Waterse高效液相色谱仪操作规程
W a t e r s e2695高效液相色谱仪操作规程
1目的
指导和规范Waterse2695高效液相色谱仪的操作。
2适用范围
该操作规程适用于Watere2695高效液相色谱仪的操作。
3职责
检验员应按操作规程进行仪器操作，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。
4操作
4.1仪器组成和开机
4.1.1仪器组成
本仪器由Waterse2695分离单元、Waters2998二极管阵列检测器、WatersELSD2424
蒸发光散射检测器、Empower3色谱工作站和打印机组成。
Waterse2695分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气，可
容纳120个样品瓶的自动分离单元，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘；显示器，键盘用户界面。
4.1.2开机
4.1.2.1依次接通Waterse2695分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。
4.1.2.2接通Waterse2695分离单元后，约20s仪器开始自检，约3mn内各部件的
初始化完成，待主屏幕上方标题区出现“Idle”时，仪器进入待命状态。
4.2溶剂管路系统的准备
4.2.1流动相脱气
确认所有溶剂管路都充满溶剂，按[Menu／Status】，进入“Status(1)”屏幕，光标选“Degasser”，按[Enter】。
4.2.2灌注
当色谱仪流路没有溶剂或系统中有空气时，需进行干灌注(DryPrime)，注入流动相。
否则，进行湿灌注(WetPrime)以驱除气泡。干灌注：按主机面板上[Menu／Status】，进入“Status(1)”显示，按[DirectFunction】，选择“DryPrime”，选溶剂通道，如OpenA，选“DurationIIi按数字键输入5分钟，按”COntinue”，待限定时间结束后，重复操作，使所需的溶剂通道注满流动相。湿灌注：进入“Status(1)”显示，选溶剂通道，输入100％，按[Direct Function]，选“WetPrime”，按【OK】，根据面板提示设置流速及时间(默认流速为7．5ml
／min，一般不用更改，时间可设置为5min)，按【0K】。
4.3样品管理系统的准备
4.3.1冲洗自动进样器
在“status(1)”，屏幕下，光标选“Composition”，输入流动相的组成。按【DirectFunction]，光标选“PurgeInjector”，按【Enter]，显示“PurgeInjector”屏幕，输入“SampleLoopVolumes 6．0”，光标下移“CompressionCheck”，按任意数字键，按【OK]。
4.3.2冲洗进样针
在主屏幕下，按【Diag]，显示“Diagnostics”屏幕，按【PrimeNdlWash】，显示“PrimeNeedleWash”屏幕，按[Start]，30s内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit】。
4.3.3冲洗柱塞杆密封垫
在主屏幕下，按【Diag]，显示”Diagnostics”屏幕，按【PrimeSealWash】，显示“PrimeSealWash”屏幕，按[Start]，30s内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit】。待排放口有水流出，按【Half】、【Close】、【Exit】。
4.3.4装入样品与转盘
打开样品舱门，显示"DoorisOpen"屏幕，将样品盘取出，把样品瓶插入样品盘后，装
入样品盘，按【Next】直至所有样品盘装毕，关好舱门。
4.4色谱柱平衡
换上检验所需的色谱柱和流动相，进入"Status(1)”显示，选择流路、设定流速、柱温，
按【Enter】开始注入流动相，通常情况下约15～30分钟色谱柱可达到平衡，可以开始进样，采集数据。
5Empower3软件的应用
5.1建数据采集方法
5.1.1双击电脑屏幕上的"Empower"快捷图标，出现Empower登录界面，输入用户名
和密码。
5.1.2单击高级键，选择用户类型和QuickStart界面。
5.1.3选择QuickStart界面，点击“确定”，然后选择选定的操作项目以及色谱系统(仅
查看数据可选择色谱系统中的“没有系统”)，单击“确定”。
5.1.4登录Empower的QuickStarlt界面。
5.2编辑仪器方法和方法组（以e2695_2998为例）。
5.2.1．采集栏单击“方法组编辑向导”：
5.2.2选择“新建”选项。
5.2.3弹出仪器方法编辑器。
5.2.4单击“2695”，弹出2695编辑界面。
5.2.4.1Aliance系统(包括2695、2795和2695D)通用编辑页面中，可选择“单次输送
体积”，请针对不同的流速选定适当的单次输送体积，以确保最佳的流速精度与准度。
5.2.4.2查看脱气选项，确认设置正确。
5.2.4.3流量选项中设置“泵模式”、“总流量”以及流动相配比。
5.2.5单击2998，弹出2998编辑界面。
5.2.5.13D数据采集：在通用栏中选择启用3D数据，输入检测波长的范围；
5.2.5.2采集2D数据，点击“2D通道”，最多可同时采集8个不同波长的通道的数据。
5.2.6点击“文件”，选择“另存为”：输入仪器方法名称，点击“保存”；点击“文件”，
选择“退出”。
5.2.7在被选项中选择所需的仪器方法名称，点击“下一步(N)”。
5.2.8在下拉菜单中选择所需的处理方法和报告方法（如果没有合适的方法选择“无处理”、“无报告”)，点击下一步。
5.2.9输入方法组名称，单击“完成”。
5.3进样
点击进入“平衡系统／监视基线”界面，选择相应的仪器方法，点击“平衡／监视器，
在监视窗口监视基线至系统平衡，停止系统监视状态，点击“进样”。
5.3.1．单进样：点击，进入“定义单进样参数”编辑界面，输入样品名、功能、方法组
等参数，点击“进样”。
5.3.2使用向导建立样品组和样品组方法。
5.3.2.1选择“运行样品”，然后单击“样品队列”，进入样品列表。
5.3.2.2单击“新建样品组向导”，建立样品组。
5.3.2.3选择创建样品组方法类型为“Lc或PDA”，然后点击“定义样品板”。
