用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法
吉林大学22春“药学”《生物制药学》期末考试高频考点版(带答案)试卷号：1
吉林大学22春“药学”《生物制药学》期末考试高频考点版（带答案）一.综合考核(共50题)1.超滤的目的是()。
A.去除沉淀物及病毒B.去除残余的杂蛋白C.与多聚体分离D.进一步去除病毒参考答案：A2.简述酶化学修饰的目的。
参考答案：酶化学修饰目的在于人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。
3.某一重组质粒(7.5kb)的载体部分有2个SmaI酶切位点。
用SmaI酶切后凝胶电泳上出现4条长度不同的条带，其长度总和与已知数据吻合，该重组质粒中插入的外源DNA片段上的SmaI酶切位点共有()。
A.5个B.4个C.3个D.2个参考答案：D4.下列哪种物质可以用作固定化酶交联的试剂?()A.乙醇B.乙酸C.戊二醛D.乙酸乙酯参考答案：C下列哪种物质对头孢菌素C的生物合成具有诱导作用?()A.缬氨酸B.苯乙酸C.苯乙酰胺D.L-甲硫氨酸参考答案：D6.简述色谱技术的种类。
参考答案：色谱法有许多种类，从不同的角度，有不同的分类方法。
(1)按两相所处的状态分为气液色谱、气固色谱、液固色谱、液液色谱。
(2)按色谱分离过程的机理分为吸附色谱、气液分配色谱、离子交换色谱。
(3)按固定相形式的不同分为柱色谱、纸色谱、薄层色谱。
(4)按操作形式不同分为冲洗法、顶替法、前沿法。
7.基因工程药物质量控制包括哪几个方面?参考答案：(1)蛋白质含量的测定(2)蛋白质纯度检测(3)蛋白质Mr测定(4)蛋白质等电点测定(5)蛋白质序列分析(6)内毒素分析，宿主蛋白液和酸残留分析8.发酵过程的溶氧浓度的控制。
参考答案：供氧方面：在实际生产中通常从提高氧的容积氧传递系数KLα着手，提高设备的供氧能力。
除增加通气量外，一般是改善搅拌条件。
通过提高搅拌转速或通气流速、降低发酵液的黏度等来提高KLα值，从而提高供氧能力。
改变搅拌器直径或转速可增加功率输出，从而提高α值。
第3章 动物细胞工程制药(二)
2. 主要参数癿检测和控制方法
（1）温度（电阻温度计） （2）pH（复合式参比电极） （3）溶氧（极谱式或电流式覆膜电极） 为保持所需的溶氧，目前常采用的措施（P115） （4）搅拌（电磁感应癿转速计） （5）迚出液流量（泵速癿控制） （6）其他
温度传感器
pt-100温度传感器探头
DO电极
pH电极
显 微 镜 下 的 微 载 体
• 第二代微载体——多孔微载体/多孔微球 • 材粒：蛋白类（明胶、胶原）、纤维素、高分子塑料、特 种橡胶、玻璃、陶瓷…… • 优点：极大地增大了供细胞贴附的比表面积 • 缺点：培养条件不易均一，传质和传氧条件要求更高，清 洗较困难。
•
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ ⑩
3.灌流式操作
• 灌注式操作是指细胞接种后迚行培养，一方面新 鲜培养基丌断加入反应器。一方面又将反应液连 续丌断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处 于一种丌断癿营养状态。 • 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件较 好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～108 个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低温 下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提高， 生产成本明显降低。
2.半连续式操作
• 半连续培养又称为反复分批式培养或换液培养。 • 是指在分批式操作癿基础上，每间隔一段时间，丌 全部取出反应系，而只取出部分培养物（或单纯条 件培养基，或连同细胞、载体），剩余部分重新补 充新癿营养成分，或另加新鲜载体，再继续培养， 这是反应器内培养液癿总体积保持丌变癿操作方式。 • 该法应用广泛，优点是操作简便，生产效率高，可 长时期迚行生产，重复收获产品，而且可使细胞密 度和产品产量一直保持在较高癿水平。
动物细胞多方法规模性培养技术综述
№.3 陕西科技大学学报 J un.2005 Vol.23 J OU RNAL OF SHAANXI UN IV ERSIT Y OF SCIENCE&TECHNOLO GY ・117・ 文章编号:1000-5811(2005)03-0117-05动物细胞多方法规模性培养技术综述3田三德,李成涛(陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西咸阳 712081)摘 要:简要概括了近年来国内外动物细胞多方法规模性培养技术的发展状况以及目前已为人们确定的主要开发应用技术的种类、特点及应用范围,主要包括悬浮培养、微载体培养、多孔载体培养、微囊化培养、中空纤维法培养等,指出了细胞培养技术和应用领域日趋广泛的前景。
关键词:动物细胞;细胞培养技术;发展前景中图分类号:Q813.1 文献标识码:A0 引言动物细胞培养工程作为生化工程学科领域迅速发展起来并具有生物技术与化学工程结合特色的新型工程学,无论在其基础研究还是应用研究方面都越来越受到生物技术界的重视,现已成为生化工程学科主要的前沿领域之一。
