氨 基 酸 自 动 分 析 仪 简 介

氨基酸自动分析仪

氨基酸是蛋白质的组成成分，是蛋白质化学研究的主要内容之一。蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭示生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异过程，都与氨基酸的研究有关。

随着近代物理学、化学和电子学的飞速发展，氨基酸的分析技术亦在不断更新。氨基酸分析仪是本世纪50年代研制的，仅40多年，已发展到现在的进样、分离、检测和数据处理全部自动化的程度。检出量由微克分子到毫微克分子，分析时间由原来的24小时到现在的半个小时，分析技术的提高促进了其他科学领域的发展。

一、氨基酸自动分析仪的进展

用于氨基酸分析的方法很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、电泳法及气相色谱法等。一般认为离子交换柱色谱法是较为精确的检测方法，氨基酸分析仪就是在此基础上研制成功的。1951年Moor和Stein采用离子交换树脂色谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在Spaekman的协助下，使分析操作自动化。迄今氨基酸分析仪的条件和自动程度有了很大的改观，其特点主要表现以下几个方面。

⒈树脂粒径减小近年来制成的小颗粒球状树脂，使氨基酸分析仪得到很大改进。由于树脂粒径减小就对应地增加等

量树脂的总面积，使现在少量树脂达到过去大量树脂的分离效果，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂用量，缩短了分析时间。树脂的粒径从200→20→10→5μm。

⒉色谱柱内径缩小树脂粒径减小使填充树脂床的色谱柱内径减小，由过去的粗长柱变为微柱。色谱柱内径的变化为18→6→2.8→1.75mm。

⒊输压泵压力增高一般氨基酸分析仪采用低压泵，其施加于输液的压力只有几9.80665×104Pa，以后增加至几十

9.80665×104Pa，现在发展到2068×104Pa。

⒋分析时间缩短由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小和泵压增高，使分析时间大大缩短。蛋白质水解液的分析时间从过去的24小时缩短到现在的半个小时左右。

⒌仪器灵敏度提高由于仪器的不断改进，使灵敏度大为提高，过去仪器的最高灵敏度已远不及现在仪器的最低灵敏度。现在一般氨基酸分析仪的灵敏度均达到0.1nmol。

⒍试剂用量减少由于分析时间大大缩短，致使试剂消耗量大为降低。氨基酸分析的试剂要求纯度很高，且价格昂贵，试剂用量减少会降低分析费用，试剂流量(每小时茚三酮试剂的用量)的变化为70→35→18→3.5ml。

⒎样品用量少由于仪器灵敏度不断提高，同时不少仪器采用单柱分析法，所以样品用量逐渐减少，从过去一次分析需要样品几ml到现在只用20μl。这对科研中难以收集和制

备的样品以及许多生物样品的微量分析提供了十分有利的条件。

⒏自动化程度提高由于采用多样品自动注入器、程序控制和数据处理系统，使仪器从进样到每个氨基酸结果打印的全过程都自动化。并且当仪器出现故障时又能自动停机，因此可以自动地进行工作。

⒐显色试剂和检测器的改善显色试剂中除了茚三酮仍被广泛应用外，荧光试剂受到人们的重视。以前认为很有发展前途的荧光胺已被邻苯二甲醛所取代。目前用邻苯二甲醛的荧光计检测器检测的灵敏度比用茚三酮显色后经分光光度计检测的灵敏度高100倍以上。

二、氨基酸分析原理

⒈氨基酸的理化特性

氨基酸是无色的结晶物质，氨基酸分子()至少有一个氨基和一个羧基，在水溶液中呈中性、弱酸性或弱碱性，是两性电解质，它所带的电荷随介质pH而变化。当氨基酸处于H+介质中，羧基的解离作用被抑制，整个分子获得一个质子带正电荷；反之，当它处于OH-介质中，则从氨基夺走一个质子，从而整个分子带负电荷。当处于某一pH下，两性离子所带正负电荷数相等时，此时的pH值就是该氨基酸的等电点，整个分子呈电中性。一般氨基酸都能溶于水和其他极性溶剂，而难溶于乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。

