【周凌云】茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

茶炭疽病的分子检测及病原鉴定

周凌云王沅江黄安平曾振刘红艳

（1湖南省茶叶研究所，长沙410125）

摘要：根据茶炭疽病菌与其它菌ITS序列的差异设计了1 对寡聚核苷酸引物，并优化DNA 抽提方法与扩增条件，从而实现了病叶准确而快速的PCR 检测。分离到两种病原菌Z1、Z2通过形态鉴定与回接实验初步鉴定为茶炭疽病菌，并在核酸体转录间隔区序列（GITS、ITS）及肌动蛋白基因（ACT）3对引物的多基因分子联合检测实验中再次被证实。

关键词：茶炭疽病；分子检测；病原；鉴定；症状

Molecular Detection and Pathogen Identification of

Tea Anthrax

ZHOU Lingyun, WANG Yuanjiang, HUANG Anping,ZENG Zhen,LIU Hongyan

Hunan Tea Research Institute，Changsha 410125

Abstract：According to the sequence of internal transcribed spacer regions ( ITS) of the ribosomal gene，a pair of specific primers for the pathogen of Tea anthracnose was synthesized．With the optimization of reaction conditions and amplification Study,we provided a accurate and rapid method to detect the pathogen. Z1、Z2 were isolated and been preliminary identified as two different pathogens of tea anthracnose by morphological identification and tie back experiment,The conclusion was testified again by molecular detection of three primes(General ITS, ITS and Actin gene gene).

Key words: Tea anthracnose；Molecular detection；Pathogen；Identify；Symptom

基金项目：湖南省农业科学院创新项目

作者简介：周凌云（1978—），女，湖南邵阳人，助理研究员，博士研究生，主要从事茶树病害研究，zhoulingyun0808@https://www.360docs.net/doc/841142847.html,

茶炭疽病是我国各茶叶产区常见病害之一，在茶叶上可产生1/3左右的灰白或红褐色病斑，往往造成5%以上的减产，干茶外形破碎、滋味变淡。其病原菌从茶树嫩叶背面入侵，潜伏5-20天，病症与茶云纹叶枯病、褐色叶斑病等叶部病害混淆，因此，以形态特征为基础的常规病害诊断技术难以及时准确检测到茶炭疽病的发生，从而导致该病难以得到及时高效的防控，自2009年，本研究组建立了茶炭疽病原菌的PCR鉴定方法后[1]，再次进行自然病样的直接分子检测，并分离获得两种菌落形态差异很大的病菌，分别命名为Z1、Z2，经过形态学与分子鉴定明确Z1、Z2为茶炭疽病的致病菌。

1 材料与方法

1. 1供试病叶及来源

长沙县茶园随机采集20片显症为红褐色病斑的茶叶与20片显症为灰白色病斑的茶叶。

1.2 病原菌分离、回接与形态学观察

选取病叶病健交界处组织100块，约2mm×2mm，75%酒精中浸泡5秒钟，3%次氯酸钠溶液灭菌1分钟，无菌水洗3次，置于PDA培养基上，放入28℃培养箱中培养，单孢分离得到纯孢子培养于PDA上，记录病原菌的菌落形态、分生孢子的形状、颜色、大小等。

借鉴Yoshida，K，2004[2]的接种方法，利用打孔器将PDA上培养5天的菌落打成菌碟，置于挑针戳了2个伤口的茶叶上，脱脂棉蘸无菌水保湿，分别接种于室内的ROOTCUBES?生长介质(Smithers-Oasis有限公司)中保持高湿、26℃与田间枝条茶叶上用保鲜袋连续保湿3天，设置3个重复，对照接无菌培养基，其他操作相同，每天观察1次发病情况，将已产生症状的叶片进行切片棉兰染色观察。

1.3 病原菌分子生物学鉴定

根据茶炭疽病菌与其它菌属ITS序列的差异，应用DNAStar的PrimerSelect 设计了1个ITS引物对，与来自文献[3-4]的GITS 、ACT的这2个引物一起交付华大生物有限公司合成，3个引物对见表1。

表1 选择的目标基因及相应的引物

分别应用TIANGEN公司植物基因组DNA抽提试剂盒与真菌基因组DNA试剂盒提取自然发病叶片的DNA，而对于Z1、Z2的DNA抽提则采用其真菌基因组DNA 试剂盒。

以提取的DNA为模板，用3对引物扩增DNA序列，利用宝生物公司pMDTM19-T 载体进行PCR产物的克隆，方法参照pMDTM19-T载体说明书。选择插入片段长度与克隆片段长度一致的克隆，送交华大生物公司测序分析。将测定所得序列利用Blast程序从GenBank搜索相关序列，进行同源性比较。

2结果与分析

2. 1 明确两种茶炭疽病症

茶炭疽病主要发生在茶树成叶或老叶上，病斑近圆形或不规则形，初期水渍状暗绿色，最后呈红褐色或灰白色，病斑上生有细小的黑色粒点，病斑可扩大到叶片的1/2以上，病健分明，见图1A、1B。

图1A 茶炭疽病红褐色病斑图1B 茶炭疽病灰白色病斑

2．2 分离到两种病原菌

100块红褐色病样分离到Z1的几率为50.00%、Z2为5.12%，100块灰白色病样分离到Z1的几率为73.33%、Z2为3.20%。Z1在PDA上生长速率平均为1.82cm/d,菌落颜色逐渐由白色转变为灰白直至灰黑。显微镜下菌丝体附着胞黑褐色，棍棒状、掌状或三角形，边缘整齐，大小为(8-12)um×(7-20)um，见图2A、2B。Z2在PDA上生长速率平均为1.25cm/d。菌落红褐色，后期菌落表层长出一些黄色及白色絮状物，20天左右可形成分生孢子，分生孢子单胞、无色、壁光滑，圆柱形，两端钝圆，有油球，大小为(15-24 )um×(8-12)um。而由病原菌的形态特征初步鉴定Z1、Z2均为茶炭疽病原菌，见图3A、3B。

图2A Z1菌落（6天）图2B Z1附着胞（10×60倍）

图3A Z2菌落（30天）图3B Z2分生孢子（10×60倍）

2.3 柯赫氏法则验证

Z1、Z2进行菌碟回接实验，6天左右即在接种茶叶上形成病斑，病斑缓慢扩大，呈褐色，对照伤口没有病斑显现，见以下图4A、4B。选取Z2接种显症处进行切片棉兰染色观察，与Z2菌落中分生孢子大小形态一致，见图4C。

图4A回接Z1显症图4B回接Z2显症图4C回接Z2显症切片

2.4 建立茶炭疽病叶的分子检测方法

通过多次参数优化，最终明确PCR的参数分别为：PCR 扩增的程序为: 95℃变性3 min; 94℃变性1 min，54℃退火45 s，72℃延伸1. 5 min，35个循环; 最后72℃延伸10 min。各样品的PCR产物能获得相对单一的电泳条带。见下图5A、5B