5.3.2.4在“选择标准进样在那里开始”中选择合适的选项。检查开始加载样品瓶的位置
是否正确，点击“下一步”。
5.3.2.5在描述标样中需要设置一下内容：样品组中的标样数：×；每瓶标样进样次数：X；进样体积：x；运行时间：XX；方法组XXX；点击“选项”：输入下一进样延迟时间X；点击下一步。
5.3.2.6样品数：X；每瓶样品进样次数：X；进样体积：X；运行时间：X；方法组X；点
击选项：输入下一进样延迟时间X；点击下一步。
5.3.2.7在识别标准样界面中，输入标样名称，增量后缀使用1．在识别样品界面中，输入样品名称，增量后缀使用a。点击下一步。
5.3.2.8运行模式选项中选择“只测试”。查看摘要，点击下一步。【注：弹出组分编辑器，输入标样中每个组分的名称(内标不需要输入含量)。可以直接关闭该窗口，在处理数据的时候再添加】。
5.3.2.9点击完成，在菜单栏中选择文件。
5.3.2.10为方法组命名并保存样品组方法。
5.3.2.11单击“样品队列”，打开运行样品窗口，点击运行当前样品组方法键，选择运行。
5.3.2.11选择需运行的样品组名称，点击运行。
5.3.2.13样品组运行过程中，在“正在运行”栏中正在运行以及运行完毕的样品以红色
显示。(注：以向导建立的样品组首行功能一般为清除校正，一般在运行样品前删除该行或改为“平衡”。)
5.4建立数据处理方法
5.4.12D数据处理方法
5.4.1.1单击“浏览项目”键，在“样品组”中选择目标样品组。
5.4.1.2在样品组上点击鼠标右键选择“查看相关→通道”，样品组在单个通道中显示。
5.4.1.3选择定最低浓度的标样，点击鼠标右键，选择下拉菜单中的查看，会显示未处
理的色谱图形。
5.4.1.4点击处理方法向导快捷键，选择创建新处理方法，点击确定。
5.4.1.5确认处理类型为LC，积分方式可选择为传统，再点击使用处理方法向导，选择
确定。
5.4.1.6常按鼠标左键，选择色谱图上最窄峰。(注：在色谱图区域方可以放大某个需
要监测的峰。点击鼠标右键全视图可以还原色谱图。)
5.4.1.7在色谱图的积分界面选择一段典型基线作为积分的阈值，点击下一步。
5.4.1.8常按鼠标左键，在基线上选取积分的起止时间点。
5.4.1.9建议选择最小峰高，选择所要积分的高度最小峰(或键入相应数值)。小于此
峰高90％的峰将不被积分。点击下一步。
5.4.1.10定量方法选择面积，组分信息选择含量，校正类型选择线性。点击下一步。
5.4.1.11跨通道内标样界面点击否。
5.4.1.12因为选择的是标样，点击峰1可以看到一个下拉菜单选择相应的组分名称或
者键入运行样品相应的名称。添加组分名称相匹配的标准含量，然后点击下一步。
5.4.1.13如果是多点校正样品，跳过添加含量的窗口直接点击下一步。(单点校正可在
这里添加含量)。
5.4.1.14选择外标法：
5.4.1.15选择单一内标样，需要在下拉菜单中选择或键入内标相应的名称，然后点击
下一步。
5.4.1.16选择多重内标需要输入所有内标的名称。
5.4.1.17为处理方法命名，点击完成。色谱图界面会显示该处理方法应用后的色谱结
果，包括积分。
5.4.1.18如需为积分方法添加积分事件，鼠标右键点击色谱图窗口，选择添加积分事件。积分事件所示功能会立刻应用于处理方法中。
5.4.1.19编辑处理方法的高级功能需要选择快捷键。有任何更改均需再次保存处理方
法。
5.4.1.20点击峰表底部可预览2D通道和峰。
5.4.1.21点击“浏览项目”键，选择“通道”或“样品组”标签栏，右键点击目标样
品组或通道并选择处理。
5.4.1.22在处理界面，选择使用指定的处理方法，选择相应的处理方法名称，点击清
除校正，选择校正并定量。
5.4.1.23点击确定，数据处理，产生结果。可在结果栏中查看。
5.4.2建立3D数据处理方法
5.4.2.1点击“浏览项目”键，在“样品组”中选择目标样品组。
5.4.2.2在样品组上点击鼠标右键选择查看相关通道，样品组中各个数据在单个通道中
显示。
5.4.2.3选择定量最低浓度的标样，点击鼠标右键，选择下拉菜单中的查看。
5.4.2.4在预览界面选择“轮廓线”标签栏，会显示未处理的轮廓图。
5.4.2.5从处理或右键下拉菜单中选择提取色谱选项。
5.4.2.6键入所需要提取的波长，按回车键，得到该波长的色谱图。
5.4.2.7点击处理方法快捷键，选择创建新处理方法，确认处理类型为PDA，积分方式
可选择为传统，再点击使用处理方法向导，点击确定。
5.4.2.8常按鼠标左键，选择色谱图上最窄峰。(注：在色谱图区域内可以放大某个需
要监测的峰。点击鼠标右键选择全视图可以还原色谱图。)
5.4.2.9在色谱图的积分界面选择一段平滑的基线作为积分的阈值，点击下一步。
5.4.2.10常按鼠标左键，在基线上选取积分的起止时间点。
5.4.2.11建议选择最小峰高，选择所要积分的高度最小峰(或键入相应数值)。小于此
峰高90％的峰将不被积分。点击下一步。
5.4.2.12定量方法选择面积，组分信息选择含量，校正类型选择线性。点击下一步。
5.4.2.13跨通道内标样界面点击否。
5.4.2.14因为选择的是标样，点击峰1可以看到一个下拉菜单选择相应的组分名称或
者键入运行样品相应的名称。添加组分名称相匹配的标准含量，然后点击下一步。
5.4.2.15如果是多浓度点的一组标样，跳过添加含量的窗口直接点击下一步。(单一浓
度可以在这里添加含量)。
5.4.2.16选择外标法：
5.4.2.17选择内标法单一内标样校正，需要在下拉菜单中选择或键入内标相应的名称，
然后点击下一步。
5.4.2.18选择多重内标需要输入所有内标的名称。
5.4.2.19PDA纯化及匹配选项：
5.4.2.20为处理方法命名，点击完成。色谱图界面会显示该处理方法应用后的色谱结
果，包括积分。
5.4.2.21在“文件”下拉菜单中选择“另存为”方法组，将该处理方法存入方法组。(注：3D数据必须用方法组处理。)
5.4.2.22如需为积分方法添加积分事件，鼠标右键点击色谱图窗口，选择添加积分事
件。积分事件所示功能会立刻应用于处理方法中。
5.4.2.23编辑处理方法的高级功能需要选择快捷键。
5.4.2.24点击“浏览项目”键，选择“通道”或“样品组”标签栏，右键点击目标样品组或通道并选择处理。
5.4.2.25在处理界面，选择使用指定的处理方法，选择相应的处理方法名称，点击清
除校正，选择校正并定量。
5.4.2.26点击确定，数据处理，产生结果。可在结果栏中查看。
6查看结果和视图筛选
6.1选择“结果”标签栏，使用视图筛选器从下拉菜单中选择今天。
