抗原抗体的反应

2.凝胶扩散沉淀
抗原抗体可在半透明的半固相介质中进
行沉淀实验。抗原分子和抗体分子在凝胶 介质中自由扩形成浓度梯度，抗原与抗体 在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀 线。凝胶沉淀可用于测定抗原或抗体的相 对浓度，也可用于比较不同抗原的特异性、 纯度及相互关系。最常用的方法为单向免 疫扩散(radial immuno diffusion )和双向 免疫扩散(double－immunodiffusion)。
ELISA有直接法、间接法及夹心法等不同反应方式。直接法(direct ELISA)是指用酶标记的抗原或抗体直接检测包被在酶标板上的抗体或抗 原，被检抗原或抗体的量与产物颜色成正比(图7—18A)；间接法 (indirect ELISA)是将酶标记在第二抗体上，当抗原与第一抗体结合后， 再用酶标第二抗体来检查第一抗体是合与抗原结合。有酶底物显色的反 应为正反应，反之为负反应(图7—18B)。夹心法(sandwich ELISA)先用 一种未标记的抗体包被酶标板，用于捕获抗原分子，再用标记的具有相 同抗原特性但来源于不同种类动物的抗体与之反应。也可用间接法中的 第二抗体进行该项反应(间接夹心法)(图7—18C)。夹心法可用于检测抗 原，尤其是小分子的抗原，也可以用于检测抗体。
用酶标记的第二抗体进行间接ELISA，避免了用酶标记每一种抗原 或抗体的复杂过程，因而得到更广泛的应用。常用的羊抗鼠IgG、羊抗 免IgG 及羊抗人IgG 的酶交联物已经商品化，可根据需要选择合适酶 标第二抗体。不同的酶催化的底物不同，显色产物的吸收波长也不一 样(表17—4)。酶标比色仪呵进行光吸收的测量。
稀土元素的荧光激发波长范围较宽〔300— 380nm)，有利于增高激发能，提高标记抗体的灵敏性； 而发射波长很窄(613nm)，造成激发波长和发射波长之 间的差别很大(270nm)，有利于降低背景，利用干涉滤 片排除散射荧光的干扰。
免疫利用共沉淀是抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细 菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白) 的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先 结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应 后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低 速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原 分离。
单向扩散法又称Mancini 法，将适当浓度的抗体 混于琼脂(0．8％—1％)中，琼脂凝 固后，打成小孔，加入抗原，抗原由小孔开始向 周围扩散，并在小孔周围合适的位置形成沉 淀环。沉淀环的面积与抗原浓度呈正相关。通过 与已知抗原浓度形成的沉淀环面积进行比较，可 确定被测抗原的浓度(图7—11)。单扩散常用于测 定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。 单扩散法的特点使用抗体浓度大，当抗原浓度低 于5—10μg／mL则不适用。
放射标记的抗原或抗体可直接用于抗原抗体反应，形成的抗原抗 体反应复合物，用第—抗体或聚乙二醇沉淀分离后，测定其放射 活性．用于定量抗原或抗体。为了提高灵敏度，应用竞争法进行 抗原或抗体定量，其放射活性与被测抗原或抗体呈反比(图7—17)。
2．酶联免疫吸附试验 同位素标记的免疫分析方法，虽然有较高的灵敏度，但同位 素具有不稳定，需要特殊设备。安全性差，废物处理麻烦等 缺点限制了其使用。非放射性标记方法逐步得到发展，其中 酶标记免疫试验是广泛使用的方法。因酶促反应使测定的结 果被放大，反应的灵敏度接近放射免疫分析法。用于标记的 酶的种类也越来越多，较常用的有碱性磷酸酶 (alkalinephosphatase)、辣根过氧化物(horseradish peroxidase)、β半乳糖苷酶β—galactosidase)和脲酶 (urease)等。酶免疫试验法(enzyme immunoassay，EIA)有两 类方法，一类为均相法，即抗原与抗体反应后，不必将结合 的与游离的抗原或抗体分离，就可测定被测分子的含量。如 酶放大免疫分折技术(enzyme multiplied immunoassay， EMIT)，将小分子抗原连接在酶分子的活性位点附近，当抗体 与这些抗原结合后，封闭了酶催化位点，使酶失去活性。
3．荧光与发光免疫分析 用于标记抗体的荧光化合物有异硫青荧光素(FITC)和罗
丹明(rhodamine)荧光素等，适用于抗原细胞和组织的定位 分析。近年来用稀土元素(镧系元素)的铕离子(Eu3+)、铽离 子(Tb3+)等代替荧光素标记抗体，将时间分辨技术引入生物 检测领域，建立了时间分辨荧光免疫分析法(time— resolved fluorommunoassay，TrFIA)，明显提高了荧光免 疫分析技术的灵敏度和特异性。
二、免疫标记
1．放射免疫分析 放射免疫分析法(radio—immunoassay，RIA)的应用始于60年 代末，广泛用于激素、药物等小分子化合物的定量分析，是灵敏、