利用人工培养的动物细胞可以分离和鉴定病毒,进行遗传工程、代谢及其调节方面的研究,并能发挥其在表达产物方面的优点(如转录后修饰和产物胞外分泌等),生产出许多与人类健康和生存密切相关的生物技术产品〔1〕。
因此,细胞培养工程正逐步进行了简要的成为一个独特的高新技术产业,并显示出巨大的工业发展前景。
本文对近年来国内外动物细胞多方法规模性培养技术的发展状况以及目前已为人们确定的主要开发应用技术的种类、特点、应用范围和发展方向评述。
1 现代动物细胞的培养技术动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上并融合了固定化细胞、流式细胞技术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的,主要包括悬浮培养、微载体培养、多孔载体培养、微囊化培养、中空纤维法等。
1.1 悬浮培养技术〔2,3〕少数动物细胞属于悬浮生长型,它们在离体培养时不需要附着物,只需悬浮于培养液中就可以良好生长。
动物细胞大规模培养的方法
动物细胞大规模培养的方法《动物细胞大规模培养的方法》一、综述动物细胞在医学、生物制药和科学研究中发挥着重要作用，但其大规模培养至今仍是一个挑战。
近年来，随着生物技术的发展，细胞可以通过人工方法大规模培植，从而获得较高纯度的大规模细胞所需要的成本降低，从而实现药物研发、检测疾病等基础研究的进一步深入和拓展。
本文就大规模培养动物细胞的方法进行综述。
二、培养基1.细胞培养基细胞培养基是支持细胞增殖和生长所必需的基础，可以提供必要的营养和生长因子。
常见的细胞培养基有Eagle's minimal essential medium（E的最小必需培养基）、RPMI-1640培养基、DMEM-F12-K Medium （F-12）、MCDB-153培养基等。
2.表面活性剂表面活性剂是指在水溶液（或其他溶剂）中构成有机分子表面的有机化合物，有良好的乳化和表面活性，能有效地改善细胞在培养基和细胞外液中的分布和添加，可以改善细胞的生长和健康状态。
三、培养方法1.平板培养法平板培养是一种简单的培养方法，它是将细胞悬浮液分散均匀的滴在平面上，使细胞生长形成单层。
平板培养的优点是简单易行和细胞分散均匀，但缺点是细胞的生长速度较慢。
2.悬浮培养悬浮培养是利用细胞的自我复制和细胞的浮力来保持细胞在溶液中的悬浮状态，悬浮培养有利于细胞的大量增殖，并且因为总容积的增加，细胞的吸收和新陈代谢作用也能够得到很好地利用。
3.体外培养体外培养是指把细胞从原位割取，将其培养在人工条件下的培养基中，以促进其增殖、发育和分化。
体外培养的优点是可以满足细胞增殖和要求，但缺点是需要大量的实验空间和费用，而且容易受到室温和湿度等条件的影响。
四、细胞增殖1.细胞再分化细胞再分化是指在细胞培养基中添加适当的分化因子来实现细胞功能的再分化，以达到大规模细胞增殖的目的。
常见的分化因子包括细胞因子、生长因子、激素和其他物质，如蛋白质、碳水化合物等，这些物质都能够影响细胞的增殖和发育。
动物细胞高密度培养用多孔微球
《生物工程进展》1998,V o l.18,N o.2动物细胞高密度培养用多孔微球王佃亮 肖成祖(中国人民解放军航空医学研究所 100036) 多孔微球(po rou s m icro sp heres)又称多孔微载体(po rou s m icrocarriers)或大孔微载体(m acropo rou s m icrocarriers),是近几年在国外发展起来的一项新的动物细胞高密度培养生物技术。
它克服了固体微载体(so lid m icrocarr2 iers)培养时细胞仅在表面生长、微囊(m icro2 cap su les)培养时细胞仅在内部生长的缺陷,培养细胞可在载体的内外表面生长,因而可达到很高的密度(杂交瘤细胞密度可达5×107cells m l培基,贴壁依赖性细胞密度可达122×108cells m l微球)[1]。
Griffith s曾高度评价它是微载体发展的第二阶段,是细胞培养技术的一次革命[2]。
一、多孔微球的优越性在利用动物细胞大量培养技术生产生物制品(主要指预防、诊断、治疗三大类试剂)过程中,将动物细胞进行固定既可以增强培养物和产物的稳定性,又可提高单位细胞密度和产量并长期生长。
在现有的固定方法中,固体微载体发展得最早最为成熟;近30年中为生物制品的生产立下了很大功绩。
但随着生物技术的发展,固体微载体所固有的某些缺陷也日益暴露出来,主要有:1、生物量增长少,生产率相对较低(因为表面积 体积比率低);2、不适于悬浮细胞培养和长期操作,尤其是无血清培基;3、培养细胞暴露于剪切应力和气—液界面,易受损伤;4、在灌流培养中细胞易洗脱,成熟细胞有时会从微载体表面解离;5、微载体使用浓度高,接种体积大。
多孔微球是一种具有相互连接的孔结构的小珠,就象细胞外基质(ex tracellu lar m atrix)一样提供了细胞生长的三维骨架,它的主要优点是:1、已商品化;2、可适用于固定床、流化床、气升式和普通搅拌式等多种动物细胞培养系统;3、可在反应器中直接接种;4、为贴壁依赖性细胞的生长提供了大的表面积,细胞可在微球的内外表面生长;5、某些多孔微球还具有包埋悬浮细胞的能力,为其提供剪切保护和阻止在灌流培养中被洗脱,且生产的产品质量较高;6、可支持较固体微载体高的单位微载体床体积细胞密度,可在较高的转速下培养,从而提高KLA(m ass tran sfer coefficien t),使氧的传递更为有效。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