由于氨基酸结构不同，等电点亦有差异。氨基酸等电点是取决于其羧基和氨基的解离常数的相对值。由于羧基的解离常数大于氨基酸的解离常数，故一般氨基酸的等电点为弱酸性。

由于氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此，它们都能产生氨基和羧基的一般化学反应，如酯化、甲基化、乙酰化以及酸碱中和反应等。这里仅就氨基酸分析仪采用的与茚三酮试剂显色反应加以描述。

氨基酸与水合茚三酮共同加热被氧化分解为CO2、NH3和比氨基酸少一个碳原子的醛，此时茚三酮被还原。在弱酸性溶液中(pH=5)，还原茚三酮与NH3及另一个分子茚三酮缩合成蓝紫色化合物茚二酮炔―茚二酮胺(DYDA)。反应式为：由于DYDA在570nm处有最大吸收峰，所以广泛地用于氨基酸比色测定。唯脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色物质，在440nm处有较强的吸收峰。

⒉离子交换树脂

离子交换色谱是以液体作为流动相，用离子交换树脂装在柱内作为固定相，与适当的检测器连接起来的专用液相色谱法。其基本原理与离子交换色谱相同。各种氨基酸的酸碱性、极性和分子结构不同，常用阳离子交换树脂在色谱柱上分离，可用不同的pH值和离子浓度的缓冲液依次将它们洗脱，酸性氨基酸先被洗脱下来，其次是中性和碱性氨基酸，同类

型的氨基酸，分子量较小的先洗脱出来。由于氨基酸不吸收可见光，故洗脱液需与茚三酮反应显色后才能检测，最后根据检测信号的大小计算各种氨基酸的含量。

离子交换树脂有以下类型：

⑴阳(酸性)离子交换树脂凡是含有酸根的树脂为阳离子交换树脂，这类树脂又可分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类。强酸型含有磺酸基团(―SO3H)；中强酸型含有磷酸根(―PO3H2)、亚磷酸根(―PO2H2)；弱酸型含有羧基(―COOH)或酚羟基(―OH)。以上这些交换树脂在交换时反应机理如下：

⑵阴离子交换树脂阴离子交换树脂都含有氨基，它可分为强碱型、中碱型和弱碱型三类，如含季胺盐[―N+(CH3)3]为强碱型；叔胺[―N(CH3)2]、仲胺[―NHCH3]、伯胺类为弱碱型。既含强碱基团也含弱碱基团的交换树脂是中强碱型树脂。交换反应如下：

强碱型R―N+(CH3)3OH-+Cl-→R―N+(CH3)3Cl-+OH-

弱碱型R―N(CH3)2+H2O→R―N+(CH3)2H+OH-

R―N+(CH3)2H?OH--+Cl-→R―N+(CH3)2HCl+OH-

以上所列离子交换树脂含有一个分子的不溶基底物质及一个活性根，但这些活性根的存在会增加物质的溶解度，一般的方法是在树脂中加入“交联结构”，使它成为一个高分子量的大聚合物，上下左右索扯固定，不能溶解。

氨基酸分析仪所用的强酸型阳离子交换树脂是由苯乙烯

及二乙烯苯合成的，其中苯乙烯是主要成分，磺酸根联结在其上，形成磺化苯乙烯。二乙烯苯是用来做交联结构的，它把直链结构的磺化苯乙烯错综地连贯起来，防止因吸水溶解而溃散。磺化苯乙烯与二乙烯苯的聚合如图1.4.1所示。使用离子交换树脂应注意交联度，即二乙烯苯占树脂单体的百分率。交联度大，树脂的结构紧密，空隙度、渗透性以及溶胀性较小，适应于分子量较小的氨基酸分离；反之交联度小的树脂，结构疏松，空隙度、渗透性及溶胀性大，在离子交换中结构不稳，高压的洗脱液会把这种树脂破坏，氨基酸分析所用的树脂交联度为8%～12%。

