STE缓冲液(pH8.0)
生化与分子生物学实验生化部分
本实验酶活测定具体注意事项
1. 安全：硫酸. 枪头、试管等严禁乱甩，乱放。防止烧伤 2. 安全：爱护分光光度计，及时擦洗仪器内的任何贱出和
外溢，
3. 安全：随时清理实验台面上的溢出及废纸。 4. 比色皿处理：反应液有限，不能润洗，测量时选择样
品浓度由低到高进行。 每个样品之间将比色皿倒扣在吸水 纸上，轻磕即可。
超声：高频，震动，能量 功 率：功率大，破碎效果好，产热高，蛋白变性多
一般原则：间歇超声，超声数秒钟，停数秒钟，循环多次 超声的必要条件：冰水浴，保证最佳的冷却状态。
冰水浴液面略高于样品液面 超声探头的位置： 位于样品液面下～1cm 我们的超声条件：功率180W, 超声 2 秒， 间歇 2 秒
循环次数：～500－700次 (视样品多少调整） 纯超声时间：1000－1400秒 （～17min)
2. 准确计时，并量取各种试剂： 在进行一组反应时，先设计各试剂加量及加入时间，
并用表格列出。严格按设计操作，减少人为误差。 3. 分光光度计测量反应液的OD560 ：
一次读数后，应将反应液倒回试管中，以备复查。 数据分析无误后才能丢弃。 4. 光吸收OD560读数应在分光光度计测量的有效范围内（即： 读数与浓度呈线形关系）
收菌
洗菌
破碎
收菌、洗菌
• 将全部培养液分两次离心后，全部集中 于1个离心管中，用STE充分悬浮（震荡 或枪吹打）。再离心后悬浮于15ml破碎 缓冲液（冷）用于破碎。
• 准备好要破碎的同学请带样品到339 房间 用french press 破碎细胞。带一个250ml的 烧杯，用于冰浴破碎后的样品。
细胞的超声波破碎
不正确的超声：探头接近液面，引起液面剧烈波动，产生大 量泡沫———蛋白变性 探头接近样品底部，超声效果差
大肠杆菌提取DNA
中文摘要目的：用试剂盒法和碱法提取p16重组质粒的比较。
方法：1.5ml菌液移入50mlLB液体培养基中培养12h，将试剂盒法和碱法各分3组，每组加入3.0ml菌液，每种方法中有两组是对照试验；紫外分光光度计法测OD值；酶切；琼脂糖凝胶电泳。
结果：碱裂法的OD值分别为：1.583；1.575；1.735，质粒DNA的浓度为：3.060；3.150；2.370。
试剂盒法的OD（260/280）值为：1.614；1.605；1.656。
质粒DNA的浓度为：；0.390；0.420；0.600。
结论：碱法与试剂盒法用统计学分析没有显著差异。
试剂盒法简单、快捷，DNA纯度高，但质粒DNA的浓度低，提取质粒DNA的量少，并且试剂盒价格昂贵，碱法价格低廉，质粒DNA的浓度高，提取质粒DNA的量多，所以具有较强的实用性，适用于一般实验室研究工作。
关键词：质粒；试剂盒法；碱法；AbstractPurpose : Draw the comparison that p16 recombinated the plasmid with the reagent box law and alkali law. Method : 1. 5ml fungus liquid move in 50mlLB liquid culture train 12h, reagent box law and alkali law all 3 group, every group joins 3. The fungus liquid of 0ml, there are two groups that are tested by the contrast in each kind of method; The law of purple other spectrophotometer examines OD value; The enzyme is cut; Agar-agar candy gel electrophoresis. Result: It split alkali OD the law one including: 1. 583; 1. 575; 1. 735, the density of plasmid DNA is: 3. 060; 3. 150; 2. 370. Whether reagent OD (260/280), box of law value is. 1. 614; 1. 605; 1. 656. The density of plasmid DNA is: ; 0. 390; 0. 420; 0. 600. Conclusion: Alkali law and reagent box law analyse with statistics that there is not remarkable difference. The reagent box law is simple , swift, DNA is high in purity , but the density of plasmid DNA is low, there is little quantity of drawing plasmid DNA, and the reagent box costs an arm and a leg, the alkali law is cheap, the density of plasmid DNA is high, there is much quantity of drawing plasmid DNA, so have stronger practicability, suitable for the research work of general laboratory .Keyword: Plasmid; Reagent box law; Alkali law;前言P16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是1994年美国冷泉港实验室Kamb等发现的新抗癌基因，这是一种细胞周期中的基本基因，直接参予细胞周期的调控，负调节细胞增殖及分裂，在人类50%肿瘤细胞株发现有纯合子缺失、突变，认为P16是比P53更重要的一种新型抗癌基因，有人把它比作细胞周期中的刹车装置，一旦失灵则会导致细胞恶性增殖，导致恶性肿瘤发生。
(自己整理)实验室常用技术之欧阳治创编
实验室常用技术资料Lab. experiment technologyLQ细胞冻存1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。
3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。
吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。
4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。
(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养)5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。
6. 冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽长期储存。