动物细胞培养技术
环境能力差; ②倍增时间长, 生长缓慢, 易受微生物污染,
培养时须用抗生素; ③培养过程需氧量少(氧传质系数 kLa 大于10 h - 1即可满足每毫升107 个细胞的生长) ; ④ 培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在; ⑤原代培养 细胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代谢产物具有生物活
性, 生产成.本高, 但附加值也高。
备可供使用。
1. 2. 2
琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的琼脂糖
溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油) , 形成直径0. 2
mm 凝胶珠珠, 移去石蜡油后, 细胞即可进行培养。同海
藻钙一样, 琼脂糖更适于培养悬浮细胞。尽管凝胶珠形
成过程很复杂, 目前放大灌注的培养基可以提供充分的营养成分, 并可带
走代谢产物, 同时, 细胞保留在反应器系统中,可以达到 很高的细胞密度。同其他方法相比,灌注培养的产率可 以提高一个数量级, 并可大大降低劳动力消耗。
灌注培养主要可分为两大类: 悬浮灌注培养和 床层培养(图1)。悬浮灌注培养是在普通悬浮培 养的基础上, 加上一个细胞分离器而成, 以微载体 悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。床层培养 则把细胞直接保留于床层, 不需要细胞分离器, 其 中堆积床和大孔载体培养的应用较广。 2 灌注培养方法 在灌注培养前, 对动物细胞的生长和生理特性 进行充分的考察, 是十分必要的, 能为灌注培养提 供有益的参考。以比生长速率为例, 大量实验表 明, 细胞的比生长速率降低时, 产物的比生长速率 提高，有人控制细胞的比生长速率为最大比生长 速率的60%抗体生长速率增加了97%。 灌注培 养可以从两个方面入手, 一是改变动物细胞的培 养环境, 实行阶段培养; 二是进行代谢调控。
1. 2. 1
动物细胞工程制药-2
灌流式操作
定义：当细胞和培养基一起加入反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部 分条件培养基取出，同时不断地补充新鲜培 养基
灌流式操作是近代用动物细胞培养生产各种 药品最受推崇的方式
优点：①细胞可处在较稳定的良好环境中，营 养条件较好，有害代谢废物浓度较低。②可极 大地提高细胞密度，一般都可达107-108个/时， 从而极大地提高了产品产量。③产品在罐内停 留时间缩短，可及时收留在低温下保存，有利 于产品质量的提高。④培养基的比消耗率较低，
半连续式操作
定义：当细胞和培养基一起加人反应器后， 在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段 时间，取出部分培养物，或单纯是条件培养 基，或连同细胞、载体一起，然后补充同样 数量的新鲜培养基，或另加新鲜载体，继续 培养
半连续式操作在动物细胞培养和药品生产中 被广泛采用
优点：操作简便，生产效率高，可长时期进 行生产，重复收获产品，而且可使细胞密度 和产品产量一直保持在较高的水平
缩在微囊内，从而有利于下游产物的纯化。④可采
用多种生物反应器进行大规模培养，如搅拌罐式生 物反应器，气升式反应器等
结团培养：1980年首创，该方法用细胞本身作 为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培
养
优点：操作简便，节省了用于微载体的成本
二、动物细胞培养的操作方式
分批式操作
补料-分批（或流加式）操作
冶金研究所等单位制备成功一批葡聚糖类（MC-1
型、CT-1型、CT-3型）、聚苯乙烯类（SH-2型、 PS-1型）和胶原类（GT-2型）等微载体
微载体培养的优点：既可创造相当大的贴附面 积供细胞贴附生长增殖，满足绝大多数细胞的
动物细胞大规模培养方法分析
科技论坛动物细胞大规模培养方法分析吴旭国（哈尔滨三木制药厂，黑龙江五常150232）摘要：动物细胞大规模培养方法已经广泛应用于生产各种生物制品，也广泛应用于各种兽用疫苗的生产。
动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。
目前,动物细胞有悬浮培养和贴壁培养，技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量。
针对贴壁培养、悬浮培养和固定化培养等三种培养方法进行概述。
关键词：动物细胞；细胞培养；方法分析1细胞生长的基质依赖性1.1细胞对基质的依赖性根据细胞的生长特性和对基质的依赖性，可分为贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。
贴壁依赖性细胞的生长需要适量带电荷的固体或半固体支持表面，细胞自身分泌或人为在培养基中加入贴附因子，使细胞依附在支持物表面、才能生长和增殖，大多数动物细胞都属于此类，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞。
