 微载体 传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得,操作繁复,且耗费空间及人力.1967年,VanWezel首次提出了“微载体”培养系统,经过几十年的研究改进,微载体培养技术现已广泛应用于动 物细胞的培养,是当前贴壁依赖型细胞大规模培养的主要方法,兼具有平板培养和悬浮培养的有点;能够 使得细胞处在相对均一的环境,温度、pH、CO2等均等得到很好的控制。较传统的单层细胞培养,大大增

细胞培养基本条件

细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基就是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一,培养基不仅提供细胞营养与促使细胞生长增殖的基础物质,而且还提供培养细胞生长与繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前,大多数合成培养基都需要添加血清。血清就是细胞培养液中最重要的成分之一,含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境与培养环境就是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物与有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,可导致细胞中毒死亡。因此,在体外培养细胞时,必须保持细胞生存环境无菌无毒,及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长,必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体就是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一,所需气体主要有氧气与二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分 细胞培养基的种类很多,按其来源分为合成培养基与天然培养基(目前使用的培养基绝大部分就是合成培养基),按其物质状态分为干粉培养基与液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌,液体培养基由专业商家提供,用户可直接使用,非常方便。 1、合成培养基的主要成分有:氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质: 氨基酸 氨基酸就是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异,但有几种氨基酸细胞自身不能合成,必须依靠培养液提供,这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺就是细胞合成核酸与蛋白质必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺时,细胞生长不良而死亡。因此,各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但就是,由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定,应置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时,还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物就是细胞生长主要能量来源,其中有的就是合成蛋白质与核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠与醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能就是帮助细胞维持渗透压平衡。此外,通过提供钠,钾与钙离子,帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压就是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ~320 mOsm/kg。标准培养液的渗透压在此范围内波动。特别注意:向培养液中加入其它物质有可能会明显改变培养液的渗透压,特别就是溶于强酸或强碱中的物质。向培养液中添加HEPES 时需按以下方法调节钠离子浓度。 缓冲系统

牛血清在细胞培养基中的主要功能

一、牛血清在细胞培养基中的主要功能 牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能。 1.提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物。 2. 提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力。 3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用。 4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。 5.起酸碱度缓冲液作用。 6.提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害。 二、牛血清的主要成份 血清是一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知,但还有一部分尚不清楚,而且血清组成及含量常 随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。 1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白,球蛋白。 纤维粘连素细胞促进细胞附着; α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着;转铁蛋白能结合铁离子,减少其毒性 和被细胞利用。 2.多肽:血小板促生长因子能促细胞分裂,是多肽家庭的主要成员之一,是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞 生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等,血清中含量虽很少,但对细胞生长也有一定作用。 3.激素:激素对细胞的作用是多方面的。 胰岛素:促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,与促细胞分裂有关。 类胰岛素生长因子:能与细胞表达的胰岛素受体结合,从而有胰岛素同样的作用。 促生长激素:促细胞增殖效应。 氢化可de松:血清中含有定量的该成分,它可能兼有促细胞贴附和增殖作用,但有人证明,血清中的氢化可de松 ,如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。 4其他成份

如何选择合适的细胞培养基

细胞培养是实验室里最常见和最基本的实验了,但却不是最简单的。别小看细胞培养,这里可蕴含着大学问。有时候细胞状态不好,转染、药筛这些实验根本就没办法做。影响细胞培养的因素很多,让我们先从培养基和血清说起。 经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、Thermo Fisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。 ◆ MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的,其中增加了组分的范围及浓度。 ◆ Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的,现在常用于贴壁细胞的培养。DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。最初的配方中葡萄糖含量为1000 mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500 mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了。 ◆ aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸,它可广泛应用于各种细胞类型,包括对营养成分要求苛刻的细胞。 ◆Ham’s F12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的,现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。F12还可以与DMEM等体积混合使用,得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。 ◆ RPMI 1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的,现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。 以前经常听到有人问,这种细胞该用哪一种培养基呢?其实这个问题的答案可以很简单,也可以好复杂。此话怎讲?如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库,那很简单,问供应商就行了。或者找到相关的文献,作为参考。Invitrogen网站上有一个Cell Line Database的工具,也很好用。选择你感兴趣的细胞类型,它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等,有时还有优化好的转染步骤,很方便。Sigma网站上也有一个Media Expert,包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等,它还是一个解决问题能手,对于细胞培养中的常见问题,如细胞贴壁不好、培养基变色等,它都会列出可能的原因,并提供补救办法。这个Expert果然不简单! 但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系,根本找不到任何参考,那你就得花点时间自己试验了。万事开头难嘛。因为没有一个标准答案。在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之,首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。你也可以购买几种培养基来,然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验,来选择其中最适合的。有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同,就算是同一种培养条件,细胞的生长状态也时

细胞培养皿规格

细胞培养皿规格 订货信息: 货号品名规格包装备注售价(元)是否现货订购10188细胞培养板6孔,孔直径 34.8mm,生长面积 9.5cm2 5只/包. 97.00现货10192细胞培养板12孔,孔直径 22.1mm,生长面积 3.8cm2 50只/箱. 1000.00现货10194细胞培养板24孔,孔直径 15.6mm,生长面积 1.9cm2 5只组. 110.00现货10196细胞培养板48孔,孔直径 10.2mm,生长面积 0.8cm2 100只/箱. 2400.00现货10198细胞培养板96平底,孔直径 6.4mm,生长面积 0.32cm2 5只组. 110.00现货10200细胞培养板96U底,孔直径 6.4mm,生长面积n/acm2 5只组. 132.00现货110202细胞培养板96V底,孔直径

6.4mm,生长面积 0.38 cm2 50只/箱. 1650.00现货10204细胞培养板96半孔板,孔直径 4.5mm,生长面积 0.16 cm2 5只组. 182.00现货10206细胞培养板384孔,125μl 20只/包. 968.00现货10208细胞培养板1536孔, 2.3μl 20只/箱. 4500.00现货10209细胞培养板1536孔, 2.3μl 1只/包. 248.00现货培养器皿96孔培养板24孔培养板12孔培养板6孔培养板 3.5 cm培养皿6 cm培养皿10 cm培养皿25cm2培养瓶75cm2培养瓶面积(cm2) 0.3 224.5 9.75培养液量(ml) 0.1 1.0 2.0 2.5 3.0

5.0 10.0 5.015~30细胞量1055× .5×1062× 1065.2× 10613.7×1065×1062×107

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