目前，国外各厂商都有自己的树脂，配制方法均属专利产品，所以树脂的售价昂贵。

⒊氨基酸自动分析仪原理

氨基酸分析仪是在离子交换色谱的原理指导下制成的，是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪。它的结构一般是由色谱系统、自动加样系统、检测系统、控制系统、数据处理系统组成。如图1.4.2所示，流程图的主要部件有，进行氨基酸分离的离子交换树脂色谱柱；分离的各个氨基酸与茚三酮试剂反应的水浴(100℃±1℃)；用于检测氨基酸显色的比色计及记录仪和数据处理系统；输送缓冲液和茚三酮试剂的恒流泵；缓冲液自动转换阀；自动进样器；保持色谱柱分离温度的恒温水浴。

用于氨基酸分析的样品都需用pH2.2的缓冲液溶解或配制，由于pH2.2都较各种氨基酸的等电点小，即各氨基酸都处于[H+]浓度很大的酸性溶液中，这样的溶液有利于氨基酸的氨基(―NH2)电离，而不利于羧基(―COOH)的电离。因此，在pH2.2的缓冲液中各氨基酸呈R―CH―COOH状态，带正电荷。柱里的磺酸型阳离子交换树脂R―SO3-H+被柠檬酸钠(生理体液为柠檬酸锂)缓冲液平衡时形成R―SO3-Na+。当带正电荷的氨基酸进入色谱柱前端，此时氨基酸浓度处于最大值，氨基酸与Na+进行如下交换：

由于缓冲液的流动以及氨基酸的吸着，氨基酸在流动相中的浓度下降，这时氨基酸就会解吸，这种解吸作用使交换树脂恢复到原来的形式。这样当氨基酸通过离子色谱柱时，连续地吸着与解吸，加之各种氨基酸彼此性质不同，吸着的程度就有差异，在缓冲液的作用下便形成了分离。当逐渐提高洗脱缓冲液的pH值时，氨基酸的正电荷逐渐减少，与树脂的结合力逐渐减弱，最后从离子色谱柱被洗脱下来。

氨基酸的结构不同，与树脂的结合力也有差异。酸性氨基酸所带的氨基少，正电荷也少，与树脂结合不紧，它容易被洗脱下来。如天门冬氨酸，是第一个洗脱下来的氨基酸，其等电点为：

天门冬氨酸等电点(pI)=?(2.1+3.9)=3.0

相反，赖氨酸所带的氨基(―NH2)多，在pH2.2缓冲液中，

正电荷多，它与树脂结合紧密，被Na+置换困难，故洗脱下来的速度就慢。

赖氨酸的等电点(pI)=?(9.0+10.5)=9.75

氨基酸侧链除具有氨基和羧基外，有的氨基酸还带有其他基团，这些基团在一定条件下也能离解，如酚羟基(酪氨酸)、咪唑基(组氨酸)及胍基(精氨酸)等，在一定条件下，这些基团的解离状态及它们对树脂的亲和力和被洗脱的速度是有区别的，这些区别是各氨基酸在色谱柱被分离的基础。

不同氨基酸与离子交换树脂亲和力的强弱如下：

碱性氨基酸>芳香族氨基酸>中性氨基酸>酸性及羟基氨基酸。

因此，氨基酸的分离便有先后顺序，一般酸性及带羟基的氨基酸最先洗脱下来，然后是中性氨基酸，最后是碱性氨基酸。图1.4.3是Beckman 121MB型氨基酸分析仪蛋白质水解液中各氨基酸的出峰顺序。