接触抑制性是当细胞长满整个培养表面后，就不再生长了，但仍然能存活一段时间。
非贴壁依赖性细胞的生长不依赖于固体支持物表面，可在培养液中悬浮生长，所以也被称为悬浮细胞。
血液、淋巴细胞、肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些转化细胞属于此类。
有些细胞对固体支持物的依赖性不严格，可以贴壁生长，但在一定条件下，也可以悬浮生长。
1.2生长基质贴附细胞生长需要一个支持介质，培养器皿表面的材质不适合，因此人们采用在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞的贴附和生长。
把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质称为生长基质。
生长基质一般为胞外基质成分，主要介绍多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。
多聚赖氨酸是合成的赖氨酸多聚体，分子量为7-30ku的多聚赖氨酸可作为细胞生长基质。
纤维连接蛋白是细胞表面与血清浆中的大蛋白分子，具有维持细胞结构、促进贴附功能。
层黏蛋白为胞外基质中分子量900ku的非胶原性糖蛋白，影响细胞的贴附和运动，调节细胞生长和分化。
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展
大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品的研究进展动物细胞培养开始于本世纪初1962 年，其规模不断的扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，，而大规模动物细胞培养技术已经成为生物技术制药中非常重要的环节。
目前，大规模动物细胞培养技术在兽用生物制品上面，也已经开始了一些大规模的生产应用，细胞大规模培养技术作为行业技术升级改革的重要内容，农业部自2012年2月1日起，停止受理转瓶培养生产方式的的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。
因此，传统转瓶工艺的应用越来越受到限制使用。
自从20世纪60年代微载体生物反应器培养技术建立以来，国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究，细胞悬浮培养已是当前国际上生物制品生产的主流模式。
动物细胞有悬浮培养和贴壁培养两种，技术水平的提高主要集中在培养规模的扩大、细胞培养环境的优化、细胞特性的改变、不断提高产品的产量及保证其质量上。
本文就大规模动物细胞培养技术在兽用疫苗上的应用进行综述，分析了其在獸用生物制品产业的发展趋势。
一、动物细胞培养方法1.贴壁培养贴壁培养是指细胞贴附在某种载体上，载体悬浮在反应器里的培养方法，一切贴壁型细胞都能够适用于贴壁培养。
在实际生产中具有贴壁生长特性的细胞种类较多，如CHO细胞、PK—15细胞、ST细胞和Vero细胞等。
由于贴壁细胞具有贴壁的要求，提高细胞的密度就是使细胞培养规模最大化的有效方法。
传统的贴壁细胞培养包括方瓶、扁瓶、转瓶等。
但是由于其不能有效监控细胞的生长，操作比较复杂，所占空间大，劳动量也大，贴附面积具有限制性，在实际生产使用中受到极大的限制。
目前，贴壁细胞的微载体培养在细胞生产中得到广泛的应用。
2.悬浮培养悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便，细胞经过一定程度的驯化培养后，直接悬浮在适宜的液体培养基中，置于特定的培养条件下即可良好的生长。
传代时也不需要再进行分散，只需要添加一定比例的培养基即可继续生长。
大规模动物细胞培养问题及对策
动物细胞大规模培养方法及其应用
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动物细胞大规模培养技术失建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。 主要包括： 悬浮培养 微载体培养 微囊化培养 中空纤维法 利用大规模培养哺乳类细胞是一项重要的生产生物制品的技术，包括疫苗、干扰素、激素、生长因子和单抗等，具有很高的经济和社会效益。
动物细胞培养应用
1962年开始，用于生物医学研究，生产酶制剂，生长因子，疫苗，单抗等
Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺
DMEM培养基
胎牛血清
其他成分
锥形瓶逐级放大培养
加碱（碳酸氢钠）
加糖（葡萄糖）
灌注培养液
微载体
5L种子罐培养
培养液
50L 生 物 反 应 器 细胞培养环境
在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。
方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。
微囊化方法能使细胞处于相对稳定、受剪切力小的环境中，而养分和氧又可以从微囊外的培养液扩散进入。
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4、微囊化培养
5、中空纤维培养系统