6.2选择需查看的结果，右键点击选择查看。
6.3查看结果点击快捷键，查看每个组分的校正曲线。切换至主窗口点击。
7预览结果并创建报告方法
7.1点击“预览项目”切换回结果表显示状态。
7.2选中一个或多个结果，点击鼠标右键选择预览。
7.3若选取一个结果，在预览窗口选择使用一下方法：使用缺省单个报告，单击确定。
7.4预览报告并查看数据。点击“编辑方法”键修改报告方法。
7.5双击色谱图或峰结果表编辑报告属性。
7.6点击文件，选择保存，为新建的报告方法命名。点击预览报告。
7.7如需将报告保存为PDF格式，点击。
8方法组的建立
以上讲解了如何建立仪器方法、处理方法和报告方法，组合可以得到一个方法组。
8.1监视区单击方法组编辑向导：
8.2弹出新方法组：选择仪器方法界面。选择相应的仪器方法，点击下一步。
8.3选择缺省方法界面选择相应的处理方法和报告方法，导出方法缺省。点击下一步。
8.4命名方法组，点击完成。
8.5在运行样品时，方法组／报告方法中调用该方法组，可以自动完成采集、处理、报
告数据流程。
9数据管理
9.1项目的备份
9.1.1在QuickStart界面，选择菜单“管理一备份当前项目”。
9.1.2出现“项目备份向导”，点击下一步。
9.1.3出现“项目备份向导一选择目的地’’通过浏览选择目的地，建议选择在非操作系
统安装的硬盘分区内。选择完成，单击“确定”关闭后，回到项目备份窗口，单击“下一步”。
9.1.4出现“项目备份向导一备份显示”。确认数据的复制已经成功，再单击“下一步”。9.1.5出现备份数据向导一开始界面。点击完成，结束备份。
9.2项目的还原
9.2.1在QuickStart界面，选择菜单“管理”，下拉菜单中选择“还原项目”。
9.2.2出现“还原项目向导”。通过“浏览”选择被还原的项目所在的路径，单击“确
定”。
9.2.3单击下一步。
9.2.4如出现类似以下内容的对话框(项目名test已经被使用。请输入另一个项目名)，
则需为还原的项目另起一个名字。
9.2.5在“输入磁盘空间配额’’页中，输入项目名，并注意此处的“表空间配额”应不
得小于欲还原的项目原有的配额(数据文件大小)，然后单击“下一步”。
9.2.6如果需要，可以在此页面中，选择该项目是否属于某个父项目。
9.2.7在“还原显示’’中，如果出现如下对话框(还原的项目需要被更新到下一个版本)，
单击“确定”。(注：当还原由Millennium或Empower的先前版本创建的项目时，需要为该项目选择时区。)
9.2.8在“还原显示”中，等待数据还原结束后，单击“完成”。(注：提示：在重装Empower 软件之后，可以通过还原项目将相关的项目数据进行还原。)
10项目管理
10.1新建项目
10.1.1进入到Empower3的QuickStart界面。在菜单中选择“管理一创建新项目”。
10.1.2出现“新项目向导”的对话框，选择新建项目的父项目：
10.1.3单击“下一步”，弹出“新建项目向导一表空间”，表空间50MB为默认设置，可
根据需要增减。
10.1.4出现“新建项目向导一选项”页。选择用于本项目的选项，如果无法确定适当的
设置，请接受默认选项。单击“下一步”。
10.1.5新建项目向导一访问控制：根据需要选择设置对您所创建的项目具有访问权限的
用户和用户组，或者接受缺省的选项，然后单击“下一步”。
10.1.6新建项目向导一复制所选项：需要选择复制的项目，一般选择Defaults项目。(注：此页的复制是指从另一个项目复制现有设置，可以复制项目的“视图筛选器”、
“白定义字段”、“方法”和“参数”。所以，一般不允许更改或使用Defaults项目中的任何数据。)
10.2查看及更改项目属性
在建立了新项目以后，可以根据需要在不同的项目之间进行切换。
10.2.1进入Empower3的Quick$tart界面，选择菜单“管理一改变系统／项目”。
10.2.2改变系统／项目：根据需要进行选择项目或者选择系统(如果存在二个或者二个
以上的系统)。选择完毕后，单击确定。
如果选择了“在该窗口切换项目／系统”，当前的项目／系统会被新选中的项目／系统所替代，如果选择了“为项目／系统打开新窗口”，则会为选中的项目重新打开另外一个QuiekStart的界面。
10.2.3在新的项目／系统的QuickStart界面内即可进行下一步的操作。
10.3系统配置
10.3.1在QuickStart界面，选择菜单“视图一系统”，查看系统。
10.3.2出现系统信息窗口。
在该窗口中，可以在地址栏中查看显示的地址是否与仪器的设置相同。此外，可从“仪器”选项卡里的“正常”一栏中查看仪器状态，在正常状态下，应显示“是”字样。
如有仪器在“正常”一栏出现“否”，可单击“扫描仪器”进行检查。如检查后显示“是”，即恢复正常。(注：当仪器联机出现错误，或者出现“仪器出错”字样的时候，即可通过采集服务器属性来查看仪器状态，判断可能引起该问题的原因。)
10.3.3创建或连接到新的色谱系统
10.3.3.1在QuickStart界面，选菜单“管理一新建系统”。
10.3.3.2出现“新建色谱系统向导一输入类型”页面，选择系统类型为“新建系统”。
然后单击“下一步”。
出现“新建色谱系统向导一选择系统”页面，在“可用仪器”组中，选中新系
统的组件，然后用鼠标拖拽至右侧“新系统仪器”组中。选择完毕，单击“下一步”。如有
误选，则如法，将误选的新系统仪器，用鼠标拖拽回“可用仪器”组中。(注：可重复使用已配置系统中的仪器，但一次只能有一个使用共享仪器的系统可以在线。)
出现“新建色谱系统向导一访问控制”页面。(注：您创建系统时，您即为系
统的所有者。系统创建后，可以修改系统的属性及更改所有者、访问权限和配置等详细信息。)11关机
11.1使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和
柱塞杆密封垫，确保2695分离单元已彻底冲洗干净后，关闭电源开关。
11.2数据采集完毕后，关闭所用检测器的电源开关。
11.3数据处理并打印报告后，关闭计算机和打印机电源开关。
11.4试验结束，在仪器使用记录表上登记，仪器管理人员审核签字。
12仪器维护与保养
12.1每次使用前后，查看分离单元上各溶剂瓶中溶剂的量，及时补充各瓶中相应的溶
剂。
12.2每次使用前后，打开分离单元最下面的分离泵的舱门，查看各管路接口，有无缓
冲盐析出的情况。如出现白色盐渍，应拆下其所在的部件，先后用水和甲醇超声清洗，并安装好。
12.3随时检查仪器的使用记录。