氨基酸的分离是用不同pH值的缓冲液进行的，一般标准分析(蛋白质水解液分析)采用柠檬酸缓冲液，如果分析生理体液(如尿、血浆、乳汁、脑脊液及动植物组织提取液等)则该为柠檬酸锂缓冲液，因为天门冬酰胺与谷氨酰胺在钠盐缓冲液中不易分离，两者重叠成一个峰，不能得出各自的结果。标准氨基酸分析(蛋白质水解液分析)，Beckman 121MB型一般使用三种缓冲液。即pH3.28洗出天门冬、苏、丝、谷、

脯、甘、丙、胱、缬等氨基酸；pH3.90洗出蛋、异亮、亮、酪、苯丙等氨基酸；pH4.95洗出赖、组、精等氨基酸。

除以上缓冲液外，还有再生液，浓度为0.2mol/L NaOH。每做完一个样品，仪器自动吸入再生液，将柱子冲洗干净后，再做第二个样品。

洗脱出来的氨基酸与另一流路的茚三酮溶液混合，在100℃的水浴中起显色反应。一般氨基酸反应后呈蓝色，但脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色。故氨基酸分析仪一般都设计有二个频道，一个为570nm，一个为440nm。显色后，流经分光光度计比色，比色后的信号经放大以后输入记录仪和积分仪，最后打印出结果。

三、氨基酸分析仪的结构与功能

氨基酸分析仪是一种专门用来分析氨基酸的液相色谱仪，其结构一般由色谱系统、自动加样系统、检测系统、控制系统、记录数据处理系统、电源供给系统和安全关闭系统组成。

⒈色谱系统

色谱系统的作用是完成样品中各种氨基酸成分分离。本系统包括氮气供给、流路和色谱柱、转换阀、泵以及水浴等部分。

⑴氮气供给

氨基酸分析仪需要使用高纯氮(含N2量99.999%)。氮气的作用是防止茚三酮试剂被空气中的氧所氧化；防止缓冲液被

空气中的氨污染；给缓冲液和茚三酮贮存瓶加压，以利于液体通过单向阀进入泵内；吹干样品贮存螺旋管。

⑵液体的流路和色谱柱

①液体流路氨基酸自动分析仪的液体流路包括缓冲液流路和茚三酮试剂的流路。

缓冲液流路的作用是把缓冲液作为流动相以一定的流速通过色谱柱，使样品中各种氨基酸组分在色谱柱内按一定的顺序洗脱出来。

基本流程为：

加有氮气压力的缓冲液→低压管气泡捕捉器→低压管缓冲液选择阀→低压管泵→高压管样品注射器阀→高压管色谱柱→减压柱流出阀→Y型混合接头→反应螺旋管→比色计→测量阀→流出

茚三酮流路是把一定流速的茚三酮试剂流入反应螺旋管与洗脱的各种氨基酸组分起显色反应，以便用比色计进行比色。

②色谱柱 Beckman 121MB型氨基酸分析仪使用内径为

2.8mm的玻璃色谱柱。柱长根据需要可选用150mm、300mm、450mm等几种。柱内填充的离子交换树脂是美国Beckman AA–10型树脂，粒径为8～9μm，交联度12%。

③控制阀

氨基酸分析仪使用的三种不同pH值的缓冲液和一种再生液，是由四个进口一个出口的马达驱动旋转控制阀来控制

的。旋转阀有四个位置，每个位置出口只与其中的一个进口相通，这样在四个进口上连接四种不同的缓冲液或再生液。根据阀的旋转位置可以选择所需的缓冲液或再生液(每次旋转900，分别接通1、2、3、4管道)，如图1.4.4所示。

茚三酮选择阀从茚三酮泵流出的茚三酮试剂流经反压柱后，它的流向由一个马达驱动的选择阀控制。该阀是一个四孔旋转控制机械阀，每旋转900变换一次方向。如图1.4.5所示。

⑷泵

Beckman 121MB型氨基酸分析仪由于是双柱系统，有三个泵(一个茚三酮泵和两个缓冲液泵)。泵被马达带动的凸轮驱动，液体的流速由活塞的行程定来决定，行程又由凸轮的偏心度来决定。因此，可以通过调节凸轮的偏心度来改变泵的流速。