M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 5

图5A 抽提DNA电泳图图5B PCR产物电泳图谱

M:Marker 5000；M:Marker 2000；

1：Z1抽提DNA(真菌试剂盒)；1:病叶-GITS-真菌试剂盒（498bp）；

2: Z2抽提DNA(真菌试剂盒)；2：Z2- ACT (244 bp)；

3: 病叶抽提DNA(植物试剂盒)；3：Z1- GITS（549 bp）；

4:病叶抽提DNA(真菌试剂盒)；4：Z1-ACT（250 bp）；

5：病叶-ITS-植物试剂盒（437bp）

图5C 5个测序产物的进化树构建

将5个测序结果在GENBANK中比对后，应用DNAStar中phylogenetic tree 程序构建的系统进化树显示：病叶与Z1及Z1与Z2分别与Colletotrichum sp、Discula theae-sinensis同源性较高，而Discula是Colletotrichum的更名[5]。

但是通过植物DNA抽提试剂盒获得病叶DNA其PCR产物却与茎点霉属phoma同源率很高，茎点霉属在茶叶中分离率达40%以上，而且产孢量很大，因此应用植物DNA抽提试剂盒更易分离到产孢丰富的茶叶内生茎点霉属。

3 结论和讨论

一是建立了一种病茶炭疽病叶的快速分子检测技术，只需花费1天左右的时间。其中真菌抽提试剂盒及ITS引物的应用是快速分子检测的关键因素。但本试验结果只能定性的检测茶炭疽病菌的有无，尚不能进行定量测定。还需继续优化条件，并采用实时定量PCR 技术可准确计算出病组织中病原菌的含量，将更有利于扩增在潜伏早期的茶炭疽病，由于病样间发病程度的差异，本试验中检测病样扩增到的病样DNA特异性条带强弱有所差异，因此在实际检测的过程中，需要检测多份样品，以提高诊断结果的准确性。

二是从显症茶白星病叶中分离到Z1、Z2两种真菌，通过柯赫氏法则及分子检测明确均为茶炭疽病菌。炭疽菌属的形态鉴定，形态结构上附着胞是真菌营养菌丝形成的变态结构[6]，Sutton一直主张应用菌丝体附着胞作为炭疽菌属的分种的形态特征之一[7]，因此Z1的形态鉴定通过附着胞从而得到初步鉴定。根据ITS 许多炭疽菌属系统发育鉴定的主要区域，尤其在新种的研究发表中均采用ITS序列[8-9]。因此此次炭疽菌属的分子鉴定中采用了2个ITS引物对进行PCR扩增。据报道，茶炭疽菌是茶叶中一种主要的内生菌[10]，因此Z1、Z2的致病性通过严格的柯赫氏法则的切片验证，12天后在叶片上显症，并分离观察到病原孢子在茶叶中的分布，从而明确其为茶炭疽病菌的两种病原菌。

三是进一步验证Discula为最新更名的茶炭疽病菌。Moriwaki J, Sato T首次形态学与分子方法明确茶炭疽病菌的病原属于半知菌亚门，黑盘孢目，盘长孢属，应当为Discula theae-sinensis(Miyake) Moriwaki&sato以取代Colletotrichum

theae-sinensis Miyake，本次多基因联合分析中发现Z1的序列在比对时分别与Discula及Colletotrichum高度同源。

四是明确茶炭疽病的病原菌具有两种，推测可能更多，从而与在茶叶上不同症状表型相关。而炭疽菌属中绝大多数种不存在寄主专一性，存在较多的一种植物被击中炭疽菌同时寄生，如辣椒可被三种不同种的茶炭疽病

C.truncatum ,C.gloeosporioides,C.simmondsii[11]。Z1、Z2尚需做进一步寄主范围的研究，明确其属于茶叶专一寄生菌或多作物寄生菌。

参考文献

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实验四茶叶中茶多酚含量的测定

实验四茶叶中茶多酚含量的测定——高锰酸钾直接滴定法一、目的：掌握高锰酸钾直接滴定法测定茶叶中茶多酚含量的原理及操作二、原理茶叶中茶多酚易溶于热水，在用靛红作指示剂的情况下，样液中能被高锰酸钾氧化的物质基本上都属于茶多酚物质。根据消耗1mL 0.318g/mL的高锰酸钾相当于5.82mg茶多酚的换算系数，可计算茶多酚的含量。三、仪器与试剂仪器：分析天平、电动磁力搅拌器、电热水浴锅、500mL白瓷皿。试剂：1、0.1%靛红溶液：称取靛红1g加入少量水搅匀后，再慢慢加入相对密度为1.84的浓硫酸50mL，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，如果靛红不纯，可下法磺化处理是：称取靛红1g，加浓硫酸50mL，在80℃烘箱或水浴中加热磺化4~6h，用蒸馏水定容至1000mL，过滤后贮于棕色瓶中。 2、0.630%草酸溶液：准确称取草酸6.3034g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。 3、高锰酸钾标准溶液：称取AR的高锰酸钾1.27g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL。准确吸取0.630%草酸溶液10mL，放入250ml锥形瓶中（平行3份），加入蒸馏水50mL，再加入相对密度为1.84的浓硫酸10mL，摇匀，在70~80℃水浴中保温5分钟，取出后用高锰酸钾进行滴定。开始慢滴，待红色消失后再滴第二滴，以后可逐渐加快，边滴边摇，待溶液出现淡红色保持1分钟不变即为终点。计算高锰酸钾溶液的百分比浓度。四、测定步骤 1、供测试液的准备：准确称取茶叶磨碎样品1g，放在250mL锥形瓶中，加入沸蒸馏水80mL，在沸水浴中浸提30分钟，然后抽滤、洗涤，滤液倒入100mL容量瓶中，冷至室温，最后用蒸馏水定容至100mL，摇匀。 2、测定：取200ml蒸馏水放入白瓷皿中，加入0.1%靛红溶液5mL，再加入供测试液5mL，开动磁力搅拌器，用已标定的高锰酸钾溶液边搅拌边滴定，滴定速度以1滴/s为宜，接近终点时应慢滴。直到溶液由深蓝色转变为亮黄色为止，记下消耗的高锰酸钾毫升数。同时做空白测定。五、结果计算 X= ) ( 12 0.005820.318 m V V A B -?ω? ? 式中：X—茶多酚的含量，% ，B—空白消耗的高锰酸钾毫升数，mL A—样品消耗的高锰酸钾毫升数，mL ω--高锰酸钾的浓度，% m—样品的质量g，V1—测定用供测试液的体积，mL ，V2--供测试液的体积，mL 实验三茶叶中茶多酚含量的测定——酒石酸铁比色法一、实验目的： 1、掌握酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量的原理及操作。 2、进一步熟悉721－分光光度计的使用。二、原理：茶叶中多酚类物质占茶嫩梢干重的20％～35％，由约30种以上的酚类物质所组成，通称茶多酚。按其化学结构分为四类：（1）儿茶素类，属黄烷醇类；（2）黄酮及黄酮醇类；（3）花白素及花青素，即羟基-［4］-黄烷醇及其钾盐；（4）醋酸及缩酚酸类。其中以黄烷醇类化合物最重要（占多酚的80％左右）。纯儿茶素一般为白色无定形粉末，在空气中极易氧化

