糖基转移酶的研究概述

邓传怀

（河北大学生命科学学院２０１２生物技术中国保定０７１０００）

摘要糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂上，糖基化的产物具有很多生物学功能并具有高度的底物专一性。本文综述了糖基转移酶的种类、功能、特性及其在组合生物合成中的应用与研究前景。

关键词糖基转移酶结构功能应用

Outline about research of

glycosyltransferases

Deng Chuanhuai

( College of Life Sciences , Biotechnology 2012, Hebei University ,

Baoding )

Abstract Glycosyltransferase catalyzing the biosynthesis of the sugar attached to different activated receptor molecules, such as proteins, nucleic acids, oligosaccharides, the lipid glycosylation product has many biological functions with a high degree of substrate specificity[1]. In glycosylation project, carried out by enzymatic protein glycosylation and important means of natural glycosylated glycoproteins to study the structure and function of glycoproteins[2].This article provides anoverview of the categories, functions, characteristics of Gtfs, their app lications in combinatorial biosynthesis, and the p rospects for research.

Key Words Glycosyltransferase Structure and Function Application

糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类[3]，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)

的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工实现其生物学功能。

1 糖基转移酶的结构

在真核细胞中,绝大多数糖基转移酶都是位于内质网和高尔基体,除个别( 如合成G 寡糖的al,2甘露糖转移酶是I 型膜蛋白)外,它们都是Ⅱ型膜蛋白, 都有着相似的域结构。首先是一段短的留在胞质的N一末端肽端, 接着是跨膜结构域(TMD), 然后是一段所谓的“茎”(stem)区,余下则是一段很长的球形催化结构域。其中跨膜域在糖基转移酶的高尔基体膜定位中起着关键作用,而胞质尾端“茎”区的毗邻跨膜域的部分氨基酸则起着辅助作用。肤链的“茎”区氨基酸对某些蛋白水解酶敏感,易被水解,使催化结构域游离溶解出来,这在糖基转移酶的可溶化和提纯有重要意义。最近的一项研究表明ST6GalI的“茎”区域在糖蛋白受体的选择有一定作用, 可能是因为“茎”区域影响催化域的三维结构, 对这一区域意义的阐明还有待更多的研究.长期以来,人们对糖基化反应的分子机制一直不甚清楚, 最重要的原因的就是缺乏对糖基转移酶的三维结构的认识。1994年,Virelink 等利用X射线晶体衍射技术率先完成了对噬菌体T4的β-GlcT ( BGT)的3 D结构的测定。1999年至今, 人们又相继完成了另外12 种糖基转移酶的3D结构的测定结果发现这13 种糖基转移酶都是α∕β蛋白, 而且只采用了两种折叠模式GT一A 折叠和GT一B折叠( 即上文所提的两个超家族), 通过穿针引线分析(threadinganalysis)发现其余大多数糖基转移酶都采用这两种折叠模式中的一个。

核酸法测定蛋白质一级结构的迅速发展和广泛使用, 也为糖基转移酶的结构研究提供了有用的方法。因为大多数糖基转移酶是膜结合蛋白, 量很少, 不足以用经典的蛋白质化学方法测定它们的整个结构．目前认为仅是参与糖蛋白和糖脂中糖链合成的糖基转移酶就有上百种, 被克隆的哺乳动物来源的糖基转移酶只有十几种，这些糖基转移酶的cDNA的序列已被测定。它们大多有相似的域结构闭, 即：一段短的末端的肤段尾巴在细胞质中, 接着是１６－２０个残基组成的穿透膜的肤段, 然后是一段长度尚未确定的所谓的“颈”部, 余下的是很长的有催化活性的结构域, 后者在高尔基体的腔内。肽链中的“颈”部对某些蛋白水解酶敏感, 原来的膜酶经水解后成了可溶性的酶。后者比前者更为容易分离纯化, 为此多数糖基转移酶的结构研究, 是以水解得到的可溶性酶作起始材料, 得到了它们的ｃＤＮＡ后就能进一步测得酶的其它部分。兔肝ＧｎＴ１就是一个例子。在制备此酶时, 仅能得到少量纯化的酶, 大量是不吸附在分离柱上不能进一步纯化的酶克隆了编码此酶的基因,由2.5kb