(-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。
7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。
细胞复苏冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。
1材料：37℃ 恒温水浴箱，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶2步骤：1、操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
2、自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3、取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化。
4、常温离心1000rpm，5min，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内，去除上清夜，加入新鲜培养基，重悬细胞。
5、取出细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养瓶，混合均匀，放入CO2培养箱培养。
常用缓冲液配方及缓冲范围
常用缓冲液配方及缓冲范围缓冲液是一种水溶液，其中含有在酸性或碱性条件下能够保持pH稳定的化学物质。
缓冲液广泛应用于生物化学、分子生物学、生物技术和医学等领域的实验和研究中。
下面是一些常用的缓冲液配方及其应用范围。
1. Tris缓冲液Tris缓冲液是一种中性缓冲液，常用于生物化学和分子生物学实验。
它的配方通常为：- 10 mM Tris base-1mMEDTA-向溶剂中调整pH至7.4Tris缓冲液可用于DNA和RNA的电泳、酶反应、细胞培养等实验中。
2.PBS缓冲液PBS（磷酸盐缓冲液）是一种常用的生物学缓冲液，具有缓冲能力强和与生物体液成分相似的特点。
它的配方通常为：-137mMNaCl-2.7mMKCl-10mMNa2HPO4-2mMKH2PO4-向溶剂中调整pH至7.4PBS缓冲液可用于细胞培养、免疫荧光染色、蛋白质凝胶电泳等实验中。
3.TAE缓冲液TAE（三乙酸缓冲液）是一种常用的核酸电泳缓冲液，其配方为：- 40 mM Tris base-20mM醋酸-1mMEDTA-向溶剂中调整pH至8.0TAE缓冲液可用于DNA和RNA的琼脂糖凝胶电泳，如聚丙烯酰胺凝胶电泳（）和琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）。
4. Tris-HCl缓冲液Tris-HCl缓冲液是一种常用的酸性或碱性缓冲液。
它的配方基于Tris缓冲液，在Tris缓冲液基础上调整pH的方法是在配方中加入稀盐酸或稀氢氧化钠。
例如，对于Tris-HCl缓冲液的配方为：- 50 mM Tris base-向溶剂中加入HCl调整pH至所需的值（通常为7.2至9.0）Tris-HCl缓冲液可用于酶反应、蛋白质组学研究、PCR等实验中。
这只是一些常用的缓冲液配方，根据不同实验需求和物质稀释要求，还有其他许多缓冲液的配方。
对于缓冲液的选择，关键在于根据实验要求选取适当的缓冲体系，并对缓冲液中所需的化学物质浓度、pH值等进行精确调整。
Tris缓冲盐溶液(20×TBS,pH8.0)
北京雷根生物技术有限公司
Tris 缓冲盐溶液(20×TBS,pH8.0)
简介：
Tris 缓冲盐溶液简称TBS, 属于常规pH 缓冲液，常用于清洗Western Blot 中蛋白印迹膜或配制封闭液，是常用分子生物学试剂。
Tris 缓冲盐溶液主要成分为Tris-HCl(pH8.0)、氯化钠、防腐剂，不含Tween 20。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 根据实验具体要求操作。
2、 一般稀释至1×，再加入0.05～0.1% Tween 20，即获得1×TBST 进行下游实验。
注意事项：
1、 如果每次的使用量很小，可以适当分装后再使用。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
相关：
编号 名称 PW0017 Storage Tris 缓冲盐溶液(20×TBS,pH8.0) 500ml 4℃ 使用说明书 1份 编号 名称 DC0032
Masson 三色染色液 PE0080
Tris-HCl 缓冲液(1mol/L,pH6.8) PS0013
RIPA 裂解液(强) PT0013
考马斯亮蓝快速染色液 PW0040
Western blot 一抗稀释液 PW0053
Western 抗体洗脱液(碱性) PW0084
丽春红S 染色储存液(10×Ponceau S) TO1013 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)。
蜘蛛DNA提取
摘要随着科学技术的不断发展，分子生物学的内容也在不断地丰富。
而其中提取蜘蛛DNA 这项科研活动也在这个潮流中得到启发与推动！酚抽提法，由于其在用药及仪器上都比较精简，是DNA提取方法中比较简单快速的一种方法。
然而通过酚抽提法提取的DNA效果并不是很好，常常混有蛋白质、RNA等杂质。
本实验是以幽灵蜘蛛为材料，以酚抽提法为基本实验方法，辅以仲丁醇浓缩法和醚抽提法来提高提取DNA的纯度。
关键词：幽灵蜘蛛、DNA、酚抽提法、仲丁醇浓缩法、醚抽提法。
AbstractMolecular Biotechnology is constantly enriching itself as Sience and Technology continually developing in the world.And the work of extracting DNA from the spider is being provoked and pushed in a higher level in this wave!The estraction by using Phenol is an easy and quickly way for its simple pharmaceuticals and chemical apparatuses,but the DNA we extracte in this way doesn’t pure enough,there are still some protains and RNA mix in.In my experiment,Pholcus was used as the experiment matetial,then I combined intermediate butanol extraction and ether extration with Phenol extraction to run the experiment.Key words:Pholcus,DNA,Phenol extraction,intermediate butanol extraction,ether extraction.前言蜘蛛，是节肢动物门(Arthropoda)蛛形纲(Arachnida)蜘蛛目(Araneida或Araneae)所有种的通称。