(推荐)总多酚的测定

一、实验原理多酚类物质包括花青苷、黄酮苷、单宁等，具体又可分为若干种。多酚类物质含有酚羟基，有的还含有羧基，属于极性有机化合物，常用极性溶剂提取，如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水以及由这些溶剂按比例组成的复合溶剂。由以上溶剂直接提取的多酚物质，实质为各种多酚的混合物（总多酚提取液），不同的原料中所含酚类物质的种类不同，需要进一步的分离鉴定。常用的植物多酚总量的测定方法中较为普遍使用的方法有:酒石酸亚铁比色法、FD 法、FC 法、普鲁士蓝法等。其中酒石酸亚铁分光光度比色法应用较多。酒石酸亚铁分光光度比色法的原理：过量的酒石酸亚铁与提取液中多酚反应生成稳定的紫褐色络合物，溶液颜色的深浅与溶液中多酚含量成正比。测定总多酚时所用的标准物则需根据样品中所含多酚的种类而定，比如测定茶叶中茶多酚含量时，儿茶酚能较好地代表茶多酚，则以儿茶酚作标准物；而测定藤茶多酚时，则以没食子酸作标准物较合适。二、实验材料、试剂与仪器材料：茶叶；仪器：水浴锅，分光光度计，三角瓶，容量瓶，吸管等；试剂：（1）酒石酸亚铁溶液：称取1.00g硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）和5.00g酒石酸钾钠(C4H4O6NaK·4H2O）混合后加蒸馏水溶解定容到1000mL （2）pH 7.5磷酸盐缓冲液：称取60.20g Na2HPO4·12H2O和 5.00g NaH2PO4·12H2O混合后加蒸馏水溶解定容到1000ml。三、操作步骤（一）标准曲线的制作或茶多酚含量经验值的应用标准曲线的制作参照GB-8313-87《茶—茶多酚测定》方法。为简化操作，可用在一定操作条件下吸光度值为1.00时，供试液中茶多酚的浓度为7.826 mg/mL”这一经验值，直接由待测液的吸光度值计算样品中茶多酚的含量。 1.福林试液的配制：取钨酸钠10g与钼酸钠 2.5g，加水70ml、85％磷酸 5ml与盐酸10ml,置200ml烧瓶中,缓缓加热回流10小时，放冷，再加硫酸锂

茶多酚性质功效及应用

茶多酚性质、功效及应用是中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、、黄酮醇类和类等。主要为（儿茶素）类，儿茶素占60~80%。类物质又称茶鞣或茶，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和作用，能有茶多酚，又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中所含的一类多羟基类化合物，简称TP，主要化学成分为儿茶素类（黄烷醇类）、黄酮及黄酮醇类、花青素类、酚酸及缩酚酸类、聚合酚类等化合物的复合体。其中儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的65%~80%。儿茶素类化合物主要包括儿茶素（EC）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）和没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）4种物质[1]?。 3成分是一种稠环，可分为类、-[4]-黄烷醇类、类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素最为重要，约占总量的60%-80%；类主要由EGC、DLC、EC、EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。茶多酚在茶叶中的含量一般在20—35%。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70%左右。 4性状

茶多酚为淡黄至茶褐色略带茶香的水溶液、粉状固体或结晶，具涩味，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯，微溶于油脂。耐热性及耐酸性好，在pH2~7范围内均十分稳定。略有吸潮性，水溶液pH3~4。在碱性条件下易氧化褐变。遇铁离子生成绿黑色化合物[1]?。 5性能茶多酚具有较强的抗氧化作用，尤其酯型儿茶素EGCG，其还原性甚至可达L-异坏血酸的100倍。4种主要儿茶素化合物当中，抗氧化能力为EGCG>EGC>ECG>EC>BHA，且抗氧化性能随温度的升高而增强。茶多酚除具有抗氧化作用外，还具有抑菌作用，如对葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等有抑制作用。茶多酚可吸附食品中的异味，因此具有一定的除臭作用。对食品中的色素具有保护作用，它既可起到天然色素的作用，又可防止食品退色，茶多酚还具有抑制亚硝酸盐的形成和积累作用。 6理化性质物理性质茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末，易溶于温水(40℃一80℃)和含水中；稳定性极强，在4—8、250℃左右的中，1.5个小时内均能保持，在三价铁离子下易分解。1989年被中国协会列入GB2760-89使用标准，1997年列为中成药原料。化学性质茶多酚是从茶叶中提取的全天然食品，具有抗氧化能力强，无毒副作用，无异味等特点。茶多酚是指茶叶中一大类组成复杂、量及其结构差异很大的多酚类及其衍生物，主要由、黄酮醇、花色素、酚酸及其缩酚酸等组成的，以为主的黄烷醇类化合物占茶多酚总量的60%一80%，其中含量最高的几种组分为L—EGCG(50%-60%)、L—EGC(15%-20%)、L—ECG(10%-15%)和L—EC(5%-10%)。 7药理作用抗癌：茶多酚能极强的清除有害，阻断脂质过氧化过程，提高人体内的活性，从而起到抗突变、抗的绿茶。功效据相关资料显示，茶叶中的茶多酚(主要是儿茶素类化合物)，对胃癌、肠癌等多种癌症的预防和辅助治疗均有益处。防治降、预防及茶多酚对人体有着重要作用。人体的、甘油三酯等含量高，内壁脂肪沉积，血管平滑肌细胞增生后形成动脉粥样化斑块等心血管疾病。茶多酚，尤其是茶多酚中的儿茶素ECG和EGC及其氧化产物茶黄素等，有助于抑制这种斑状增生，使形成血凝黏度增强的纤维蛋白原降低，凝血变清，从而抑制动脉粥样硬化。降血压茶多酚具有较强的抑制转换活性的作用，因而可以起到降低或保持血压稳定的作用。降血糖茶多酚对人体的糖代谢障碍具有调节作用，能降低血糖水平，从而有效的预防和治疗糖尿病。防治脑中风：茶多酚有遏制过氧化脂质产生的作用，能消除血管痉挛，保持血管壁的弹性，增加血管的有效直径，通过血管舒张使血压下降，从而有效地防止脑中风。抗血栓：血浆的增高可引起红细胞的聚集，血液粘稠度增高，从而促进血栓的形成。另外，细胞膜脂质中磷脂与胆固醇的增多会降低红细胞的变形能力，严重影响微循环的灌注，增加血液粘度，使毛细血管内血流淤滞，加剧红细胞聚集及。茶多酚对红细胞变形能力具有保护和修复作用，且易与凝血酶形成复合物，阻止纤维蛋白原变成纤维蛋白。另外，茶多酚能有效的抑制血浆及肝脏中胆固醇含量的上升，促进脂类及胆汁酸排出体外，从而有效的防止血栓的形成。现有的降脂抗栓药物多有一定的毒副作用而不易长期服用。茶多酚是茶叶中具有降脂抗栓作用的天然成分，加上其自身所具有的抗氧化特性，使其成为一种新型的功能性保健品。 ①提高免疫能力通过调节免疫球蛋白的活性，间接实现提高人体综合免疫能力、抗风湿因子、抗菌抗病毒的功效，茶多酚通过提高人体免疫球蛋白总量并使其维持在高水平，刺激抗体活性的变化，从而提高人的总体免疫能力。间接实现抑制或杀灭各种病原体、病菌和病毒的功效。 ②抗变态反应和皮肤过敏反应茶多酚能强烈的抑制组胺的释放作用，实验证明茶多酚抗变态反应和抗皮肤过敏反应比当前常用的抗过敏药的抑制效果强2~10倍。茶多酚能抑制活性因子如抗体、肾上腺素、酶等引起的过敏反映，对哮喘等过敏性病症有显着疗效。