12.4如长时间不使用该仪器，则需每半年按照《高效液相色谱仪期间核查规程》检查一次，并做好维护记录。
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作
安捷伦高效液相色谱仪的规范操作 1. 目的：明确安捷伦高效液相色谱仪的规范操作，确保数据的准确性。 2. 范围：适用于安捷伦高效液相色谱仪。 3. 职责：检验人员对此负责。 4.操作规程： 系统组成 本系统由1个溶剂二元输送泵（分主/A泵和副/B泵）、手动进样阀、柱温箱、检测器、化学工作站和电脑等组成。 准备 4.2.1使用前应根据待检样品的检验方法准备所需的流动相，用合适的μm滤膜过滤，超声脱气20min。 4.2.2 根据待检样品的需要更换合适的色谱柱（柱进出口位置应与流动相流向一致）和定量环。 4.2.3 配制样品和标准溶液（也可在平衡系统时配制），用合适的μm滤膜过滤。 4.2.4 检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常 将待测样品按要求前处理，准备HPLC 所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。 开机： 4.3.1 打开计算机,进入中文Windows XP画面,并运行CAG Bootp Server程序。4.3.2 打开1200 LC 各模块电源。 4.3.3 待各模块自检完成后，双击[Instrument 1 Online]图标，化学工作站自动与1200LC 通讯，进入的工作站画面如下所示。 4.3.4 从[视图]菜单中选择[方法和运行控制]画面, 点击[视图]菜单中的[显示顶部工具栏]，[ 显示状态工具栏]，[系统视图],[样品视图]，使其命令前有[√]标志，来调用所需的界面。 4.3.5 把流动相放入溶剂瓶中。
4.3.6 打开冲洗阀。 4.3.7 点击[泵]图标，点击[设置泵…]选项，进入泵编辑画面。 4.3.8 设流速：5ml/min，点击[确定]。 4.3.9 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[启动]，点击[确定] ，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止,切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。 4.3.10 点击[泵] 图标，点击[控制…]选项，选中[关闭]，点击[确定]关泵，关闭冲洗阀。 4.3.11 点击[泵]图标，点击[设置泵…选项]，设流速：min。 4.3.12 点击泵下面的瓶图标，如下图所示（以单元泵为例），输入溶剂的实际体积和瓶体积。也可输入停泵的体积，点击[确定]。 数据采集方法编辑 4.4.1开始编辑完整方法：从[方法]菜单中选择[编辑完整方法…] 项，如下图所示选中除[数据分析]外的三项，点击[确定]，进入下一画面。 4.4.2方法信息 4.4.2.1在[方法注释]中加入方法的信息（如：测试方法）。 4.4.2.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.3 泵参数设定 4.4.3.1 在[流速]处输入流量,如1ml/min，在[溶剂B]处输入,(A=100-B) ,也可[插入]一行[时间表] ,编辑梯度。在[压力限]处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。 4.4.3.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.4 柱温箱参数设定 4.4.4.1 在[温度]下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。并选中它,点击[更多>>] 键,如图所示,选中[与左侧相同]，使柱温箱的温度左右一致。 4.4.4.2 点击[确定]，进入下一画面。 4.4.5 检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽：一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区 域。参比带宽：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省
高效液相色谱仪的使用及运行性能测试
高效液相色谱仪的使用及运行性能测试 实验目的 1.了解高效液相色谱仪的基本原理和结构。 2.掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 3.掌握测试高效液相色谱仪运行性能的指标和方法，验证各部件及整机的性能。 实验器材 高效液相色谱仪，LC-ATvp高压泵、SCL-10Avp程序控制器、SPD-M10Avp二极管阵列检测器、CTO-10Asvp温度控制器。Shim-packVP-ODS C18 150×4.6mm分析柱、20μl进样器、AS3210型超声波发生器。无水甲醇和双蒸水各500ml（脱气处理）、萘、咖啡因（均为色谱纯或分析纯）。 实验原理 高效液相色谱法是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 仪器描述 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。LC-2010和Agilent1100型为单泵型，适于单一流动相的洗脱；LC-10Avp型为双泵型高效液相色谱仪，适于程序洗脱。单泵型高效液相色谱仪的结构示意见图9-1。 实验步骤 （一）高效液相色谱仪的基本操作步骤（以岛津LC-10A为例） 1.依照顺序开机，自检完毕后进入操作模板； 2.设定洗脱程序、检测器的条件及测定报告； 3.完成实验过程，打印试验结果，依照顺序关机。 （二）性能测试