DNA提取常规方法
STE 溶液(配制10ml)0.1 mol/L NaCl10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)方法：分别称取0.0584 g NaCl 、0.0121 g Tris、0.0037 g EDTA 置于50 ml的烧杯中加入5 ml 的蒸馏水使之溶解，用浓盐酸调pH至8.0后转入容量瓶中定容至10 ml。
装于棕色试剂瓶中，室温保存TE(pH 8.0)缓冲液(配制10ml) 100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)10 mmol/L EDTA(pH 8.0)方法：分别称取0.1211 g Tris 、0.0372 g EDTA 于50 ml的烧杯中加入5 ml的蒸馏水使之溶解，用浓盐酸调pH至8.0后转入容量瓶中定容至10 ml。
分装后在0.1 M pa高压下蒸汽灭菌20 min，装于白色试剂瓶中室温保存2．1提取动物总DNA 的常规方法从动物组织中提取DNA 的常规步骤如下：（1）取动物组织100mg 左右于样品管中，用干净的剪刀将组织块剪碎。
（2）在样品管中加入如下试剂：500μl STE 溶液25 μl 蛋白酶K（Proteinase K，10 mg／ml）75μl 10％SDS（3）混匀后置56℃下消化2 小时以上（隔一定时间混匀一次）。
（4）加人等体积的饱和酚溶液，轻轻颠倒混合5 分钟以上（用于rDNA 和RAPD 分析的样品需抽提24 小时）。
（5）7 000r／min 离心5 分钟。
（6）小心将上层清液移至另一干净的离心管中，加入等体积的苯酚及氯仿，并重复步骤（4）和（5）的抽提过程。
（7）以等体积的氯仿（内含1／25 体积的异戊醇）重复步骤（4）和（5）的抽提过程。
（8）在上清液中加入1／10 体积的3mol／dm３NaAc 或5mol／dm３NH４Ac、2 倍体积的冷无水乙醇或1 倍体积的异丙醇，以沉淀DNA。
（9）置—70℃下沉淀2 小时或置—20℃下沉淀过夜。
常用缓冲液配制
常用缓冲液配制Buffer Formula (required precision; 2 %)Always to try to prepare buffer solution a t the temperature and concentration befor e planing to use during the experiment. Stock solutions are acceptable as long a s pH adjustment made after temperature and concentration adjustment. Also good buffers, e.g., Tris and Phosphate, are sta ble for a long time period.10X TE (10:2)1X1L 10X10mM Tris-HCl 8.9 g Tris-HCl5.3 g Tris-Base2 mM Na3EDTA 7.4 gpH 8 at 25 C. Mix and store at 4 C. Per iodically dump the 1X TE and make up t he fresh 1X TE from 10X stock.10X TE (10:1)1X1L 1X1L 10X10mM Tris-HCl 1.06 g Tris-HCl 10.6 g 0.39 g Tris-Base 3.94 g1mM Na2EDTA 0.475 g 4.75 gpH 8 at 25 C. Mix and store at 4 C.10X TE (50:50)1X1L 10X50 mM Tris-HCl 44.4 Tris-HCl26.5 Tris-Base50 mM Na3EDTA 186 gStore at 4 C.TE (25:10) 50 mM Glucose1X0.25 L 1X25 mM Tris-HCl 0.55 g Tris-HCl0.33 g Tris-Base10 mM Na3EDTA 0.92 g50 mM Glucose 2.25 gStore at 4 C.50 mM Tris pH 8.0 10 mM EDTA50 mM 1 M Tris pH 8.0 5 ml1 mM 0.5 M EDTA2 mlH2O up to 100 mlStore at 4 C.1 M Tris pH 8.0, 1.5 M NaCl1X1L 1X2L 1X1M Tris-HCl 88.8 g Tris-HCl 178 g53.0 g Tris-Base 106 g1.5 M NaCl 87.7 g 175 gStore at 25 C (room temperature is OK) 1 M Tris pH 7.4, 1.5 M NaCl1X1L 1X2L 1X1M Tris-HCl 132.2 g Tris-HCl 264.4 g19.4 g Tris-Base 38.8 g1.5 M NaCl 87.7 g 175 gStore at 25 C (room temperature is OK) 0.5 M Tris pH 7.5, 1.5 M NaClConc. 1 L 2L 3 L0.5 M Tris Tris-HCl 63.5 g 127.0 190.0 Tris-Base 11.8 g 23.6 g 35.4 g1.5 M NaCl 87.6 g 175.0 g 262.8 g Store at 25 C (room temperature is OK) 10 mM Tris pH 7.5, 15 mM NaClConc. Stock Volume10 mM 1 M Tris pH 7.5 100 µl15 mM 5 M NaCl 30 µlH2O to 10 mlStore at 4 C.10X TBE Buffer (pH 8)1X1L 10X 4L 10X89 mM Tris-Base 108 g 432 g89 mM Boric acid 55 g 220 g2 mM Na2EDTA 9.3 g 37.2 gEtBr (10mg/ml) 0.5 ml 2 mlMix and store at room temperature witho ut EtBr, 4 C with EtBr in a brown bottle. Use EtBr stock solution (10 mg EtBr/ml) when TBE is made.50X TAE Buffer (pH 8)1X1L 50X 1 L 10X40 mM Tris-acetate 242 g Tris Base 48.4 g57.1 ml acetic acid 11.4 ml2 mM Na2EDTA 37 g 7.4 gEtBr (10mg/ml) 2.5 ml 0.5 mlMix and store at room temperature witho ut EtBr, 4 C with EtBr in a brown bottle. Use EtBr