茶叶中茶多酚类物质的提取与含量测定

茶叶中茶多酚类物质提取与含量测定系别：生物医药工程系班级：食品科学与工程

一、目的要求 1、了解茶叶中茶多酚及茶多酚的组成及性状； 2、掌握溶剂提取法提取茶多酚的原理及方法； 3、掌握萃取法分离有机溶剂中的茶多酚的操作方法；二、茶多酚总述 1、组成：茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称，因此常称为多酚类。其主要成分是黄烷醇类、羟基-4-黄烷醇类、花色甘类、黄酮醇类和黄酮类。这些化合物都具有2-苯基苯并吡喃的基本结构，故统称为类黄酮物质。茶叶中绿原酸、鸡鈉酸、咖啡酸等酚酸类化合物也是茶多酚的组分之一。在茶多酚各组分之一黄烷醇类为主，黄烷醇类优异儿茶素类物质为主。 2、性状：茶多酚是介于淡黄色至茶褐色之间的无定型粉末，味涩，略有吸湿性，易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯，微溶于油脂，不溶于氯仿及苯等有机溶剂。茶多酚具有较好的耐酸性，在pH<7时较稳定，在pH>7时则不稳定且氧化变色加快，呈红色。 3.茶多酚的提取方法茶多酚提取工艺效果较好的是有机溶剂萃取法、离子沉淀提取法、树脂吸附分离法、超临界二氧化碳萃取法，其次是超声波浸提法、层析法、膜技术。 4.贮存方法：

贮存于阴凉通风干燥环境，并与有毒、有气味的物品隔离，避免直接与三价铁离子及碱性物质接触。三、实验原理有机溶剂萃取法：有机溶剂萃取法是传统的提取工艺。是利用茶叶中不同化合物在不同溶剂中的溶解度不同进行提取分离。在粗茶叶萃取溶液中，除含有茶多酚以外，还含有咖啡碱、酯质、色素、植物多糖、有机酸、以及悬浮物，且茶多酚含量仅为25%～40% ，所以大多数工艺用乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂反复萃取的方法进一步除杂、纯化、精制。茶水用氯仿萃取可得到水层和有机层，咖啡碱存在于有机层，而茶多酚则存在于水层中，根据萃取及过滤原理，将有机层和水层分别进行浓缩、萃取，即可得到相应粗产物。溶剂萃取法一般的工艺路线图所示溶剂萃取法一般的工艺路线

酵母的分子生物学鉴定

生物技术通报ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＢＵＬＬＥＴＩＮ ?技术与方法? ２００８年第５期收稿日期：２００８－０３－１４基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）项目基金（２００３ＡＡ２１４０６１，２００６ＡＡ０２０２０３）作者简介：唐玲（１９８３－），女，硕士研究生，研究方向：分子生物学；Ｅ－ｍａｉｌ：ｔａｎｇｌｉｎｇ１０１４９９＠１６３．ｃｏｍ通讯作者：闫云君（１９６９－），男，教授，博士生导师；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｙｕｎｊｕｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ；Ｔｅｌ：（０２７）８７７９２２１４酵母种类繁多，不仅作为一种重要的工业微生物被广泛应用于各个领域，近年来，人们还利用酵母发酵来生产抗生素，维生素和酶等高附加值的产品，但酵母也会引发食物、制造物的腐坏变质，从而给人们带来巨大的经济损失，有的酵母还是人体和动物的致病菌（如，Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）。近两个世纪以来，酵母菌分类主要依据形态学鉴定和生理生化特性。目前，已发展起来各种用于酵母快速检测的商业化的试剂盒，可实现部分酵母（多是针对导致疾病的部分致病酵母）的鉴定，但是该类试剂盒对酵母的检测不仅费时，而且鉴定结果准确性不高。由于受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面差异极不显著，在这样的背景下，以化学为基础的分类法建立起来，通过细胞壁的成份、生物合成以及同功酶电泳图谱分析来对酵母进行分类鉴定。现在，随着分子生物学的发展，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交，染色体组型分析（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ），染色体ＤＮＡ的限制性片段长度的多态性分析（ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＦｒａｇｍｅｎｔＬｅｎｇｔｈＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＤＮＡ），线粒体ＤＮＡ（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡ）及核糖体ＤＮＡ序列分析（ｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ），实时ＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ），基因芯片（ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ）等分子生物学的方法广泛地应用于酵母的鉴定中。分子生物学的方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种，而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加，近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛。１核糖体ＤＮＡ鉴定法核糖体ＤＮＡ普遍存在于生物中，真核生物的核糖体ＲＮＡ中包括２６Ｓ、１８Ｓ、５．８Ｓ和５Ｓ４种不同酵母的分子生物学鉴定唐玲刘平黄瑛杨江科闫云君（华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室，武汉４３００７４）摘要：酵母种类繁多，与人类的关系极其密切，但目前由于研究方法的不同，对于酵母的分类还存在着不同的分类体系。而准确快速的对酵母进行鉴定，既可以有效防止食品腐化变质，又可以增加经济效益，同时也为酵母的分类鉴定奠定一定的理论基础。对常用的核糖体ＤＮＡ鉴定法、ＤＮＡ指纹图谱鉴定、脉冲场电泳鉴定、实时ＰＣＲ和基因芯片等分子生物学鉴定方法在酵母鉴定工作中的研究情况进行了比较。关键词：核糖体ＤＮＡＤＮＡ指纹图谱脉冲场凝胶电泳实时ＰＣＲ基因芯片ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＹｅａｓｔＴａｎｇＬｉｎｇＬｉｕＰｉｎｇＨｕａｎｇＹｉｎｇＹａｎｇＪｉａｎｇｋｅＹａｎＹｕｎｊｕｎ（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｓｈａｖｅｗｉｄｅｒａｎｇｅａｎｄａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｈｕｍａｎｂｅｉｎｇｓ．Ｔｈｅｒｅｅｘｉｓｔｓｏｍｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｙｅａｓｔｓｂａｓｅｄｏｎｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄｓ．Ｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｆｉｎｄａｎａｃｃｕｒａｔｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｙｅａｓｔｓ，ｔｈｕｓｂｅｉｎｇａｂｌｅｔｏｐｒｅｖｅｎｔｆｏｏｄｃｏｒｒｕｐｔｉｏｎ，ａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｅｃｏｎｏｍｉｃｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ａｌｓｏ，ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｂｏｕｔｔｈｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｃｏｕｌｄｂｅｐｒｏｖｉｄｅｄ．Ｔｈｉｓｐａｐｅｒｄｅｓｃｒｉｂｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｙｅａｓｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡ，ＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，ｐｕｌｓｅｄｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｇｅｎｅｃｈｉｐｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＲｉｂｏｓｏｍａｌＤＮＡＤＮＡｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＰｕｌｓｅｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲＧｅｎｅｃｈｉｐｓ

茶多酚的营养价值与应用(论文)