高效液相色谱仪的性能检查分为单个部件的验证和整机验证。验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。验证目的是检查并确认高效液相色谱仪运行性能是否符合要求。 1.验证标准 按照中华人民共和国国家计量检定规程，高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准见表9-1。 表9-1 高效液相色谱仪各验证部件的验证项目的合格标准 验证部件验证项目合格标准 输液泵流量设定值误差Ss 0.5ml.min-1: < 5%； 1.0ml.min-1: < 3% 2.0 ml.min-1: < 2% 流量稳定性误差SR 0.5ml.min-1: < 3%； 1.0ml.min-1: < 2% 2.0 ml.min-1: < 2% 柱温箱柱温箱设定值误差ΔTs< ±2℃柱温箱控温稳定性Tc ≤1℃ 自动进样器进样量准确度误差≤±2% 检测器基线噪声≤2×10+5AU 最小检测浓度≤1×10-7g.ml-1(萘的甲醇溶液) 基线漂移≤5×10-4AU.h-1 整机性能定性测量重复性误差RSD≤0.5% 2.验证步骤 （1）输液泵泵流量设定值误差SS、流量稳定性误差SR的检定 将仪器的各部分联接好，以甲醇为流动相，流量设为1.0mL.min-1，按说明书启动仪器，待压力平稳后保持10分钟，按表16-2设定相应数值，待流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确地收集，称重。按式(1)、式(2)计算SS和SR，结果填入数据记录与处理的表9-3中。 表9-2 流量、次数、收集时间表 流量设定值（mL/min）0.5 1.0 2.0 测量次数 3 3 3 流动相收集时间（min）10 5 5
液相色谱仪验证报告
Agilent1200液相色谱仪A验证报告文件编码：REC-JYYQ-B001-01-00
目录 1．概述 2．验证目的 3．验证依据及验证范围 4．验证工作小组 5．验证方案审批 5.1验证方案起草 5.2验证方案会签 5.3验证方案批准 5.4验证方案实施 6.验证内容 6.1安装确认 6.1.1 文件资料 6.1.2售后服务 6.1.3 消耗性备品备件 6.1.4安装检查 6.1.5安装确认结论及批准 6.2 运行确认 6.2.1 灵敏度及稳定性测试 6.2.2运行确认结论及批准 6.3性能确认 6.3.1 系统适用性试验： 6.3.2定量重复性试验 6.3.3性能确认结论及批准 7.验证结论 8.最终批准
1.概述 液相色谱仪为安捷伦科技有限公司生产（检测器为紫外检测器，色谱柱有C18柱，可以进行含量、有关物质和聚合物的定量或定性分析。我司在购买前对该产品的性能、价格、外观和售后服务进行了广泛地调查研究，在同类产品中价格适中、性能稳定、美观且售后服务好。 2、验证目的 为了确保使用该仪器检测数据真实可靠，也为了确认该仪器的各项指标能达到该仪器所设计的性能指标，对该仪器进行验证。 2.验证依据及适用范围 参照国家技术监督局“实验室液相色谱仪检定规程”及中国药典2008版附录V D液相色谱法起草本验证方案。本验证方案适用于实验室液相色谱仪的验证。 4.验证工作小组 成立由组成的验证工作小组，担任验证工作小组组长。 5.验证方案审批 6.验证内容 6.1安装确认 6.1.1 文件资料
检查人日期 检查人日期 检查人日期6.1.4安装检查 对照使用说明书要求安装，确认环境、电源等符合要求。 检查人日期6.1.5安装确认结论及批准 6.2 运行确认(见计量局计量证书) 证书号： 运行确认结论及批准：
高效液相色谱仪操作步骤
高效液相色谱仪操作步骤： 1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜(0.45um)。 2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。 5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10 ml/min。 6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 8)．进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。 10)．填写登记本，由负责人签字。 注意事项： 1)．流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。 2)．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。 3)．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
液相色谱仪结构及原理
液相色谱仪结构及原理 高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9′107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 一、特点： 1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。 2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。 3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。 二、性质及原理：高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理 根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 1 ．液—液分配色谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。a. 正相液—液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液—液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液—液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。 2 ．液—固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯
实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果
高效液相色谱仪使用注意事项[1]全解