stock solution (10 mg EtBr/ml) when TAE is made.Cotton DNA Extraction buffer (pH 6)Conc. Stock 1L 1X100 mM Na2citrate.2H2O 29.4 g Glucose 63 g5 mM 0.5 M Na2EDTA 10 mlNa2Diethyldithiocarbamic acid 10 gPVP-40,000 MW 20 gBSA 10 gAdjust to pH 6.0 with HCl. Store at 4 C. RSB (Reaction Stop Buffer)Conc. Stock Volume (ml)10 mM 1 M Tris pH 8.0 1.02 mM 0.5 M EDTA 0.40.2 % 20 % SDA 1.0H2O 97.6Store at room temperature.STE (Sodium chloride and TE) pH 8.0Conc. Stock 1X1 L 10X1L10 mM 1M Tris pH 8.0 10.0 8.88 g Tris-HCl5.3 g Tris-Base1 mM 0.5 M EDTA 2.0 4.65 g Na2EDTA100 mM 5 M NaCl 20.0 5.84 g NaClH2O up to 1 L up to 1 LpH 8.0 at 25 C. Store at 4 C.1.5 M NaCl 0.5 N NaOH1X1L 1X2L 1X0.5 N NaOH 20.0 g 40 g1.5 N NaCl 87.7 g 175 gStore at room temperature.0.2 N NaOH 0.6 M NaClConc. 1L 2L 3L 4L0.2 N NaOH 8.0 g 16.0 g 24.0 g 32.0 g0.6 M NaCl 35.04 g 70.08 g 105.2 g 14 0.2 gStore at room temperature.20X SSC (Adjust pH 7.0)1X1L 20X 2L 4L 6L150 mM NaCl 175.3 g 350.6 g 701 g 10 52 g15 mM Na3Citrate 88.3 g 176.6 g 353 g 530 g Mix, adjust pH to 7.0 with HCl, and store at 4 C25X SSC (Adjust pH 7.4)25X1L 4L3.0 M NaCl 219 g 876 g0.3 M Na2Citrate 110 g 440 gMix, adjust pH to 7.4 with HCl, and store at 4C.3 M K 5 M Ac1X200 ml 1 X3 M KAc 29.4 g (or 20 ml of5 M KAc) 2 M Acetic acid 23 mlDissolve the KAc in 150 ml of H2O, brin g to 177 ml, and then add the glacial ac etic acid. Mix and store at 4 C.Minimal Hybridization BufferConc. Stock 1L 2L10 % 50 % PEG 200 4007 % 20 % SDS 350 7000.6 X25 X SSC 24 4810 mM 1 M NaHPO4 10 205 mM 0.5 M EDTA 10 20100 µg/ml Denature Salmon Sperm 10 2 0H2O 396 792Aliquote 45 ml into 50 ml PPT, store at -20 C.Oligo BufferAfter preparing the following stock solutio ns, mix A, B, and C in a ratio of 1:2.5:1. 5, repectively.Solution AStock2-mercaptoethanol (bME) 18 µlDXTPs (A, T, G) 5 µl eachSolution O 850 µlStore at -20 CSolution OConc. Stock 250 ml 100 ml1.47 M Tris-Base 44.52 g 17.81 g0.147 M MgCl2 7.47 g 2.99 gAdjust pH to 8.0 with conc. HCl.Solution B: 2M hepes bufferConc. Stock 250 ml 100 ml2 M Hepes 119.15 g 47.66 gAdjust pH to 6.6 with 4 N NaOH. Store at 4 C.Solution CHexamer or oligo nucleotides. Add 55 µl H2O directly to the Pharmacia bottle whic h contains 50 units of lyophilized hexame r. Store at -20 C.KlenowDilute to 1 unit Klewnow fragment by ad ding klewnow buffer. Stock Klenow from BRL comes as 500 units in 84 µl. Dilute to 1 unit by adding 420 µl of klenow bu ffer to the 500 unit/84 µl stock. Store - 2 0 C.Klenow buffer (250 ml)Conc Stock7 mM Tris-HCl 0.211 g7 mM MgCl2 0.355 g50 mM NaCl 0.730 g50 % Glycerol 125 mlAdd the above to about 80 ml H2O. Stir to dissolve. Adjust volume to 250 ml wit h H2O. Store at -20 C.REact buffer (See Restriction enzyme buffer formula)10 X REact buffer 2 : for, e.g. Hind III and Sst 1 (5 ml)1 X Conc. Stock500 mM 1 M Tris (pH 8.0) 2.5 ml100 mM 1 M MgCl2 0.5 ml500 mM NaCl 0.5 ml25 mM Spermidine(3HCl) 0.032 gH2O 1.5 mlMix, aliquote 2 ml in screw-cap vial, store at -20 C.10 X REact buffer 3 : for, e.g. Eco RI(5.0 ml)1 X Conc Stock500 mM 1M Tris (pH 8.0) 2.5 ml100 mM 1M MgCl2 0.5 ml1 M 5 M NaCl 1.0 ml25 mM Spermidine(3HCl) 0.032 gH2O 