cDNA的序列测定得到了此酶的蛋白质一级结构, 由４４７个残基组成。穿透膜的疏水肤段含有２５个残基, 可形成α螺旋。“颈”部的酶解点在45位残基, 在这切点和催化结构域之间的肤段中有异常多的脯氨酸。其它一些糖基转移酶也有这样高脯氨酸含量的“颈”部,这提示了糖基转移酶的“颈”部在高尔基体腔内糖基化过程中有特定的作用,例如有利于糖基化蛋白的移动。

2 糖基转移酶的分类

糖基转移酶的传统分类方法是根据其所转移的单糖分类, 如半乳糖转移酶, 唾液酸转移酶等; 国际生物化学和分子生物学学会推荐的分类方法是根据底物及产物立体化学异构性分类分为反向型(Inveritgn) 和保留型(Eratinign)这些分类方法存在一个明显的不足, 即不能揭示糖基转移酶的内在结构特征, 彼此同源性极低, 即使同一类糖基转移酶序列相似性也很低。1997年Campbell 等提出一种新的分类方法, 根据序列同源性、底物/ 产物立体化学异构性以及供体糖进行分类到目前为止，依据这种分类方法糖基转移酶被分为66家族及一个未分类族，出人意料的是如此众多的家族却只采用了两种折叠方式, 从而形成两种超家族, 分别命名为GT-A超家族和GT-B超家族。这两个超家族之间无论折叠方式, 活性位点还是催化机制都各不相同, 为如何完成糖基化反应这一问题提供了两种不同的答案.

3 糖基转移酶的作用机制

根据产物的立体化学异构性，糖基转移酶的作用机制分两种：反向型和保留型糖基转移酶。反向型糖基转移酶的作用机理是双分子亲核取代反应。利用NDP-糖活化的C-1作为亲电子基团，亲核攻击捕获带有亲核受体原子的糖苷配基，经过一个氧络正碳离子-离子样的过渡态产生一个反向的异头构型，完成一个简单的取代反应；关于保留型糖基转移酶的反应机制目前还没有确切的答案。参照糖苷酶的反应机制，糖基转移酶很可能经历了二次取代反应，首先形成一种含有共价键的糖基-酶中间体，释放核苷二磷酸，二磷酸基团将受体的羟基受体活化，而后受体再进攻糖基-酶复合体，形成糖苷键。作为底物或者产物的磷酸盐作为一种碱性催化剂在许多文献中都被报道。目前以研究保留型糖苷酶催化机制的方法去研究各种转移酶的催化机制已经做了大量工作，但仍没有得出针对参与反应的催化性亲核试剂及动力学及催化学机制层面上成立的共价中间体的最终鉴定结果。这可能可以作为反驳在糖基转移酶中不存“双取代”机制的证据，但是还有一种可能就是用于研究糖苷酶的研究方法根本不适用于糖基转移酶，因为用于研究这两种酶的底物的性质存在着根本的不同。所有的糖基转移酶都有高度的底物专一性即对糖基的供体有专一性,而且对糖基的接受体也有专一性，大多数糖基的供体是不同类型的核苷二磷酸激活的单糖不同的单糖用不同的核苷二磷酸活化但同样是葡萄糖基转移酶, 因合成的产物结构不同或合成的部位不同,所用的供体上的核苷二磷酸也不同。