茶多酚的功能和作用摘要茶多酚（TP）是从茶叶中分离提纯出来的多酚类化合物的复合体，大约占茶叶干重的15-30％左右，具有优越的抗氧化能力，并具有降血脂、抑制肿瘤、抑菌抗毒、解酒及保护肝脏、解毒、防止皮肤紫外损伤、抗脂质过氧化等保健功能。茶多酚作为抗氧化剂在肉制品、油炸食品、水产品、食用动植物油脂、焙烤食品、糖果、饮料等多类食品中均有广泛的应用。现代科学研究证明,茶多酚具有抗氧化、清除自由基、增强免疫力、降血糖、降血脂等诸多功效。茶多酚是一种新型的天然抗氧化剂,在食品加工、医药、日用化工等领域具有重要的应用。本文就茶多酚的保健功能及应用作一概述。关键词：茶多酚性质及提取营养价值功能成分应用茶多酚是茶叶中的主要水溶性物质，是茶叶主要功能成分之一，是茶叶中多酚类物质的总称。其多酚分子结构中具有活泼的羟基氢，能终止自由基的连锁反应，清除体内超氧阴离子自由基、防治心血管疾病、抑制肿瘤等优异功能，研究表明：茶多酚卓越的抗氧化性，能阻止和延缓不饱和脂肪酸的自动氧化分解。茶多酚的抗氧化能力是二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)的4—6倍，是V E 的6—7倍，V C 的5—10倍，而无合成物的潜在毒副作用［1］。我国对茶多酚的研究始于上世纪五六十年代，到七十年代初己开始专项研究，现在此方面也已处于世界领先水平，确认了茶多酚天然抗氧化剂为我国食品添加剂之一。现今茶多酚的功能引起了各国的广泛重视，成为各工业化国家的技术竞争目标和研究开发热点。 1 茶多酚的性质及提取 1.1 组成茶多酚可分为黄烷醇类、4-羟基黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。茶多酚在茶叶中的含量一般在15％—20％。在茶多酚中各组成份中以黄烷醇类为主，黄烷醇类又以儿茶素类物质为主。儿茶素类物质的含量约占茶多酚总量的70％左右。 1.2 理化性质外观：棕黄、淡黄或淡黄绿色粉末。性质：易溶于水，可溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，味苦涩。

茶叶中茶多酚的检测方法

茶叶中茶多酚的检测方法，我们必须对茶多酚有一个比较详细的了解茶多酚因为其独特的分子结构，有很强的氧化性以及螯合性，所以能很好的清除人体内的自由基，起到抗氧化、抗衰老的效果；同样也因为其分子结构中的酚羟基，所以茶多酚有很好的螯合性能，能够与蛋白质，金属离子相结合。据了解，茶多酚能与20多种离子产生络合，与其中10多种产生沉淀，再者，络合产物很多会产生明显的色泽变化。所以茶多酚的检测方法有很多： 1，蛋白质沉淀法：利用与蛋白质的络合沉淀特征检测茶多酚的含量； 2，金属例子螯合法：就像GB/T8313-2002茶叶和GB/T21733-2008茶饮料中的检测方法一样，利用多酚羟基与铁离子的螯合变成蓝紫色的特性，在540nm出进行检测； 3，氧化法：高锰酸钾与茶多酚的氧化滴定，但是这种方法误差较大，所以目前已经用的很少了；再就是GB/T8313-2008的福林酚法，利用福林酚能将茶多酚氧化然后自己被还原呈蓝色的特征。目前使用的比较多的就是GB/T8313-2002的酒石酸亚铁法与GB/T8313-2008中的福林酚试剂法！酒石酸亚铁法作为茶多酚检测的经典方法在国内被应用了几十年，采用3.913的经验系数进行茶多酚的检测，但是在“食品添加剂茶多酚”的检测标准中则是以没食子酸作标准曲线，系数2.78。同样的茶多酚检测，为什么会有不同的系数呢，很多人或许会疑惑？！但实际上3.913的的系数是以茶叶的乙酸乙酯分离物作为标定物质作标准曲线的，因为乙酸乙酯分离物中不仅仅包括了多酚类物质，还包括了一些其他内涵成分，所以检测结果会偏大，目前主要用于饮料行业中，而2.78的系数则主要用在植物提取物茶多酚领域，其主要区别在于采用的标定物不一致！当然酒石酸亚铁法也有自身的缺点：茶多酚是一种复合物，并非单一组分，其中包括了儿茶素，黄酮类，花青素等等，不同的组分与铁离子络合颜色并非完全一致，所以对于一般成分比较复杂的植物多酚并不适用！再来谈谈福林酚法：福林酚法主要利用福林酚的强氧化性，与多酚反应变蓝，在765nm处进行检测，当然了，福林酚还用于蛋白质的检测中，正是因为这点，所以福林酚并不能有效区分茶多酚，一些还原性氨基酸，植物中非多酚类酚性物质，抗坏血酸等等，这也是它的局限性。当然了，我在网上搜索了一些，很多朋友最关注的是两种方法的检测结果到底有多大差异，经本人一天的实验，当然可能有不尽完善之处，两者差异大概在30%左右，如果以酒石酸亚铁法采取2.78的系数，则差异不大，究其主要原因，还是在于GB/T8313-2002中标准曲线的制作并非纯粹的茶多酚。再者，就GB/T8313-2008中一些问题，我咨询了标准校订单位的王盈峰教授，标准中的刻度试管容积为10ml，所以大家在标准曲线的绘制中要注意了。最后，无论是8313-2002还是8313-2008，茶多酚的检测方法不断更新，越来越与国际接轨，也为中国茶叶走出去提供了契机，新方法中也还有很多不尽完善之处，还需要茶学工作者在以后的工作中慢慢完善。提醒大家，“尽信书不如无书”，真是因为福林酚法有他自身的不足，所以不同的产品还是需要区别对待！ GB/T8313-2008标准曲线以及相关数据 y=-1.1862+92.0488x ug A 10 0.120

菌种鉴定

?（1）常规鉴定常规鉴定内容有形态特征和理化特性。形态特征包括显微形态和培养特征；理化特性包括营养类型、碳氮源利用能力、各种代谢反应、酶反应和血清学反应等。 ?（2）BIOLOG碳源自动分析鉴定 BIOLOG鉴定系统以微生物对不同碳源的利用情况为基础，检测微生物的特征指纹图谱，建立与微生物种类相对应的数据库。通过软件将待测微生物与数据库参比，得出鉴定结果。该系统已获美国FDA认可，已逐步应用于食品和饮品企业、环保、海洋生物/水产品、制药、农业微生物、生物治理、化妆品、临床等领域的微生物鉴定试验中。 CICC拥有国内最全的BIOLOG数据库，涉及革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、厌氧菌、酵母、丝状真菌在内近2000种微生物。 ?（3）分子生物学鉴定应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是目前微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。CICC拥有微生物菌种分类鉴定的分子生物学实验室，配有PCR仪、高速冷冻离心机、电泳仪、HPLC、凝胶成像系统、紫外控温分析系统等先进仪器设备，以及DNAMAN、 BIOEDIT、CLUSTALX、TREEVIEW等序列分析软件。目前CICC可采用核酸序列分析法分析细菌16S rDNA/16S-23S rDNA区间序列、酵母18S rDNA/26S rDNA（D1/D2）序列及丝状真菌的18S rDNA/ ITS1-5.8S-ITS2序列，提供科学的鉴定结果。 ?（4）API细菌数值鉴定系统 API鉴定系统涵盖15个鉴定系列，约有1000种生化反应，目前已可鉴定超过600种的细菌。鉴定过程中，可根据细菌所属类群选择适当的生理生化鉴定系列，通过软件将待测细菌与数据库参比，得出鉴定结果。 CICC目前可应用API 50CH系列、API 20 E系列、API Staph系列对乳酸杆菌（Lactobacillus sp.）和相关细菌、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、微球菌属（Micrococcus sp.）和库克菌属（Locuria sp.）进行鉴定。 ?（5）功能性分析及功能基因