1.0 mlMix, aliquote 2 ml in screw-cap vial, store at -20 C. HTTP/1.1 404 Object Not Found Server: Microsoft-IIS/5.0 Date: Wed,16 Nov 2005 02:44:39 GMT X-Powered-By: Connection: close Content-Type: text/htmlPHEM (500 mls) 2x18.14 g Pipes6.5 g Hepes3.8 g EGT A0.99 g MgSO4pH 7.0 w/ KOHPBS (5x in 500 mls)20.45 g NaCl0.465 g KCl10.142 g Na2HPO4*7 H2O0.545 g KH2PO4pH 7.2Mounting Media20mM Tris pH 8.00.5% N-propyl gallate90% GlycerolStore at 4oCPM Buffer* 100 ml 1 M PIPES (100 mM P IPES pH= 6.9)2 ml 1 M MgSO4, (2 mM MgSO4)2 ml 0.5 M EGTA (1 mM EGT A,)distilled water to 900 mladjust pH to 6.9distilled water to 1 literstore at 4oCValap*Put 50 g Vaseline, 50 g lanolin, and 50 g paraffin (all available from Fisher) in a 1 L Pyrex beakerHeat on "low" setting on a hotplate, stirring occasionally, until all components are melted and well mixedPour into several small screw-cap jars (~50 ml capacity)Store at room temperature20 x Energy Regeneration System*150 mM creatine phosphate (Boehringer #127574) 2 ml of 100 mM MgATP Stock (20 mM ATP, 20 mM MgSO4)40ml 0.5 M EGT A (2 mM EGT A)distilled water to 10 mlDisburse into 100 ml aliquots and store at -20oC Isolation Buffer*20 ml 5 M NaCl Stock (0.1 M NaCl)4 ml of 1 M MgSO4 Stock (4 mM MgSO4)2 ml of 0.5 M EDTA (1mM EDT A)10 ml of 1 M HEPES Stock (10 mM HEPES) distilled water to 900 mladjust pH to 7.0distilled water to 1 literstore at 4oCHigh Salt Buffer*120 ml of 5 M NaCl Stock (0.6 M NaCl)4 ml of 1 M MgSO4 Stock(4 mM MgSO4)2 ml of 0.5 M EDTA (1mM EDT A)10 ml of 1 M HEPES Stock (10 mM HEPES) distilled water to 900 mladjust pH to 7.0distilled water to 1 literstore at 4oC10 x Column Buffer*500 ml 1 M PIPES Stock (250 mM PIPES)40 ml of 0.5 M EGT A Stock (10 mM EGT A)40 ml of 1 M MgSO4 Stock (5 mM MgSO4)distilled water to 1800 mladjust pH to 6.7distilled water to 2 litersStore at 4oCHomogenization Buffer*300 ml PM buffer52.3 mg PMSF (1mM PMSF)3 g leupeptin (10 mg/ml leupeptin)300 mg pepstatin A (1 ug/ml pepstatin A)3 mg T AME (10 ug/ml T AME)mix well to dissolve, use immediatelyPMG Buffer*80 ml 1 M PIPES Stock (80 mM PIPES)2 ml 1 M MgSO4 Stock, (2 mM MgSO4)2 ml 0.5 M EGTA Stock (1 mM EGT A,)600 ml Glyceroldistilled water to 900 ml, mix welladjust pH to 6.9distilled water to 1 literstore at 4oCPBS*8.18 g NaCl (140 mM NaCl)0.186 g KCl (2.5 mM KCl)0.218 g KH2PO4 (1.6 mM KH2PO4)2.15 g Na2HPO4 (15 mM Na2HPO4)distilled water to 1 literStore at room temperature1M MgSO4Stock*24.074 g MgSO4distilled water to 200 mlstore at room temperature1 M HEPES, pH = 7.0 Stock*119.15 g HEPES (free acid)distilled water to 400 mladd solid NaOH a few pellets at a time while mixing until the pH is ~6.8add concentrated NaOH dropwise to achieve pH = 7.0distilled water to 500 mlsterile filter and store at 4oC1 M PIPES, pH = 6.9 Stock*151.2 g PIPES (free acid)distilled water to 400 mladd solid NaOH a few pellets at a time while mixing until the pH is ~6.7add concentrated NaOH dropwise to achieve pH = 6.9 distilled water to 500 mlsterile filter and store at 4oC0.5 M EDTA Stock*16.81 g EDT A (Sodium Salt)distilled water to 90 mlAdjust pH to 7.0Distilled water 100 mlStore at