岛津液相色谱仪使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的清洗。 11.要注意柱子的pH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 液相色谱柱使用经验谈 色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。 1、样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用预处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法
高效液相色谱仪HPCL使用中常见故障及解决方法 1 高效液相色谱仪系统 液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。 2 常见问题及解决方法 高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。 2.1 柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（ 3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。 2.1.1 压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。 (1).首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；
(2).打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100PSI (6.7 Bar)以下，过滤白头正常，在检查； (3).把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。 2.1.1 压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。 2.2．漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。 2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
高效液相色谱法测定手册
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱仪的结构
四、高效液相色谱仪的结构 高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部分组成（图3-1-2）。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器的流通池，最后和洗脱液一起排入流出物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。 图3-1-2 高效液相色谱仪的结构示意图 1.高压输液系统 高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。 (1) 溶剂贮存器。溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1～2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。 (2) 高压输液泵。高压输液泵（图3-1-3）是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。 由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。
图3-1-3 恒流柱塞泵 (3) 梯度洗脱装置。梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。 梯度洗脱的实质是通过不断地变化流动相的强度，来调整混合样品中各组分的k值，使所有谱带都以最佳平均k值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现的，而不是借改变温度（温度程序）来达到。 2.进样系统 进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。六通进样阀是最理想的进样器，其结构如图3-1-4。 图3-1-4 六通进样阀装置 3.分离系统 分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成，如图3-1-5。其内径为2 ~ 6mm，柱长为10 ~50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相，柱温一般为室温或接近室温。 图3-1-5 常见色谱柱外形
高效液相色谱仪 液相色谱仪检定规程
高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。 一、使用试管的问题 1、试管的洁净问题。高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。 2、塑料试管的溶解问题。近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。 3、被测样品在试管壁上的吸附问题。这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TD
M)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0. 5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。 二、操作进样阀的问题 目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。 1、进样量的控制。用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。 2、进样阀的清洁问题。如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至
高效液相色谱法习题答案