茶多酚的抗氧化作用及其在食品中的应用

茶多酚的抗氧化作用及其在食品中的应用摘要:茶多酚是一种天然的食品添加剂,本文介绍了茶多酚的成分和儿茶素的结构,全面地综述了茶多酚的抗氧化性能茶多酚在油脂、肉制品加工和果蔬保鲜、糕点和糖果以及饮料生产等方面的发展和应用。关键词:茶多酚;抗氧化作用;食品 Abstract: Tea polyphenols is a natural food additives, ingredients of tea polyphenols and catechin structure, a comprehensive overview of the antioxidant properties of tea polyphenols in tea polyphenols grease, meat processing, and aquatic preservation,the development and application of pastries and candy and beverage production. Key word: tea polyphenols;antioxidation;food 茶多酚是从茶叶中提取的纯天然多酚类物质,又叫茶单宁,茶鞣质,是茶叶中多酚类物质的总称。茶多酚主体成分是儿茶素,占茶叶干物量的20 %一30 % [1]。茶多酚分子结构中具有活泼的羟基氢能终止自由基的连锁反应,捕获过量的自由基,因此是一类理想的天然抗氧化剂。 1 茶多酚的性质和结构茶多酚在碱性介质中极不稳定,在酸性中则稳定、耐热、与柠檬酸、苹果酸、酒石酸都有较好的协同作用。在潮湿的空气中能被氧化成棕色物,遇铁变成绿黑色络合物,与重金属盐溶液作用生成灰黄色沉淀,也能被高锰酸钾、硫酸铈等氧化剂氧化,与酒石酸铁生成红紫色络合物[2]。茶多酚的主要成分按其化学结构可分为: 黄烷酮类、花色素类、黄酮醇类、花白素类、酚酸及缩酚酸类等6类化合物。其中以黄烷酮类(主要是儿茶素类化合物)最为重要,占茶多酚总量的60% ~80% 。其次是黄酮类,其他酚类物质含量比较

茶多酚的含量测定

茶多酚的含量测定高锰酸钾直接滴定法目的：掌握高锰酸钾直接滴定法测定茶叶中茶多酚含量的原理及操作原理茶叶中茶多酚易溶于热水，在用靛红作指示剂的情况下，样液中能被高锰酸钾氧化的物质基本上都属于茶多酚物质。根据消耗 1、容至4~6h， 2、 30.630%草的浓硫酸10mL 1 100mL，，开动磁五、结果计算式中：X—茶多酚的含量，% ，B—空白消耗的高锰酸钾毫升数，mL A—样品消耗的高锰酸钾毫升数，mL ω--高锰酸钾的浓度，% ，m—样品的质量g，V1—测定用供测试液的体积，mL ，V2--供测试液的体积，mL 酒石酸铁比色法原理：茶叶中多酚类物质占茶嫩梢干重的20％～35％，由约30种以上的酚类物质所组成，通称茶多酚。按其化学结构分为四类：（1）儿茶素类，属黄烷醇类；（2）黄酮及黄酮醇类；（3）花白素及花青素，即羟基-［4］-黄烷醇及其钾盐；（4）醋酸及缩酚酸类。其中以黄烷醇类化合物最重要（占多酚的80％左右）。

纯儿茶素一般为白色无定形粉末，在空气中极易氧化成棕色物，能溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂中。茶多酚能溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，微溶于油脂。对热、酸较稳定，2%的溶液加热至120 ℃并保持30min，无明显变化。在碱性条件下易氧化变质。酒石酸铁能与茶多酚生成紫褐色络合物，络合物溶液颜色的深浅与茶多酚的含量成正比。因此可以用比色方法测定。该法可避免高锰酸钾滴定法所产生的人为视觉误差。茶多酚的测定方法有高锰酸钾直接滴定法和酒石酸铁比色法，由于高锰酸钾直接滴定法操作比较复杂，且靠肉眼观察颜色判断终点，如果样品溶液颜色较深时，可能影响测定结果。本实验将应用酒石酸铁比色法测定茶多酚的含量。仪器与试剂（l 540nm 1、、磷酸盐缓冲液在常温下容易生长霉菌，放冰箱中保存或临用时现配。 2、样品溶液制备中的注意事项：（1）较透明的样液，如果味茶饮料，将样液充分摇匀后，直接取样测定（2）较浑浊的样液，如果汁茶饮料、奶茶饮料等，称取充分混匀的样液25mL于50mL容量瓶中，加95%的乙醇15mL充分混匀，放置15min，用水定容至刻度，过滤。（3）含有碳酸气的样液，如农夫汽茶，量取充分混匀的样液100mL于250mL的烧杯中，称取其总量，于电炉上加热至沸，在微沸状态下加热10min，以将二氧化碳排除，放冷，用水补足原来的质量，摇匀，

茶叶中茶多酚的提取与含量测定方案(精选.)

设计性实验茶叶中茶多酚的提取与含量测定实验方案新疆农业大学食品科学与药学学院班级：葡工162班姓名：王勇峰学号：220162712 指导老师：阿不都热依木

茶叶中茶多酚的提取与含量测定一.实验目的及要求 1.用无害溶剂从茶叶中提取茶多酚。 2.分离、纯化茶多酚粗品，掌握溶剂提取法提取茶多酚的原理及方法。 3.定量分析茶多酚产品含量。二.实验原理有机溶剂萃取法：有机溶剂萃取法是传统的提取工艺。是利用茶叶中不同化合物在不同溶剂中的溶解度不同进行提取分离。在粗茶叶萃取溶液中，除含有茶多酚以外，还含有咖啡碱、酯质、色素、植物多糖、有机酸、以及悬浮物，且茶多酚含量仅为25%～40% ，所以大多数工艺用乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂反复萃取的方法进一步除杂、纯化、精制。茶水用氯仿萃取可得到水层和有机层，咖啡碱存在于有机层，而茶多酚则存在于水层中，根据萃取及过滤原理，将有机层和水层分别进行浓缩、萃取，即可得到相应粗产物。三.实验仪器及药品仪器：天平；分析天平；铁架台；抽滤装置；超级恒温水浴槽；长颈漏斗一个；滤纸若干张；分液漏斗一个；100毫升的烧杯（三个）；玻璃棒一个；药品： 1.乙醇水溶液（50％）； 2.干茶叶原料； 3.氯仿（分析纯）； 4.Na2SO4溶液馏水