room temperature0.5 M EGTA Stock*19.02 g EGT A (Sodium Salt)distilled water to 90 mlAdjust pH to 7.0Distilled water to 100 mlStore at room temperature1M dithiothreitol (DTT)*1.542 g dithiothreitoldistilled water to 10 mldisburse into 500 ml aliquots and store at -20oC1 M KCl Stock*74.55 g KCldistilled water to 1 literstore at room temperature10 M NaOH Stock*40 g NaOHdistilled water to 100 mlstore at room temperature100 mM MgGTP Stock*check formula weight of the lot of GTP you have, determine the amount required for 10 ml of a 100 mM solution.add 8.5 ml distilled water to the determined amount add 1 ml of 1M MgSO4 Stockadjust pH to 7.0,distilled water to 10 mldisburse into 200 ml aliquots, store at -20oC100 mM MgATP Stock*check formula weight of the lot of ATP you have, determine the amount required for 10 ml of a 100 mM solution.add 8.5 ml distilled water to the determined amount add 1 ml of 1M MgSO4 Stockadjust pH to 7.0distilled water to 10 mldisburse into 200 ml aliquots, store at -20oC5 M NaCl Stock*292.2 g NaCldistilled water to 1 literstore at room temperature3.6 mM Brefeldin A*10 mg Brefeldin A (available from Epicenter T echnologies Madison, WI)absolute ethanol to 12 mlstore at -20oC30 x NaF*378 mg NaF (0.9 M NaF)distilled water to 10 mlStore at -20oC30 x AlCl3*20 mg (1.5 mM AlCl3)distilled water to 100 mlStore at room temperature30 mM Mg GTP-g-S*10 mg GTP-g-S tetralithium salt (available from Boehringer Mannheim #220 467)18 ml 1 M MgSO4 Stock (30 mM MgSO4)add 572 ml distilled water (to 592 ml)Store at -20oC150 mM Mg AMP-PNP*25 mg AMP-PNP (available from Boehringer Mannheim #102 547)90 ul 1 M MgSO4 Stock (150 mM MgSO4)add 225 ml distilled water (to 315 ml)Store at -20oC100 mM Sodium orthovanadate*1.839 g Sodium orthovanadatedistilled water to 8 ml in a screw cap tubeadjust pH to 10if solution is yellow, place in boiling water until clear recheck pH, repeat as necessaryadjust to final concentration by checking A265 nm, ext. coeff.= 2925M-1cm-1and adding distilled water as neededstore at -20oC3 M KI*4.98 g KIadd distilled water to 10 mlstore at room temperature0.5 M Na2CO3*531 mg Na2CO3add distilled water to 10 mlstore at room temperature L B BrothIn 1 liter of ddH2O, combine:10 grams Bacto-tryptone5 grams Bacto-yeast Extract5 grams NaClStir until dissolved.。
分子实验常用的DNA提取技术
一DNA提取动物DNA的分离通常是在有EDTA及SDS一类的去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实验的。
低分子量杂质则用透析法加以去除。
这一方法获得的DNA，大小为100-150bp。
含有SDS的DNA样品应该使用NaCl，这时该去污剂在70%的乙醇中仍保持可溶。
从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚：氯仿然后用氯仿抽提，这一流程的原理是：用两种不同的有机溶剂去除蛋白质比用单一有机溶剂效果更佳。
继而用氯仿抽提可以除去核算制品中的残余的痕量酚。
1.取约0.03克酒精保存的动物组织（常用肌肉），用剪刀剪成糊状。
用去离子蒸馏水浸泡12-24小时，期间换水2-3次（目的是使组织中的乙醇水化）。
然后用PH值8.0的STE洗涤该组织两次，离心后倒掉STE液（防止有水分的存在使得PH降低）。
2.加入500μlSTE缓冲液（30mM Tris-HCl,200mMEDTA,50mMNaCl,PH8.0）和终浓度分别为10%的SDS（约75μl）和200μg/ml的蛋白酶K（约25μl）。
3.如果使用血液样品，则先加入450μlSTE缓冲液（30mM Tris-HCl,200mMEDTA,50mMNaCl,PH8.0），然后取150μl血液加入离心管中，最后分别加入终浓度分别为10%的SDS（约75μl）和200μg/ml的蛋白酶K（约25μl）。
4.组织样品充分混匀后置于56℃恒温箱中消化8-12小时至澄清，期间摇匀数次。
血样充分混匀后置于恒温箱（56℃）消化约12小时并根据消化颜色由鲜红转为深红以及慢倾离心管观察，直至血渣消化完全。
5.开盖之前，离心管瞬时离心（使样品回落管中）。