第二十章高效液相色谱法 思考题和习题 1．简述高效液相色谱法和气相色谱法的主要异同点。 相同点：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测不同点： 分析对象及范围流动相的选择操作条件 GC 能气化、热稳定性好、且沸 点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰 性”气体，只起运载作用，对 组分作用小 加温常压操作 HPLC 溶解后能制成溶液的样品， 高沸点、高分子量、难气化、离 子型的稳定或不稳定化合物，占 有机物的80% 流动相为液体或各种液 体的混合。它除了起运载作用 外，还可通过溶剂来控制和改 进分离。 室温、高压下进行 2．何谓化学键合相常用的化学键合相有哪几种类型分别用于哪些液相色谱法中 采用化学反应的方法将固定液键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合相。优点是使用过程不流失，化学性能稳定，热稳定性好，适于作梯度淋洗。 目前常用的Si-O-Si-C型键合相，按极性分为非极性，中等极性与极性三类。①非极性键合相：常见如ODS键合相，既有分配又有吸附作用，用途非常广泛，用于分析非极性或弱极性化合物；②中等圾性键合相：常见的有醚基键合相，这种键合相可作正相或反相色谱的固定相，视流动相的极性而定：③极性键合相：常用氨基、氰基键合相，用作正相色谱的固定相，氨基键合相还是分离糖类最常用的固定相。 3．什么叫正相色谱什么叫反相色谱各适用于分离哪些化合物 正相色谱法：流动相极性小于固定相极性的色谱法。用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用于含有不同官能团物质的分离。 反相色谱法：流动相极性大于固定相极性的色谱法。用于分离非极性至中等极性的分子型化合物。4．简述反相键合相色谱法的分离机制。 典型的反相键合色谱法是用非极性固定相和极性流动相组成的色谱体系。固定相，常用十八烷基（ODS或C18）键合相；流动相常用甲醇-水或乙腈-水。非典型反相色谱系统，用弱极性或中等极性的键合相和极性大于固定相的流动相组成。 反相键合相表面具有非极性烷基官能团，及未被取代的硅醇基。硅醇基具有吸附性能，剩余硅醇基的多寡，视覆盖率而定。对于反相色谱的分离机制目前，保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点，一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水十有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。吸附色谱的作用机制可用疏溶剂理论来解释。这种理论把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的"分子毛"，这种"分子毛'有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂作用，将会从水中被＂挤＂出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用，其结果使组分分子在固定相得到保留。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减小保留值，此即解缔过程，显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比k'也越大，保留值越大。不难理解，在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。 5．离子色谱法、反相离子对色谱法与离子抑制色谱法的原理及应用范围有何区别
高效液相色谱仪验证方案
高效液相色谱仪验证文件 …年 （设备编号：…..）
…………………有限公司 目录 1验证方案的起草与审批 2概述 3验证目的 4再验证人员 5验证支持性文件 6相关文件检查 7仪器状态检查 8运行确认
9性能确认 10再确认 1验证方案的起草与审批1.1验证方案的起草 1.2验证方案的审批
2概述： ?设备名称：高效液相色谱仪 ?设备编码：………. ?规格型号：…………… ?制造商：……………….. 本高效液相色谱仪主要由四元泵、一个柱温箱、一个可变紫外检测器、一个自动进样器和一台………..工作站组成，各部分由工作站软件控制。 本仪器主要用于分析原料和成品的有关物质和含量。 为验证本仪器性能的稳定性，确认本仪器在检验工作中的准确性，特安排本次验证。
3验证目的： 3.1设备安装状态检查：检查设备各部件完整无损，电源稳定可靠，安装环境符合要求， 确认仪器经过校正合格且在有效期。 3.2运行确认：确认仪器的各种控制功能与性能符合要求；在正常运行情况下，确认高 压泵的流速，柱温箱温度控制和自动进样器等符合要求；确认电脑及工作站权限使用设置与运行，数据处理稳定可靠。 3.3性能确认：以………检测为例，证明高效液相色谱仪系统适应性，….检测的线性及 重复性等性能符合要求 4 5验证支持性文件 本方案依据下面列出规的有关条款，结合本公司需求制定。以下规为有效的最新文本，设备所提供的性能及参数应能满足以下规的有关要求。 ?《高效液相色谱仪计量检定规程》JJG 705-2002 ?《液相色谱仪标准操作程序》 ?《高效液相色谱仪使用说明书》 ?《药品GMP指南》 ?《中国药品检验标准操作规》 6相关文件检查 6.1检查确认
Waters_2695_型高效液相色谱仪操作方法
Waters 2695 型高效液相色谱仪操作方法 1 仪器组成及开机 1.1 仪器组成本仪器由Waters 2695 分离单元、2996型二极管阵列检测器、2420蒸发光散射检测器、色谱管理工作站和打印机组成。 2695 分离单元包括四元梯度洗脱的溶剂输送系统，四通道在线真空脱气机（或氦气脱气机），可容纳120 个样品瓶的自动进样系统，柱温箱，内置的柱塞杆密封垫清洗系统，溶剂瓶托盘，液晶显示器，键盘用户界面及软盘驱动器。 1.2 开机依次接通2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通2695 分离单元后，约20s 仪器开始自检，约1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上方标题区出现“Idle ”时，仪器进入待命状态。 2 溶剂管理系统的准备 2.1 流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【Menu/Status 】，进入“Status （1 ）”屏幕，光标选“Degasser ”，按【Enter 】，显示选项屏幕，光标下移选“Continuous ”，按【Enter 】。 