中空纤维是聚砜或丙烯的聚合物制成，一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，然后封存在特制的圆筒中，组成的培养系统。每根纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液供细胞生长；管与管之间称为“外室”。接种的细胞就贴在管壁上，并吸取“内室”渗透出来的养分，迅速生长繁殖。
哺乳动物细胞大规模培养概述
哺乳动物细胞大规模培养概述自1950年前后，开发体外培养动物细胞以来，无数类型动物细胞，包括正常的和肿瘤的都能在各种单层培养系统中生长。
早期大量培养动物细胞，是为了扩大病毒肿瘤讨论领域的需要，后来随着医疗、免疫和细胞生物化工制品的进展，动物需要量越来越多，诸如生产病毒、干扰素、、免疫等产品需要大量培养动物细胞。
因为生产需要，推进了动物细胞大量培养的新工艺、新技术向大规模、自动化和精巧化方向进展。
（一）细胞大，培养的主要过程 1．细胞株复苏从液冻存或超低温冻存的冻存盒中取出，根据复苏操作流程操作，接种在24孔、6孔细胞培养板的培养孔内培养，或接种于25cm2培养方瓶中培养。
2．种子扩大培养为了获得足够接种生产罐所需的细胞，需要举行延续的扩大培养。
如24孔细胞培养板的培养孔细胞生长到达对数生长的中、后期时，接种到6孔细胞培养板的培养孔内培养。
当6孔细胞培养板的培养孔细胞到达对数生长的中、后期时，接种到25cm2培养方瓶中培养。
当25cm2培养方瓶中的细胞到达对数生长的中、后期时，接种到75cm2培养方瓶中。
类似地，种子细胞培养所用的培养形式还有滚瓶、细胞工厂、种子细胞罐等。
依据生产用细胞罐培养体系的体积数和生长罐内细胞接种的起始密度，即可计数出所需种子细胞的总数。
3．制备水平的细胞大量培养制备水平的细胞大量培养普通用法生产型细胞罐，也称生物反应器。
用于哺乳动物细胞大量培养的国际品牌生物反应器，其主要创造商有Sartorius（原B.Braun贝朗）、BioengineeringAG（比欧）、NewBrunswickScientificCo.,Inc(NBS）和ApplikonBiotechnology等公司。
Eppendorf公司旗下的NBS品牌创造的各种生物反应器。
除了满足动物培养以外，NBSBioFlo各型生物反应器均可配套提供微生物、植物细胞培养的罐体挑选。
对植物细胞培养，可配备相应的光照系统。
细胞工程第十章动物细胞大规模培养技术
02
动物细胞大规模培养技术的基本原理
动物细胞的基本特性
动物细胞具有特定的形态和功能，如上皮细胞、肌 肉细胞、神经细胞等。
动物细胞具有高度的代谢活性，能够合成蛋白质、 酶等生物大分子。
动物细胞具有膜结构，能够进行物质交换和信号转 导。
动物细胞生长与增殖的机制
02
01
03
动物细胞通过分裂进行增殖，分裂过程中需要进行 DNA复制和细胞分裂。
定义与特点
定义
动物细胞大规模培养技术是指通过一定的生物反应器系统，在一 定的培养条件下，大规模培养动物细胞以获取所需的细胞、组织 或生物制品的技术。
特点
动物细胞大规模培养技术具有高效、可重复性高、可工业化生产 等优点，广泛应用于生物医药、生物制品、生物材料等领域。
动物细胞大规模培养技术的应用领域
监控与检测
建立完善的监控和检测体系，定期对培养物进行 微生物、支原体和内毒素检测，确保产品质量。
3
安全性评估
对大规模培养的动物细胞进行安全性评估，包括 细胞形态、染色体数目、病毒污染等方面，确保 产品安全可靠。
提高培养效率与产物质量的策略与方法
选择适宜的细胞株
选择增殖能力强、产物表达量高的细胞株，提高培养效率和产物 质量。
动物细胞的生长与增殖受到多种因素的影响，如营养 物质、激素、生长因子等。
动物细胞的生长与增殖过程受到细胞周期的调控，细 胞周期包括分裂间期和分裂期。
动物细胞培养的环境因素
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02
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04
温度
维持适宜的温度是动物细胞培 养的基本条件，不同种类的动 物细胞对温度的需求不同。
气体环境
动物细胞培养需要适宜的气体 环境，如95%空气（细胞代谢 必需的）和5%的${CO}_{2} ($ 维持培养基的酸碱度)。
ch02 动物细胞大培养技术
（五）多孔载体及制备 p107
三、动物细胞大规模培养的关键问题 优化细胞培养环境 改变细胞特性 提高产品的产率并保证其质量和一致性
（一）细胞培养环境 细胞培养环境中抑制因素的积聚是提 高细胞密度的主要限制因素。 高细胞密度的主要限制因素。 1.氨离子 氨离子 体外动物细胞培养中氨离子的积累是 抑制细胞生长的主要因素之一。 抑制细胞生长的主要因素之一。 氨来源于两方面： 氨来源于两方面：一是直接来源于培 养基，一是细胞代谢所产生， 养基，一是细胞代谢所产生，但两者都涉 防止培养基中Gln自然分 及Gln 。因此需要防止培养基中 因此需要防止培养基中 自然分 限制Gln用量，并尽量去除培养基中的 用量， 解，限制 用量 氨。
Section 3
动物细胞大规模培养
通过大规模体外培养技术 培养哺乳类动物细胞，是生产 生物制品的有效方法。
一、动物细胞大规模培养概述 1.定义 定义 动物细胞大规模培养技术（ 动物细胞大规模培养技术（largescale culture technology）是指在人 ） 工条件下（设定ph、温度、溶氧等）， 工条件下（设定 、温度、溶氧等）， 在细胞生物反应器（ 在细胞生物反应器（bioreactor）中高 ） 密度大量培养动物细胞用于生产生物制 品的技术。 品的技术。