加入等体积的约700μl的水泡和酚或者Tris饱和酚（下液面黄色物质，酚的PH值必须接近8.0.以防止DNA在有机相和水相交界面上滞留），缓慢的来回颠倒离心管10-20分钟或者转盘上旋转12-20小时，混合两相。
手摇抽提5分钟，后于室温9000转/分离心10分钟，将上清液转移至干净的Eppendorf管中。
革兰氏阳性菌质粒碱裂解法提取
革兰氏阳性菌质粒碱裂解法提取具体步骤：（1）将待检测菌株接种于3 mL LB或BHI培养基（含终浓度为170µg/mL的氯霉素）中，37℃培养过夜；（2）取1.5 mL上述菌液于2 mL离心管，12,000×g，离心0.5min，尽可能吸尽上清液，若菌体过少可重复一次；（3）加入1mL STE缓冲液（pH8.0），用旋涡振荡器充分悬浮菌体，再12,000×g，离心2min，尽可能吸尽上清液，重复1~2次以洗涤菌体；（4）加入150 µL冰预冷碱裂解液Ι，用旋涡振荡器充分悬浮菌体；然后，加入40 µL溶菌酶（10mg/mL），此时不得涡旋！上下颠倒离心管、混合均匀，然后37℃放置30~45min；（5）沿管壁加入300 µL现配碱裂解液Π，轻轻颠倒离心管4~ 5 次，混合均匀、不得涡旋，置于冰上5 min；（6）迅速加入200 µL冰预冷碱裂解液Ш, 轻轻颠倒离心管4~ 5 次, 混合均匀、不得涡旋，置于冰上3~5min;之后，12000×g，4℃离心8min（也可室温离心5 min）；（7）用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积酚/氯仿（1:1）抽提，12,000×g离心5 min，重复操作一次；（8）移取上清液移至新的1.5 mL离心管中，加入1倍体积冰预冷无水乙醇和0.1倍体积3M 醋酸钠，室温沉淀10min（或4℃沉淀过夜），12,000×g离心5 min，尽量去掉酒精；（9）用0.5 mL冰预冷70％酒精洗DNA沉淀一次，12,000×g，4℃离心2 min，小心地吸去上清液，室温风干10 ~15 min；（10）加50µLTE缓冲液（含终浓度为50µg/mL的RNaseA酶，pH8.0）溶解DNA沉淀，-20℃保存。
试剂配制:（1）LB培养液：Tryptone 10 gYeast Extract 5 gNaCl 10g双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。
DNA合成 常见问题解答
DNA合成常见问题解答Q1. 如何保存寡核苷酸？通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。
寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。
若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。
另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。
Q2. 如何重悬寡核苷酸？为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTApH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。
重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。
寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。
Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？脱水的寡核苷酸是长期稳定的。
即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。
Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。
为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。
由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸?合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。
通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。
Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？寡核苷酸的量经常用OD值来描述。
1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。
因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。
dT: 8.8 ml/µmoldG: 11.7 ml/µmoldC: 7.3 ml/µmoldA: 15.4 ml/µmol对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。
(整理)线粒体COI基因克隆
线粒体COI基因的分子克隆一、试剂材料1、500一800克重的活鲤鱼和1500一2500克重的活草鱼各五条2、STE缓冲液(0.25mol/L蔗糖，10mmol/L Tris·HCI，1mmol/L EDTA，pH8.0) 1L3、STM缓冲液(0.25mol/L蔗搪，10mM Tris·HCl，0.5mmol/L Mgcl2，PH8.0) 50mL4、DNasel 2mg5、0.5mol/L EDTA pH8.0 10mL6、NTE缓冲液(20mmol/L NaCI，20mmol/L Tri s·HCI，lmmol/L EDTA，pH8.0) 50mL7、20% SDS8、苯酚50ml9、3mol/L NaAC (pH 4.8) 5mL10、冷乙醇(100%) 50mL11、95%乙醇200Ml12、TE缓冲液(10mmol/LTrisHcl，1mmol/LEDTA，pH8·0)，10mL13、10mg/ml DNA一freeRNaseA溶液（溶解RNase A 于TE 缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10～30min, 除去DNase 活性，-20℃贮存）40ul14、氯仿:苯酚:异戊醇(Vl:V2:V3为24:24:l) 49ml(24+24+1)1、引物1 、引物22、10×PCR 缓冲液（Buffer ）3、2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM4、Taq酶5、琼脂糖：1.0%；6、电泳缓冲液（50 ×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸 5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至100ml）7、溴化乙锭EB：5 µl / 100 ml8、溴酚蓝指示剂14、限制性内切酶BamH I、EcoR I、Hind II、Hind III和Pst l，16、氨苄青霉素(100ug/ml)的LB平板（胰蛋白胨10g ，酵母提取物5g，NaCl 10g ，加水至1000ml , 若配置固体培养基，则再加入15g Agar(琼脂) 。