4 糖基转移酶的功能

2.2.1糖基转移酶在糖类合成中的应用

糖类药物在治疗炎症、用作肿瘤疫苗和抗病毒等方面都有其独特的功效。现在普遍使用的糖类合成方法有两种: 化学合成和酶促合成。化学合成近年来取得一些进展, 提出了一种全自动寡糖合成法, 但在天然复合产物中以一种糖代替另一种糖仍然困难。酶促合成凭借其高产量、产物的特异立体化学异构性而愈来愈受人们的青睐。本来人们以为糖基转移酶的高度底物专一性将会限制糖基转移酶的应用, 但事实并非如此。首先,GT一A 超家族的部分糖基转移酶有着相对宽松的底物专一性, 它们能用于合成一些非天然寡糖，而且根据糖基转移酶的结构比较能够找到决定其底物专一性的区域,通过改变这些区域的结构, 可以设计出新的糖基转移酶改变或增加其选择性范围。酶促合成的另一个难题就是糖基供体的获取上, 最近人们利用磷酸一1-己糖核苷转移酶不严格的底物专一性生成结构多样的ＴＤＰ一糖或ＵＤＰ一糖。另外有人提出一种新的方法可以原位重生核苷一糖供体, 减少了合成核苷一糖供体的花费。相信在不久的将来, 利用糖基转移酶和产生糖基供体的酶人们将建立糖聚合物数据库以供检索。

糖基转移酶与疾病

糖基转移酶的表达和活性的变化与许多疾病联系在一起, 并可作为某些疾病的诊断标志, 如α-1,3-半乳糖基转移酶活性在体内的再现会引发自身免疫反应, 导致类风湿, 并在器官异体移植中引起排斥反应; N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等在成熟细胞中活性的明显升高被视为肿瘤发的重要标志, 并且被认为是肿瘤迁移恶化的重要原因. 因此设计合成糖基转移酶抑制剂, 对于寻找抗肿瘤、抗免疫系统等新药研究有重要意义.

α1一3 G T 的活性在人体内的重现会引发自身免疫反应.相反, 如果人体内βl一4 半乳糖基转移酶的活性下降, 致使正常的免疫球蛋白G（IgG )分子中的糖链半乳糖含量降低.IgG 是一种糖蛋白, 它的糖含量不高, 约5 % , 最主要的糖链是在ＣＨ一2 结构域中的Asn一297上的二分支复杂型的糖链, 即使是这样比较简单的糖链也至少有30 种结构类似仅有极小差异的不同形式, 每种结构被称为一种糖型(glycoform).这种半乳糖缺少的异质体对正常机体而言也是异物, 因此, 它能诱导抗体的产生, 从而也会出现自身免疫, 其症状是类风湿.糖基转移酶的表达和细胞的周期密切有关.在细胞分化阶段, 许多糖基转移酶的基因是表达的, 为此出现了一系列糖类异质体作为分化抗原; 一旦发育成熟, 在细胞表面出现

了另一些糖链异质体.如果糖基转移酶在成熟细胞中活性很高, 就会产生癌变, 同时出现了早期的分化抗原.在N一糖普键连接的糖链中多聚N一乙酞乳糖胺链的出现被看成是肿瘤的重要标志, 这类糖链可以降低细胞和基质间的粘着,有利于癌细胞的进一步的入侵.

婴幼田鼠肾细胞(BHK) 被Rous肉瘤病毒感染后,GnTV的活性升高２．５倍;一些有转移倾向的肿瘤细胞和非转移的细胞相比,GnTV 的活性高出3一10 倍.岩藻糖基转移酶的活性在肿瘤细胞中也明显升高.糖基转移酶的研究还处于起步阶段, 仅知道一些酶的结构还是远远不够的.更为重要的是了解这些糖基转移酶在多酶系统中是如何协调的, 以及这些酶的表达是受那些因素调控的.这是糖基转移酶今后研究的方向。