影响细胞在微载体表面生长的因素 在细胞方面： 在细胞方面： 细胞群体、 细胞群体、状态和类型 在微载体方面： 在微载体方面： 微载体表面状态、吸附的大分子和离 微载体表面状态、 子；微载体表面光滑时细胞扩展快，表面 微载体表面光滑时细胞扩展快， 多孔则扩展慢。 多孔则扩展慢。 培养环境： 培养环境： 如培养基组成、温度、 、 如培养基组成、温度、pH、DO以及代 以及代 谢废物等均明显影响细胞在微载体上的生 长。
动物细胞大规模培养技术
人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系为例 建系过程：
(1)取材 (2)原代培养 (3)建系过程
• 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速 迁移和生长。2周后，可见成纤维细胞生长。8周后， 上皮细胞生长开始明显加快. • 细胞在传代三次后 贴壁生长的细胞呈现上皮状。 2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长,命 名为CNE-2。经生物学特性分析后确定细胞系建立成 功.
九 动物细胞生物反应器培养
• 9．1 生物反应器的特点分析 • 由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切 敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统 的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量 培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和 过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物 反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反 应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固 定床为主。
(6)分离细胞：
• 对于回收率要求不高的细胞种类，分组 沉降简单易行。
• 脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液 中分离收集细胞， 400r／min，2min 离心加速 微载体沉淀。
(7)传代培养：
• 如果进行放大培养，可在细胞脱离微载 体后，加入一些新的微载体以增大培养 体积，提高培养液的利用率，不过此法 比全部用新微载体的细胞得率要少。 • 尽量减少培养液中Ca2+浓度可促进微载 体之间的细胞转移。
2微载体培养技术
• • • • • • •
理想的细胞支持物应该具备特征： (1)生物相容性 ． (2)简便的无毒害固定化过程。 (3)良好的传质特性。 (4)良好的机械稳定性。 (5)最大的比表面积。 (6)适合细胞生长的形状和大小。 (7)粒径分布均一。
• (8)能高压灭菌。 (9)可重复利用，易于清洗。 (10)能保护细胞免受机械损伤。
用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法
用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法胡显文;肖成祖;高丽华;李佐虎【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2001(000)001【摘要】Long-term and large-scale and high-density animal cell culture is critical in biopharmaceutical industry. A recombinant Chinese hamster ovary cell line which secrets prourokinase Pro-UK was cultivated continuously on porous microcarriers in pilot-scale bioreactors. The methods of long-term and large-scale animal cell culture were introduced in this paper.%长期大规模高密度动物细胞培养是生物制药产业中的关键技术,文中介绍了利用多孔微载体在中试规模生物反应器中长期大规模连续培养分泌尿激酶原的DNA重组中国仓鼠卵巢细胞(rCHO)的方法。