TSA溶液(pH8.0)
北京雷根生物技术有限公司
TSA 溶液(pH8.0)
简介：
Tris(三羟甲基氨基甲烷)为弱碱， 分子式为 C4H11 NO 3， 相对分子量为 121.14, 在 25℃ 下 pKa 为 8.1，Tris 缓冲液的有效缓冲范围在 pH7.0～9.2 之间，用来作为各种缓冲液的基 础成分，调节酸碱度。TSA 溶液(pH8.0) 由 10mM Tris-HCl (pH8.0) 、140mM 氯化钠、防 腐剂等组成，用于清洗和保存细胞。
组成：
编号 名称 TSA 溶液(pH8.0) 使用说明书 PP0079Leabharlann 500mlStorage RT
1份
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作，无需稀释，直接使用。 1、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12 个月有效。
碱裂解法提取质粒DNA
碱裂解法
1、取1.5ml培养液倒入1.5ml离心管中，4℃下12000g离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。
4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl，盖紧管口，快速温和颠倒离心管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。
5、加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4℃下12000g离心5-10分钟。
6、上清液移入干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5分钟。
7、将水相移入干净离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。
8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5-10分钟。
9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10、将沉淀溶于20μl STE缓冲液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，储于-20℃冰箱中。
[注意]1.提取过程应尽量保持低温。
2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。
3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。
沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
53种常见缓冲液配制方法及胶体金试剂资料
53种常见缓冲液配制方法乙醇－醋酸铵缓冲液(pH3.7)取5 mol/L醋酸溶液15.0 ml，加乙醇60 ml和水20 ml，用10 mol/L氢氧化铵溶液调节pH值至3.7，用水稀释至1000 ml，即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)取三羟甲基氨基甲烷12.14 g，加水800 ml，搅拌溶解，并稀释至1000 ml，用6 mol/L盐酸溶液调节pH值至8.0，即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.1)取氯化钙0.294 g，加0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液40 ml使溶解，用1 mol/L盐酸溶液调节pH值至8.1，加水稀释至100 ml，即得。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH9.0)取三羟甲基氨基甲烷6.06 g，加盐酸赖氨酸3.65 g、氯化钠5.8 g、乙二胺四醋酸二钠0.37 g，再加水溶解使成1000 ml，调节pH值至9.0，即得。
乌洛托品缓冲液取乌洛托品75 g，加水溶解后，加浓氨溶液4.2 ml，再用水稀释至250 ml，即得。
巴比妥缓冲液(pH7.4) 取巴比妥钠4.42 g，加水使溶解并稀释至400 ml，用2 mol/L盐酸溶液调节pH值至7.4，滤过，即得。
巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥5.52 g与巴比妥钠30.9 g，加水使溶解成2000 ml，即得。
巴比妥－氯化钠缓冲液(pH7.8) 取巴比妥钠5.05 g，加氯化钠3.7 g及水适量使溶解，另取明胶0.5 g加水适量，加热溶解后并入上述溶液中。
然后用0.2 mol/L盐酸溶液调节pH值至7.8，再用水稀释至500 ml，即得。
甲酸钠缓冲液(pH3.3)取2 mol/L甲酸溶液25 ml，加酚酞指示液1滴，用2 mol/L氢氧化钠溶液中和，再加入2 mol/L甲酸溶液75 ml，用水稀释至200 ml，调节pH值至3.25～3.30，即得。
邻苯二甲酸盐缓冲液(pH5.6)取邻苯二甲酸氢钾10 g，加水900 ml，搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000 ml，混匀，即得。
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组成：
名称 STE 缓冲液(pH8.0) 使用说明书
操作步骤(仅供参考)：
1、 按实验具体要求操作。
编号 R00178 Storage
100ml
4℃
1份
注意事项：
1、 注意无菌操作，避免微生物污染。 2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12 个月有效。
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编号 CC0005 PE0080 PT0013 PW0040 PW0082 TO1013
北京雷根生物技术有限公司
STE 缓冲液(pH8.0)
简介：
Tris(三羟甲基氨基甲烷)为弱碱，分子式为 C4H11NO3，相对分子量为 121.14, 在 25℃ 下 pKa 为 8.1，Tris 缓冲液的有效缓冲范围在 pH7.0～9.2 之间，用来作为各种缓冲液的基 础成分，调节酸碱度。STE 缓冲液(pH8.0)由 10mM Tris-HCl (pH8.0)、100mM NaCl、 1mM EDTA(pH8.0)组成，简称为 STE，属于 pH 缓冲液，经高压灭菌处理。
名称 磷酸缓冲盐溶液(1×PBS,无钙镁) Tris-HCl 缓冲液(1mol/L,pH6.8) 考马斯亮蓝快速染色液 Western blot 一抗稀释液 丽春红 S 染色液(1×Ponceau S) 丙二醛(MDA)检测试剂盒(TBA 比色法)