2.2.3糖基转移酶在抗生素方面的应用

抗生素糖苷在临床上主要用于抗菌和抗肿瘤, 在抗生素生物合成基因簇中已经发现了很多编码糖基转移酶的基因[1 ] , 但人们对抗生素糖基转移酶(antibioticglycosyltransferases, Gtfs) 的特异性和催化机制了解不多。糖基与不同配基的结合能大大增加天然产物的结构多样性, 在功能上, 这些糖组分通常参与目的细胞的分子识别, 影响化合物的生物活性。目前, 随着抗生素的广泛使用, 耐药菌也在逐年增加, 迫切需要寻找新的抗生素来与之抗衡。通过糖基化增加抗生素种类和改变抗生素活性是一条很有前景的途径, 探讨糖苷类抗生素的产生机制和糖基转移酶的催化特征, 有望为发现和改造新活性的抗生素奠定基础。

很多糖苷类抗生素在生物合成中经过了立体和区域选择性的糖基化, 在这一生物反应中, 糖基转移酶催化其结构中的糖基以单糖、双糖和寡糖链的形式结合到配基上从而形成特定的C2、N 2和O2苷(F ig. 1)。糖苷类抗生素的生物合成途径中, 糖基化通常是后修饰的最后一步, 如万古霉素( vancomycin )、替考拉宁( teicop lanin) 的糖链都是在生物合成的最后引入的[3 ]。糖苷类抗生素的作用机制主要有两类, 一类是通过抑制革兰阳性菌肽聚糖的合成, 如雷莫拉宁( ramop2lanin）; 另一类是抑制DNA 促旋酶的活性, 如新生霉素(novobiocin) [5 ]。

糖基化的作用和意义主要体现在以下三个方面:第一, 增加化合物的水溶性。己糖衍生物结合到抗生素糖苷配基上, 增加了抗生素的亲水性利于药效的发挥,典型的有替考拉宁环七肽上的N -乙酰葡萄糖胺(N-acetyl-glucosam ine, GlcNA c) 和雷莫拉宁骨架上的甘露糖链;第二, 利于分泌。A 40926 生物合成途径中的甘露糖基转移酶(mannosyltransferase) 特异识

manno2syl2PP2C作为糖供体, 使糖基化的抗生素利于分泌。第三, 糖基化是产生菌的一种自我保护机制。在竹桃霉素(oleandomycin) 的产生过程中, 糖基转移酶O leD 使中间态抗生素糖基化, 造成其在胞内短暂失活, 抗生素分泌后, 再由糖苷酶水解去除糖基, 使其恢复活性[7 ]。

该机制在大环内酯类抗生素中比较常见, 类似功能的酶还有M gtA。

2.2.4 糖基转移酶在组合生物合成的应用

应用遗传学方法生产新型聚酮和多肽类化合物日益得到人们的重视, 表面上看重组生物合成糖基化的化合物和聚酮、多肽一样复杂, 但是和聚酮、多肽合成酶的复杂性相比, 由于催化去氧糖产生的酶及其反应机制比较保守, 因此重组合成糖基化的化合物更有实践意义。西班牙的Salas 研究组已经建立了成功的基因克隆和表达系统用来生产活化的去氧糖, 目的基因处于操纵子的下游, 通过启动子的控制可以在链霉菌中表达。在链霉菌S trep tom y ces albus 中整合糖基转移酶基因oleGI I , 导入合成L 2夹竹桃糖(L 2oleandrose) 的质粒后, 合成红霉素内酯B (eryth ronolide B) , 而整合糖基转移酶基因elm GT 后再导入生物合成L 2橄榄糖(L 2o2livose) 的质粒pOLV 可以成功生产特曲霉素( tetracenomycin C)Staurosporine (十字孢碱) 类化合物的结构是由一个糖分子和一个杂环的吲哚卡唑单元组成, 通过化学手段较难得到, 通过在一个生物体内共表达rebecca2mycin 和其它staurosporine 类化合物生物合成基因,分离鉴定了大约产生了30 种staurosporine 类衍生物。通过遗传学方法改变Gtfs 的特异性有一定难度, Salas 研究组通过共表达糖基生物合成基因盒、Gtfs 基因(staN 和staG) 和staurosporine 的生物合成基因成功地替代了天然附加在吲哚卡唑基团上的糖基, 为糖基转移酶在重组生物合成中的应用奠定了基础, 证明重组生物合成在生产新的糖基化产物中较药用化学更有利。