【总页数】4页(P45-48)【作者】胡显文;肖成祖;高丽华;李佐虎【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所北京 100071;军事医学科学院生物工程研究所北京 100071;军事医学科学院生物工程研究所北京 100071;中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室北京 100080【正文语种】中文【中图分类】Q954.6【相关文献】1.纤维素多孔微载体的制备及其用于动物细胞培养 [J], 胡显文;肖成祖2.用多孔微载体大规模培养rCHO细胞 [J], 胡显文;肖成祖3.生物工业中的动物细胞微载体进行培养技术 [J], 刘书志4.动物细胞培养用多孔载体的研制 [J], 胡显文;肖成祖5.微载体系统动物细胞大规模培养技术 [J], 王佃亮;肖成祖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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=4H P 温 度 K>954@ T451@ P 搅 拌 转 速 为 94.7/ I V4.7/， 多 孔 微 载 体 的 浓 度 为 ?* EI=* E 培 养 基 。
采用批式换液连续培养方式，每天通过细胞截留系 统换液 1I15? 个工作体积，将微载体截留在反应器 中，收获含产品的上清并加入新鲜培养基 RFP GS。为保 持长期培养细胞的活力，并维持高密度培养条件下 细胞的表达水平，当多孔微载体中长满细胞后，在 细胞表达水平急剧下降前，用新多孔微载体部分更 换长满细胞的多孔微载体。
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大规模动物细胞培养技术是生产基因工程药 物、单克隆抗体和疫苗等生物制品的关键技术，例 如利用重组 123 细胞表达的促红细胞生成素 （ 45
= 材料与方法
#$ #
细胞株和培养基 培养分泌尿激酶原 （ ?.#@AB ） 的 重 组 123 细
63） 7889 年的全球销售额已达 :; 亿美元，成为仅
次于奥美拉唑的销售额第二大医药产品 ，在国外
平 ， 但 LA.#BCD 一 般 维 持 在 <73;9K3,C 响。
参 考 文 献
124
许铁男 : 世界医药产业展望 : 中国医药情报， 288KF J MJ ） ：
在高密度细胞培养过程中，由于营养、生长空间、 传质限制等外部因素，易于导致细胞凋亡而缩短培 养时间，大大降低反应器的生产能力 1234。并且，在 长期培养过程中，生长在多孔微载体中心的细胞会 由于传质的限制而逐渐死亡，在我们以前的实验 中，连续培养 233 天后，通过台盼蓝染色，微载体 中的活细胞比例约 536 174。而通过定期部分更新微 载体，促使细胞在新旧微载体间自动转移，83 天培 养 后 可 以 保 持 微 载 体 中 的 活 细 胞 比 例 大 于 836 1224， 说明定期部分更新微载体，可以很好地解决大规模 长期培养中的细胞凋亡问题，从图 9 可看出： （2）通过更新部分微载体，为细胞的分裂生长 提供了新的生长空间，促使细胞不断增殖，在长期 细 胞 培 养 过 程 中 保 持 细 胞 活 力 （活 细 胞 比 例 大 于 。在整个培养过程中，细胞密度基本维持在 836 ） 2:9;<:=>235 /?。 （<）这种连续培养工艺，大大提高了反应器的 生产能力 （@.%0&$#.） 。按照 A.#BCD 的比活 E233F333,C /* 计算，在培养的前 =9 天，溶氧 （GH）维持在 <36 以 上 时 ， @.%0&$#. 一 般 为 2:5;<:=* A.#BCD I， 而 GH 降 至 56;86 时 ， @.%0&$#. 降 至 3:5=;2:5* A.#BCD I，在 82 天的培养过程中，上清中 A.#BCD 的最高 浓 度 达 233/* ? 以 上 ， 共 收 获 含 A.#BCD 约 22J* 的上清 2K<5 升，经纯化获得合格的冻干产品 K3 余 克，按 23;<3 万元 克计算，三个月产值在千万元 以上。目前这些产品正用于治疗心肌梗塞的临床试 验 中 。 利 用 工 作 体 积 E<3? 的 反 应 器 培 养 基 因 重 组 动物细胞，可达年 产 <33* 基 因 工 程 产 品 的 工 艺 在 国际上尚无报道。 （9）经过一段时间培养后，细胞表达水平逐渐 下 降 ， 如 从 第 23 天 至 第 9= 天 ， LA.#BCD 可 从 最 高 时
C8H ， 表 明 微 载 体 定 期 更 新
可以很好地解决高密度条件 下细胞表达水平下降的问题， 并且能简便有效地维持细胞
J FG J
万方数据
生物技术通报
!"#$%&’(#)#*+
,(-#./0$"#(
!""# 年第 # 期 86 时 ， 虽 然 部 分 更 换 微 载 体 可 以 提 高 细 胞 表 达 水
E 军事医学科学院生物工程研究所 F ， 细 胞 在 方 瓶 培 养 中 的 表 达 水 平 （ G?.# @AB ） 约 ・ H;;,A E7;I &%))J KF 。采用无血清培养基，基本组 成为 LM4M N7> E7O7F E2+&)#(% 1#P AQRF S 添
加适量蛋白胨，胰岛素及某些氨基酸和无机盐等小 分子物质，过滤除菌<:=。
328 321E @8>> 8 >2E18
E2> 121 33P>> 8 >28C
F2> 12@F 33F>> @ >2@PF
但是当微载体的浓度从 E* 9+$#6#.% < 提高到
F* <，细胞密度提高的幅度并不大，而且当细胞密 度达到 12@?3>G /< 后，45 则只能维持在 38H ，表
明进一步提高细胞培养密度的主要限制因素是供氧 和提供足够的营养成分，因此，在 !"#A$0$ 反应器中 培养动物细胞，比较适宜的多孔微载体浓度为 E2>=
15 >
反应器和培养方法
图!