四.实验步骤 1、温度设定:打开超级恒温水浴电源开关，使温度达到90℃ 2、称量：称取30克干茶叶，放在100毫升小烧杯中。 3、溶解：用量筒量取40毫升50％乙醇水溶液，倒入小烧杯中，用玻璃棒轻轻搅拌，使干茶叶完全浸润在乙醇溶液中。 4、加热：将干茶叶和乙醇水溶液的混合液置于超级恒温水浴槽中，加热20分钟。 5、过滤：将加热完毕的混合液取出，冷却到室温；用长颈漏斗对混合液进行过滤，滤除茶叶残渣。再对残渣进行乙醇萃取. 6、分离萃取： 1)对分液漏斗进行试漏，调整好铁架台高度； 2)用量筒量取20毫升氯仿①，置于100毫升小烧杯中；将茶叶滤液倒入分液漏斗中，再将氯仿倒入其中，再倒入少量Na2So4溶液②，轻轻摇匀，使之混合充分，静置，分层，上层应为茶多酚水溶液，呈茶色，下层为氯仿乙醇混合液，为无色。 3)将下层溶液小心放至小烧杯中，上层溶液从分液漏斗上口倒至100毫升小烧杯中； 7、抽滤浓缩：（1）安装好减压抽滤装置；（2）将布氏漏斗里的滤纸用少量茶多酚水溶液润湿，开启抽气阀，一边缓慢倒入液体，一边抽滤。

真菌学实验指导

本课程，本课程是大学本科生物技术、生物科学专业的选修课程。介绍真菌分类现状、分类方法（包括传统与现代分类方法的比较）、分类依据及其原则。本课程的教学不限于介绍研究的成果，重在介绍分析和解决问题的方法，以培养学生分析问题和创新的能力。所以在理论学习的同时开设综合性实验，培养学生观察、分析和动手能力。基本掌握真菌分离、鉴定的方法，并应用于真菌其它领域的研究。本指导书适用于生物技术和生物科学专业。

1、实验：内生真菌的分离及鉴定 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????3 2、实验报告基本内容要求 ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????7 3、实验报告格式????????????????????????????????????????????????????????????????8

实验内生真菌的分离及鉴定实验学时：18 实验类型：综合实验要求：选修一、实验目的 1.了解真菌形态的基本特征。 2.掌握丝状真菌制片方法和真菌鉴定方法。二、实验内容采集植物样品包括叶、茎、根、花、种子或果实，然后对分离样品的内生真菌，并进行形态和分子生物学方法的鉴定。三、实验原理、方法和手段（一）实验原理根据真菌的形态特征和ITS序列等分子证据对分离到真菌进行归类和鉴定。（二）实验手段和方法 1、内生真菌分离纯化方法 1.1样品的表面消毒及预处理分别取根、茎、叶、果实，用洗涤剂在自来水下洗净。老树皮用75%酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于酒精灯上烧灼15秒至表面焦糊，切成1×1cm2大小置于PDA固体培养基上。对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒： 75%的酒精漂（浸）洗2-3min→无菌水冲洗4-6次→0.1%升汞不同的消毒时间（共设置7个梯度）→无菌水冲洗4-6次→用灭菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小块将根、茎的表皮、韧皮部、木质部大致分开，并切成0.5×0.5cm2大小。将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。灭菌时，沥干的植物材料转放到烧杯中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻

茶多酚的功效及在食品中的应用概述

茶多酚的功效及在食品中的应用概述摘要：茶多酚是一种天然的食品添加剂，本文论述了茶多酚的组成及其理化性质，毒理性质，生物活性，药理作用和应用，并展望了今后在食品工业今后的热点研究方向。关键词：茶多酚；天然抗氧化剂；应用；前景 0前言茶多酚安全、无毒、具有多种生物学功效，是一种天然的氧化剂。19世纪中叶，人们就开始对茶叶中的多酚类物质进行研究。上世纪50年代，茶多酚的提取、分离与鉴定等工作发展迅速。60年代初，日本学者探明了茶叶中含有大量的抗氧化活性成分——茶多酚[1]。70年代初，中国农科院茶研所、日本伊藤园中央研究院等科研机构最先从茶叶中成功分离出茶多酚。80年代中期，茶多酚的提取技术有了突破性的进展，并实施了工业化生产。近年来的研究表明，由于茶多酚的特殊生理活性，其研究范围已涉及食品、医药、日用化学品等许多领域。我国于1995年7月，在第十一届全国添加剂标准化技术委员会上，把茶多酚正式列为食品添加剂，并作为我国“九五”重点科技攻关项目而使得茶多酚在食品领域的研究应用备受关注。随着国际上相继宣布禁止BHA(叔丁基经基茵香醚) 和BHT ( 2，6一二叔丁基一4一甲基苯酚) 等合成抗氧化剂在食品领域，特别是在植物油、脂肪、蛋白质中的使用，更奠定了茶多酚在目前以及未来作为食品主要抗氧化添加剂的地位。 1茶多酚的组成及其理化性质 1.1化学组成茶多酚(Tea Polyphenols，简TP )是茶叶中多酚类物质的总称，又称茶鞣或茶单宁。它包括黄烷醇、羟基一黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以黄烷醇类物质(儿茶素)最

为重，约占TP总量的60~80%。儿茶素类主要有：表儿茶素(Ec) 、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG) 和表没食子儿茶酸酯(EGCG) 4大类。其中EGCG含量最高，占儿茶素的50 %左右。儿茶素结构中至少A、B、C三个环核，是2-苯基苯并吡喃的衍生物茶多酚[2]。 1.2理化性质茶多酚为灰白色粉状固体或结晶。具涩味、易溶于水、乙醇、乙酸乙酯。微溶于油脂。略有吸潮性，在潮湿的空气中能被氧化成棕色产物。作为一种天然抗氧化剂。茶多酚具有以下基本特点：抗氧化效力强，对油脂的氧化抑制率达96％以上，强于维生素E 和维生素C；对动物油脂具有抗氧化作用；与维生素E和维生素C 具有协同作用；能提高维生素和胡萝卜素的稳定性；对酸和热较稳，p H 2~8稳定，p H > 8和光照下易氧化聚合；遇铁变绿黑色络合物；安全性高；具有抑菌作用；能清除自由基，抑制亚硝酸盐的形成，有抗突变、抗癌变等功效[3]。 2茶多酚的毒理性质慢性毒性试验表明[4]，饲料中茶多酚含量为0.1％时，对果蝇寿命无不良影响。其致突变的Ames试验、骨髓微核试验、骨髓细胞染色体畸变试验及果蝇SLRL诱变试验结果均为阴性。果蝇终生饲养和小白鼠喂养实验表明，在适量范围内添加茶多酚到饲料和饮料中，对果蝇的生长、发育和寿命，以及对小白鼠的血红蛋白、红细胞数、自细胞数、胸腺、脾脏细胞数、肝脏量及体重有促进作用。说明茶多酚在适当范围内应用到食品和化工等领域中，对人体是无害的。 3生物活性 TP由于具较强还原力、生物大分子(如蛋白质、多糖)结合力及与金属离子配位等特性,有多种生物活性。 3.1高效清除自由基