5糖基转移酶的研究前景

最近, 在糖肽的生物合成系统中得到了Gtfs 的晶体, 结构测定表明这类Gtfs 家族有两个共同的结构域。NDP2糖结合到C2端, 糖苷配基结合到N2端(A GVgGtfB,DVVgGtfA ) 。这个两裂的结构仅仅由两个肽连接到一起, 提示混合和匹配各自的结构域是可以实现的。因此,DNA shuffling 或相关酶定向进化可以构建看似荒诞的Gtfs, 改变其对己糖单元和配基的底物特异性, 大大提高糖苷类化合物的结构多样性, 为筛选到新活性糖苷类抗生素奠定基础。总之, 在生物合成中研究糖基化模式的多样性需要满足三个要求。

(1)建立糖基转移酶库通过重组生物合成生产新的抗生素糖苷, 必须建立糖基转移酶的基因库, 才能使之在工业上得到深入应用。随着更多基因簇的序列测定, Gtfs 的数目也会逐年增加, 发现具有混合和匹配的N2或C2端的Gtfs 区域用于构建杂合催化体系, 改变配基和去氧糖的识别, 可以为特定的去氧糖单元寻找新结合位点[34]。(2)建立配基的化合物

库这些化合物包括简单的氨基香豆素类骨架(am inocoum arin scaffolds)、非核糖体肽(NRP)以及芳香化的聚酮配基[25]。但是, 由相似酶催化进行C2N , C2C 糖基化还有待于进一步的研究。

(3)建立糖供体的化合物库糖供体要包括很多UDP 或TDP 活化的糖和去氧糖。天然去氧糖附加到配基上以后, 赋予了配基新的活性。去氧糖的氨甲酰化在很多类型的化合物如聚酮(新生霉素)、非核糖体肽(如替考拉宁) 等抗生素中都存在, 因此所有TDP2D2 和TDP2L2去氧己糖衍生物在库中都值得准备．

迄今为止已经发现了很多与抗生素生物合成相关的糖基转移酶, 但现有的研究还不深入, 对糖基化生物学意义、糖基转移酶结构和功能关系、催化机制、糖苷的活化形式以及组合生物合成的应用等有待进一步探讨。沈月毛研究组发现糖苷化与微生物的生长条件有关, 同一个菌株在平板培养时产生的糖基化产物在液体培养时却检测不到．催化三种不同类型糖苷形成的糖基转移酶之间在其作用机制及底物选择性方面到底存在那些异同, 都有赖于不同类型糖基转移酶高级结构的阐明, 离实用化、产业化还有很长的一段路要走。

参考文献：

于洋曹飞飞陈小龙.糖基转移酶的性质、作用机制及其在抗生素中的应用.中国抗生素杂志2013年2月第38卷第2期.

丁向明，吴士良, 陈惠黎. 糖基转移酶的结构生物学.《生命的化学》 2003 年 23 卷第5 期

王克夷.糖基转移酶的研究进展.生物化学与生物物理进展.1994；21（1）.

杨清香,曹军卫,黄国锦.糖基转移酶和去糖基化酶, Amino Acids & Biotic Resources 1997, 19 ( 2) : 38～43

代焕琴,王浩鑫,沈月毛.抗生素糖基转移酶研究进展.中国抗生素杂志 2007 年 5 月第 32 卷第 5 期·257.

[1] 王克夷.糖基转移酶的研究进展.生物化学与生物物理进展.1994；21（1）.

[2] 杨清香,曹军卫,黄国锦.糖基转移酶和去糖基化酶, Amino Acids & Biotic Resources 1997, 19 ( 2) : 38～43.

[3] Beyer TA,Sadler J E,Rearick J I.Advances Enzymol，1981,；52:23.