2.2 启动溶剂管理系统 2.2.1 干启动，当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status （1 ）”屏幕下，按【Direct Function 】，光标选“Dry Prime ”，按【Enter 】，显示“Dry Prime ”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如【OpenA 】，光标选“Duration ”，按数字键输入5min ，按【Continue 】，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。 2.2.2 湿启动在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Compomtion ”中欲使用的流动相，输入10 0％，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，按【Enter 】，显示“Wet Prime ”屏幕，输入7.5Ml/min 和6min ，按【OK 】，待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。 2.2.3 平衡真空脱气机在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成，按【Enter 】再用光标选“Degasser ”中的“Normal ”，按【Enter 】，按【Direct Function 】，光标选“Wet Prime ”，输入0.000mL/min 和10min. ，按【OK 】。待限定时间结束后，按【Abort Prime 】。 3 样品管理系统的准备 3.1 冲洗自动进样器在“Status （1 ）”屏幕下，光标选“Composition ”，输入流动相的组成。按【Direct Function 】，光标选“PurgeInjector ”，按【Enter 】，显示“Purge Injector ”屏幕，输入“Sample Loop Volumes 6.0 ”，光标下移“Compression Check ”，按任意数字键，按【OK 】。 3.2 冲洗进样针在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnositcs ”屏幕，按【Prime Ndl Wash 】，显示“Prime Needle Wash ”屏幕，按【Start 】，30s 内应见溶剂从废液排放口流出。按【Close】、【Exit 】。 3.3 冲洗柱塞杆密封垫在主屏幕下，按【Diag 】，显示“Diagnosities ”屏幕，按Prime Seal Wash ，显示“Prime Seal Wash ”屏幕，按【Start 】，待排放口有水流出，按【Halt 】、【Close】、【Exit 】。 3.4 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。 4 编辑分析方法及执行样品分析表 在主屏幕下，按【Develop Methods 】，显示“Methods ”屏幕。 4.1 编辑分析方法 4.1.1 建立新的分离方法在“Method ”屏幕下，按【New 】、【Separation Methods 】，输入方法名，按【Enter 】，显示分离方法屏幕，该屏幕共有6 页，通过按【Next 】或【Prev 】切换。如需设定梯度，在第（ 1 ）页按【Gradient 】，输入后按【Exit 】；如需设定色谱柱的温度，在第（ 4 ）页输入后按【Exit 】；在第（6 ）页设定检测器的种类，光标选“Absorbance Detector ”，按【Enter 】，光标选“48 6﹨2487 ”，按Abs （1 ）图标，设定检测波长，按【OK 】、【Exit 】、【Save 】。 4.1.2 编辑已建立的分离方法在“Methods ”屏幕下，光标选欲编辑﹨修改的分离方法的图标，按【Edit 】，编辑\ 改各种分析参数，按【Exit 】、【Save 】。 4.2 编辑执行样品分析表 4.2.1 建立新的样品组在“Methods ”屏幕下，按【New 】、【Sample Set 】，输入样品组名，按【Enter 】，显示方法组屏幕，在样品组表中输入待分析样品的信息。在“Vial ”中输入样品放置的位
液相色谱仪检定规程
ρt：实验温度下流动相的密度（g/cm3）； t：收集流动相的时间（min）； S R：流量稳定性误差（%）； Fmax：同一组测量中流量zui大值（ml/min）； Fmin：同一组测量中流量zui小值（ml/min）； F：同一组测量中的算术平均值（ml/min）。 5.2.定性、定量测量重复性的检定 将仪器联接好，使之处于正常工作状态，用进样阀的定量管注入适当的标准溶液（萘或联苯）或稳定的待分析样品溶液，记录保留时间和峰面积，连续测量5次，按下式计算相对标准偏差RSD。 5.3.紫外检测器性能 5.3.1.可调波长紫外-可见光检测器波长示值误差和重复性误差的检定 将检测器与记录仪联好，接通电源稳定后，先将检测波长调至235nm，用甲醇用流动相，流速1.0ml/min，用进样器注入重铬酸钾的硫酸溶液（取120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，精密称定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000ml，摇匀，即得）20ul，待出峰时立即停泵，改用波长扫描方式，得到重铬酸钾在紫外-可见光区的吸收曲线，记录其在235nm、257nm、313nm、350nm附近波长处的zui大或zui小吸收波长，分别找出各点zui大或zui小波长与标准波长之差即为波长示值误差；重复测定3次，各点zui小与zui大值之差即为波长重复性误差。 5.3.2.基线漂移和基线噪声的检定 将仪器各部分联接好，紫外检测器波长调到254nm，流动相为100%甲醇，流速为1.0ml/min，吸收度范围选择zui灵敏档，开机，待基线稳定后，记录基线30-40分钟，计算基线漂移和噪声。 5.3.3.zui小检测浓度 在静态条件下，用进样器注入4×10-8g/ml萘的甲醇溶液，样品峰高应大于或等于两倍基 线噪声峰高，按下式计算zui小检测浓度。 C l=2×H N×C /H 式中，C l：zui小检测浓度（g/ml）； H N：噪声峰高（记录仪器数或实测高度cm）； C：样品浓度（g/ml）；