茶叶中茶多酚含量测定方法的研究

化学工程与装备 2012 年第 5 期152 Chemical Engineering amp Equipment 张妙芬：茶叶中茶多酚含量测定方法的研究2012 年 5 月分析测茶叶中茶多酚含量测定方法的研究试张妙芬（泉州市环境监测站，福建泉州 362000）张妙芬：茶叶中茶多酚含量测定方法的研究摘要：茶多酚是茶叶中重要的成分，随着茶多酚应用的开发，其分析方法也在不断地提高和完善。该文在查阅近年来国内外相关文献的基础上，对茶多酚含量的分析测定方法进行了综述，概括介绍了用于测定茶多酚含量的光度法、色谱法、电化学法等化学分析测定方法，以期为今后茶多酚的分析测定研究提供参考。关键词：茶叶；茶多酚；测定方法茶叶源于中国，传播于世界。目前，中国茶园面积列居可分为四类：儿茶素类、黄酮及黄酮醇类、花白素和花青素世界首位，产量居世界第二位。随着科学技术发展，迄今已类、酚酸类。其中含量最高的是儿茶素，占多酚类总量的在茶叶中鉴定出 450 种以上的有机成分和 15 种以上的无机 60-80，是其众多药效的物质基础。茶叶中的儿茶素类又元素。可分为三种游离型态（Catechin，C Epicatechin，EC 以1 茶多酚，与两种酯化的没食子酸及Epigallocatechin，EGC）茶多酚（Tea Polyphenols）又称茶鞣或茶单宁，占茶（Epicatechin gallate，ECG 及（gallic acid）叶重量的 15％～30，许多生理和药理实验

表明它对人体无，后者（ECG 及 EGCG） Epigallocatechin gallate，EGCG）毒，无副作用，是一种天然、高效、安全的抗氧化剂，它还含量较多。具抗衰老、抗辐射、消除口臭、降血脂、抗菌抑菌、抑酶等茶多酚为白色晶体，易溶于水及有机溶液，味苦涩。在一系列重要作用。 pH 48 稳定，遇强碱、强酸、光照、高热及过渡金属均易茶多酚是由 30 多种含酚基的物质组成，按其化学结构变质。图 1 为茶多酚结构通式。 OH OH OH O R1，R2 -H，-OH， C OH HO O R2 OH R1 O OH 图1 茶多酚的结构通式2 茶多酚的测定方法 2.1.1 酒石酸亚铁比色法茶多酚的分析测定方法，近年来有很多报道，其中多以茶多酚总量的测定，国内文献报导中以酒石酸亚铁比色分光光度法，高效液相色谱法为主。分光光度法包括紫外- 法最为常见GB/T 83132002。该法也是测定茶多酚含量的可见分光光度法、原子吸收分光光度法等，它们广泛应用于国标方法。茶汤中茶多酚的分析。另外，气相色谱法、毛细管电泳法、其测定原理是茶多酚类物质能与亚铁离子形成紫蓝色高锰酸钾滴定法、红外吸收光谱法等亦可用来茶多酚的分析络合物，该溶液对 540nm 可见光有最大吸收，故可用分光光测定。度计测定其吸光度，通过计算确定茶水中茶多酚的含量。计2.1 分光光度法算公式为：张妙芬：茶叶中茶多酚含量测定方法的研究153 呈良好线性关系。常用的分光光度法对浓度很高

茶多酚在食用植物油中的应用

茶多酚在食用植物油中的应用山东鲁花集团有限公司王珊珊

一、茶多酚的概述茶多酚(teapolyphenols简写TP)是形成茶叶品质的重要成分之一,是一类存在于茶叶中的多羟基酚性化合物的混合物,俗称茶单宁、茶鞣质。茶多酚是从绿茶中提取出来的最主要、最精华、对人体最有益的成分,是由茶叶中的黄烷醇类、黄酮、黄酮醇类、花青素类、茶白素类和酚酸及缩酚酸类组成的化合物,主要成分是黄烷-3-醇衍生物,俗称儿茶素。这些儿茶素类化合物由于其分子中富含酚性羟基可以有效地终止脂肪氧化的连锁反应,因此在油脂及其制品中添加儿茶素类物质,能够防止或延缓油脂的氧化酸败二、茶多酚的功效及其应用茶多酚安全、无毒、具有多种生物学功效，是一种天然的氧化剂，我国于1995年7月，把茶多酚正式列为食品添加剂，并作为我国“九五”重点科技攻关项目而使得茶多酚在食品领域的研究应用备受关注。随着国际上相继宣布禁止BHA和BHT等合成抗氧化剂在食品领域，特别是在植物油、脂肪、蛋白质中的使用，更奠定了茶多酚在目前以及未来作为食品主要抗氧化添加剂的地位。 1、药理作用 ?清除活性氧自由基，阻断脂质过氧化过程，提高人体内酶的活性，从而起到抗突变、抗癌症的功效。 ?防治高脂血症引起的疾病，增强微血管强韧性、降血脂，预防肝脏及冠状动脉粥样硬化。 ?提高人体的综合免疫能力的功效 ?其它保健治疗功效：抗脂质过氧化，预防衰老；对重金属盐和生物碱中毒的抗解作用；防辐射损伤，减轻放疗的不良反应；防龋固齿和清除口臭的作用。

2、茶多酚在食品上的应用 ?油脂：动植物油脂中含有一定的饱和脂肪酸，因此容易氧化而发生酸败变质，其过程为自由基的引发、传递、终止的链式反应机理，茶多酚的抗氧化作用是由于有较强供氢体的活性能够提供大量氢质子与脂肪的游离基结合，消耗脂肪酸的游离基，从而中断连锁反应，达到油脂抗氧化的目的 ?肉制品加工和水产品保鲜：肉制品和水产品在保存期间常常因脂肪氧化和微生物滋生导致颜色变黄继而出现腐败味。而茶多酚具有极强的抗氧化和杀菌防腐性能。 ?糕点和糖果;茶多酚在糕点和糖果类食品中的应用主要是由于其具有的抗菌作用和抗氧化性能。糕点中加入茶多酚不仅能阻止其色变，抑菌、延长保鲜期，同时对糕点的品质有很大的改善。糖果中加入茶多酚，能起到抗氧化保鲜、固色固香、除口臭等作用。另外，茶多酚还可使高糖食品中的“酸尾” 消失，使口感甘爽。 ?饮料生产：茶多酚不仅可用来配制各种茶饮料，还能抑制果汁饮料中V A和V C等多种维生素的破坏，从而保护饮料中的各种营养成分。 3、茶多酚在食品工业发展前景 TP广泛用于粮油食品、水产品、调味品、糖果饮料等，对油脂、肉类及其腌制品、高脂肪糕点及乳制品、新鲜水果和蔬菜都有很显著的保鲜防腐、护色增香，可以保护食品中营养成分、提高纤素稳定性等。TP作为抗氧化剂和加剂用以防止和延缓脂质的氧化或酸败，作为食品防腐剂沉淀菌体蛋白，使菌体蛋白变形而失活。目前研究的热点主要是通过保留茶多酚的活性基团而使其改性，以解决茶多酚在应用中所遇到的实际问题，使其在食品工业中得到更加广泛的应用。相信随着研究的深入，TP的更多功能效用也将被更深入更全面的探究。