F 升 D%))"J%( 笼 式 曝 气 反 应 器 （ 工 作 体 积 KF 升 ， L!; 公 司 ， M;3） 和 >4 升 !"#N$0$ MD 无 泡 通 气反应器 （工作体积 K?4 升， !5 !.0O( 公 司 P J%.Q 。 >4 升反应器中装备自行设计的可反冲细胞 /0(+）
摘 要 ! 长期 大 规 模 高 密 度 动 物 细 胞 培 养 是 生 物 制 药 产 业 中 的 关 键 技 术 ， 文 中 介 绍 了 利 用 多 孔 微 载 体 在 中 试 规 模
生物反应器中长期大规模连续培养分泌尿激酶原的 LVR 重组中国仓鼠卵巢细胞 （.123 ）的方法。 关键词：动物细胞培养；多孔微载体
D+$#7#.% 多孔微载体机械强度高，可回收重复 使用。回收方法如下： （1）将约 >44/E 内部长有细 胞的多孔微载体置于 ?444/E 瓶中，加 1444/E 水， 用 力 振 荡 ? 分 钟 后 ， 用 1F4 目 不 锈 钢 滤 网 滤 除 液 体，以初步去除脱落的细胞及细胞碎片。 （?）将微 载体重新悬浮于 45?6 的柠檬酸溶液中，置 于 室 温 G 小时，并每隔 1 小时振荡 ? 分钟，使多孔微载体 内部中的大多数细胞裂解并脱落出来，用 1F4 目滤 网滤除液体。 （>）重复第一步，用水多次清洗多孔
动转移，每级放大培养时，先在更大规模的反应器 中预先加入适量培养基和经过处理的多孔微载体， 长满细胞的多孔微载体通过管道直接进入下一级反 应器中，而无需胰酶的消化来帮助细胞培养的接种 和 放 大 RGS。 控 制 78 K954 T454FP 溶 氧 （ AU ） K9H I
144H 纤维素 ?44I?Y4!/ 151/? * [.+ 154>* /E 约 >4!/ =4/) * [.+ 约 15Y/%\ *
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万方数据
生物技术通报
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!""# 年第 # 期
细胞由方瓶 （单 层 贴 壁 培 养 ） ! 转 瓶 （单 层 贴 壁 培 养 ） ! 搅 拌 瓶 （多 孔 微 载 体 培 养 ） ! FE
物 化 特 性 见 表 1， 购 自 2’0./0&"0 !"#$%&’ 3! （ 瑞 典） 。用前用 4516 、 78954 的磷酸缓冲液 :2!;< 浸 泡 =’ 后，倾去 2!; ，再用 2!; 洗涤 > 次。 1?1@ 高 压 灭 菌 >4/"( 后 ， 吸 出 2!; ， 用 A6B6 C1? 培 养 基浸泡备用。
截留系统，在细胞换液连续培养时可将生长在微载 体中的细胞截留在反应器中，提高细胞培养密度和 反应器的生产能力 R=S。采用无泡通气薄壁硅胶管气 体交换系统，避免细胞培养中直接通气时气泡的凝 聚破裂对细胞产生的机械损伤。
’"*+ 动物细胞逐级放大培养工艺流程
#$ % 检测方法 15 =5 1 细胞计数 结晶紫柠檬酸溶液染色法 R9S。 15 =5 ? 7.#WMX 活性测定 用改进的琼脂糖 W 纤维 蛋白W平板法RYS。 15 =5 > 葡萄糖和乳酸的测定 葡萄糖浓度用血糖 诊断试剂盒测定 : 中国科学院百泰技术公司 < 。乳酸 浓度由乳酸酶试剂盒测定（D%($.#("& J/Z8） 。