⑸水浴

氨基酸分析仪使用两种水浴，反应水浴和循环水浴。

反应水浴槽氨基酸与茚三酮的显色反应需要在100℃的温度才能进行，所以仪器必须配有反应水浴槽。

循环水浴循环水浴的作用是给色谱柱加温。色谱柱的温度对氨基酸的保留时间和峰的分离有很大影响。为了提高分离效率和重现性，对柱温的选择和恒定要求很高。如在50℃的柱温下分辨率指标为：

苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)>80%；甘氨酸(Gly)丙氨酸(Ala)>70%。

当使用53℃柱温时分辨率指标为：

苏氨酸(Thr)和丝氨酸(Ser)>70%；甘氨酸(Gly)丙氨酸(Ala)>80%。

在这个柱温下还有利用酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的分离，为了取得最佳分离效果，氨基酸分析仪有程序升温装置。水解液的分析柱温是50～65℃，生理液的分析柱温是40～67℃。

⒉自动加样系统

氨基酸分析仪的自动加样系统，由样品贮存管、样品旋转台、注射器旋转阀、样品转运泵、样品转运阀及控制部分组成。

完成一个样品自动加样包括以下步骤：转运样品、注射样品、清洗样品贮存管、吹干样品贮存管、转运下一个样品。氨基酸分析仪在自动运转时，自动加样系统是由一个样品注射子程序系统按上面步骤自动完成的，也可以手动控制操作。

⒊检测系统

氨基酸分析仪的检测系统是用比色计进行氨基酸组分检测的，比色计的基本结构如图1.4.6所示。

从光源a发出的光，经过凸镜聚光以后进入红外线滤光器

b和比色杯c在双色性附件d上分成三束光波，这三束光分别被440nm、570nm、690nm的滤光器滤光以后在各自的检测器上进行检测。在三个检测器上，把光的信号转变为电信号，这些电信号分别送到e、f、g三个对数放大器进行放大。在比色计的输出端输出440nm、570nm和440+570nm的三种信号，分别送到记录器记录和数据处理系统进行处理。690nm 的信号是一个参比信号，目的是为了取掉440nm和570nm信号中的电噪音，产生良好的信一噪比和稳定的基线。

⒋控制系统

氨基酸分析仪的操作可以手动控制或程序自动控制。手动控制主要用于仪器的某些部件的调节或制备一个完整的自动控制程序，由于受树脂床高度、流速和冷却水温等因素的影响，对某些程序步骤需要确定合适的时间，而这些时间确定需要用手动操作才能得到。手动操作是通过控制面板开关完成的；自动分析是通过分析程序控制完成的(程序步骤略)。

⒌记录和数据处理系统

从比色计输出的信号一路送给记录仪进行色谱图记录，另一路送给数据处理系统进行数据处理并打印结果。记录仪把各种氨基酸组分的吸收峰在记录纸上绘成高斯分布色谱图，可以单独根据记录仪所记录的图谱对所分析的氨基酸组分定性定量，特别是对非蛋白氨基酸的定性，记录图谱尤为重

要。数据系统是一种为色谱数据处理而专门设计的单通道数据换算系统。

⒍电源供给系统和安全关闭系统

⑴电源供给系统电源供给系统供给仪器各种部件工作的交流和直流电源。Beckman 121MB型氨基酸分析仪把220V 50Hz的单相交流电源由变压器降为115V 50Hz的交流电源送到主机，供给泵、水浴加热器、记录仪和数据处理机。+24V 稳压电流电源供给指示灯、控制继电器及其放大控制电路。比色计的放大器使用±15V直流稳压电源。记录器放大器使用它本身的±14V直流稳压电源。比色计光源灯用+6V直流稳压电源。