可靠的免疫分析方法之一。常用来标记抗原或抗体的同位素有 125I，131I，3H和35S。放射活性的检测液相反应体系用液体闪 烁仪计数，而固相体系可用X射线胶片显影。 125I 为γ 射线(0.035meV)，131I 有硬β 射线(0.608meV)和γ 射 线(0.36meV)两种，半衰 期为60 d，放射性碘标记常用氯胺T法(chloramines—T)。氯胺 T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子 (I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及 酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑基共价相连，使之发生碘化反 应。
双扩散法又称为Ouchterlony法，在琼脂板中抗原和抗 体分别从相邻的孔中向四周扩散，在抗原孔和抗体孔之 间二者比例合适的部位形成沉淀线。琼脂双扩散常用于 分析抗原间的血清学关系和抗体间差异，相邻孔中不同 抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化显示抗 原间是否存在共同的抗原决定簇。当两个抗原完全—致 时，两条沉淀线完全融合(图7—12A)；如果两个抗原无 共同抗原决定簇而抗血清中有针对两种抗原的抗体时， 沉淀线互不干扰，呈交叉状(图7—12B)；当两个抗原只 是部分抗原决定簇相同，还有其他不同的抗原决定簇， 则沉淀线在后者一方形成突出的小刺(图7—12C)。此外， 根据抗体或抗原的不同，可形成其他不同特征的沉淀线。 Ouchterlony法灵敏度不高，形成沉淀线需较长时间 (18—24h)。但在抗原分析方面很有实用价值。
如果被测溶液中元相应抗体，则酶能催化底物形成产物。同一标记物 也可以竞争方式检测抗原的含量，另一类为固相法，即将抗原或抗体 吸附在固相表面，如聚苯乙烯微量板，磁珠等表面，抗原与抗体反应 后，将固相与液相分离除去游离的抗原或抗体，而结合的抗原或抗体 上被标记的酶仍保持活性，催化底物形成有色产物，即酶联免疫吸附 试(enzyme—linked immunosorbent assay，ELISA)。
火箭电泳(rocket electrophoresis)，为单向免疫扩散与电泳 结合的一种方法。已混合有抗体的凝胶上，做一小孔，加入 抗原，电泳后，沿着电泳方向形成火箭型沉淀线，沉淀线的 高度与抗原量成正比(图7—14)。火箭电泳可用于定量测定， 例如用于测定人血清中的甲胎蛋白。
4.免疫共沉淀
3．免疫电泳
免疫扩散沉淀形成需较长时间，且灵敏度低。免疫电泳 （immunoelectrphoresis）是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移 率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方 法。这种方法能提高分辨率和灵敏度。混合的蛋白质抗原在 PH 8．6时带负电荷，在电场的作用下，由负极向正极迁移， 使混合的抗原组分得以分离，而抗体可以通过自由扩散，也可 以通过电泳与分离的抗原形成相应的特异性沉淀线。从而提高 免疫沉淀的灵敏度。常见的免疫电泳方法有血清免疫电泳，火 箭电泳和对流免疫电泳(又称电渗析)。传统的免疫电泳即指血 清免疫电泳，将抗原混合物(病人血清)在凝胶中用电泳分离后， 沿电冰方向挖一平行的小槽，加入抗血清，进行双扩散。沉淀 线的特点显示病人血清与正常人血清存在的差异，即血清蛋白 组分的缺少或增加(图7—13)。
这类免疫分析的方法可以用于医学，免疫学中抗原抗 体的分析(包括病原的诊断，免疫细胞表面分子的检 测等)，而且可以广泛的用于生命科学的几乎各个领 域，甚至于食品科学，环境科学及分析化学等更为广 泛的学科领域。
一、免疫沉淀与免疫凝集
1．溶液中的沉淀反应
在体外，当抗体与相应抗原二者浓度比例适当时，会发生 免疫沉淀(immunoprecipitation)反应，表明两者之间有特 异性反应。免疫沉淀反应广泛用于抗原或抗体的定性及定 量分析。在液相中形成的沉淀不易观察判断，利用抗原和 抗体溶液之间的界面形成的沉淀线便于判断，即环状沉淀 试验(ring precipitant test)(图7—l0)。沉淀试验可以在玻璃 管中进行，将小试管或毛管的底部加入抗原溶液，在上层 轻轻铺上不同稀释倍数的抗体溶液，勿使界面破坏，为了 使界面更好地形成，常在下层抗原溶液中加入10％的蔗糖 或甘油。抗原抗体溶液置于37℃或4℃孵育后，在界面上形 成白色沉淀线。玻片上沉淀的形成必须在显微镜下观察。
斑点酶免疫试验(dot—ELISA)：ELISA 一般是在液相中进行酶底 物显色反应的，所以反应产物都是有色的可溶性化合物，便于用光吸 收法测定反应的强度。dot—ELISA的原理与普通ELISA相同，只是把 反应全部移到硝酸纤维素膜上进行，而不是在聚苯乙烯酶标板上进行。 即把抗原、第一抗体、第二抗体都依次加到膜上，洗脱未反应物及封 闭反应物以外的膜表面都与普通ELISA相同。最后的显色反应是用另 外一类底物，这类底物反应的产物是不溶于水的有色沉淀物，如碱性 磷酸酶的底物要用BCIP／NBT，而不能用pNPP。根据膜上沉淀物颜色 有无与深浅判断反应的正负和量的多少。斑点扫描仪也可以帮助定量。 dot—ELISA的优点是灵敏度比普通ELISA高10—100倍，与放射免疫的 灵敏度水平相当。
第七章 抗原抗体反应的应用
免疫沉淀与免疫凝集 免疫标记 免疫定位分析 抗原抗反应的其他应用