⑵安全关闭系统安全关闭系统的功能是监测仪器的工作情况，当某一系统的工作不正常时能发出相应的报警信号并自动关闭分析仪。Beckman 121MB型氨基酸分析仪在手控和自动操作时有三个独立的安全系统可以保护样品和设备。

①记录安全系统如果在分析过程中记录器无峰记录时，记录的安全系统自动关闭这个系统。

②阀门安全系统监视所有旋转控制阀工作，它包括样品旋转台、程序马达和各个换向阀等，当某一个阀在控制它的旋转时失灵，将导致仪器的关闭。

③流动安全系统当流速(被滴液检测器监视)低于流动安全监视器的限量时，流动安全系统即被启动，这时茚三酮

阀转至排出位，柱流出阀从所用柱转至另一柱(从柱1转至柱2或从柱2转至柱1)，并启动替代的缓冲液泵以清洗管道内残留茚三酮试剂。茚三酮冲洗记时器上调定的时间(一般为一小时)过去以后，仪器即自动关闭。

四、氨基酸分析仪的应用

蛋白质是生物体赖以生存的物质。生物体内除含有组成蛋白质的各种氨基酸外，还存在各种游离氨基酸。因此，蛋白质是一切生命有机体的物质基础，除组成细胞结构外，还是生物运动机能的承担者。在生物体新陈代谢中起促进作用的酶，也是具有催化作用的蛋白质。蛋白质在人和动物的营养方面极其重要，是生物体必要的成分。氨基酸分析仪对蛋白质的氨基酸的深入研究起了重要的作用，应用范围不断扩大，在食品、农业、饲料、医药、蛋白质结构的研究以及石油、地质、古生物等领域都得到广泛地应用。

⒈食品方面

⑴以动物蛋白质为主体的分析，如鱼肉、猪肉、牛肉、奶粉、鸡蛋等。

⑵调味品和添加剂的分析，如谷氨酸钠、赖氨酸、蛋氨酸等。

⑶各种氨基酸分析，如花粉、水果、啤酒、果酒、蘑菇、各种蔬菜、营养口服液等。

⒉农业方面

⑴作物种子如水稻、小麦、大麦、荞麦、大豆、豌豆、玉米、薯类、花生等种子蛋白质的氨基酸分析。

⑵作物生长过程中植株各部位氨基酸含量的分析。

⑶新品种选育过程中氨基酸的分析。

⒊饲料工业方面

⑴各种植物性饲料氨基酸分析，如植物种子、节杆、油饼、糠麸、糟粕、野生植物、牧草等。

⑵各种动物性饲料，如鱼粉、肉粉、骨粉、血粉、羽毛粉、蚕蛹、酵母粉、动物角、蹄、毛发、内脏、废蚕丝等。

⑶各种配合饲料配方的研制和饲料添加剂等氨基酸分析。

⒋医药方面

⑴制药，如复方氨基酸注射液用于治疗肝脏病患的氨基酸分析；影响中枢传递介质的氨基酸分析；纠正血浆氨基酸平衡的支链氨基酸分析；脑病的氨基酸分析；心血管病的天冬氨酸分析；提高肌肉活力和治疗癌症的氨基酸分析等。

⑵名贵药材和营养滋补品分析，如麝香、鹿茸、虎骨、犀角、阿胶、虫草、人参、银耳、灵芝等。

⑶在临床诊断和氨基酸代谢上，对某些氨基酸增加症、代谢失调症的氨基酸分析。

⒌其他方面

⑴生物化学中对蛋白质和酶结构以及功能的氨基酸分析及动植物体内氨基酸代谢机制研究中的氨基酸分析。

⑵石油地质中测定油岩氨基酸含量。

⑶地质和古生物研究中，地质年代的生命起源的氨基酸分析。

⑷各种含蛋白质的氨基酸的物质的综合利用分析。

⑸在轻工业中，皮革加工、丝绸和毛绒纺织等方面的应用。