重组腺病毒生产技术研究进展
2004 年 10月The Chinese Journal of Process Engineering Oct. 2004
重组腺病毒生产技术研究进展
祁丽，顾铭，丛威
(中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室，北京 100080)
摘要：目前基因治疗，尤其是对癌症的基因治疗越来越多地得到人们的关注. 随着基因工程技术
的发展，对癌症在基因水平上的认识不断深化，发现了很多对治疗癌症有帮助的基因，但临床面
临的最大问题就是如何建立一个安全、高效、实用、可重复的基因转移系统，将这些治疗基因有
效地导入靶细胞. 人们构建了各种载体，重组腺病毒就是基因治疗的重要载体之一. 能否生产出大
量高质量的腺病毒载体是制约体外实验和临床实验的关键因素. 本文从感染机制、生产和纯化计数
等几个方面讨论生产重组腺病毒载体的进展.
关键词：基因治疗；重组腺病毒载体
中图分类号：Q952 文献标识码：A 文章编号：1009?606X(2004)05?0475?06
1 前言
基因治疗是近年来兴起的一种针对单基因和多基因遗传病、心血管疾病、恶性肿瘤和一些传染病的新的治疗模式，目的是将外源治疗基因导入靶细胞，在体内产生疗效. 基因导入系统是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统. 到目前为止，病毒载体在基因治疗中仍然是最有效的基因导入系统[1]. 腺病毒就是已经用于基因治疗的载体之一，与其它病毒载体相比，腺病毒载体一个主要优势是在包装细胞中能获得较高的病毒滴度，能感染分裂期和非分裂期的细胞，目前应用最多的是Ad5[2]. 用外源DNA置换出一定长度的病毒基因片断及获得重组的腺病毒，根据腺病毒载体中的病毒基因置换程度，可将其分为第一代、第二代和第三代. 第一代腺病毒载体去除了基因序列中的E1和E3区，包装外源基因的能力较小，在8.5 kb以内，主要用于单基因疾病的治疗[3]，缺点是导入基因的表达时间短和引起宿主的免疫反应，导致直接的细胞致病变作用(Cytopathic Effects，CPE)，另外，在293细胞内同源重组作用导致野生腺病毒(Replicative Competent Adenovirus，RCA)的产生[4]. 为了避免上述缺点，第二代腺病毒载体进一步去除了E2a, E2b或E4，载体的容量和安全性比第一代有所改进，但是其介导的外源基因的转染和表达时间并没有明显延长，而且产生重组病毒滴度低，另外保留的病毒基因仍有低水平的表达并引起细胞免疫反应[5,6].第三代腺病毒缺失全部或大部分腺病毒基因，或者包装腺病毒微染色体系统，这种载体缺失了病毒蛋白，所以很大程度上降低了细胞的免疫源性，并且外源基因的表达时间明显延长，但对包装细胞的要求很高，分离辅助病毒困难. 至今在临床中应用的腺病毒载体主要是第一代腺病毒载体.
重组腺病毒的生产过程主要包括包装细胞的培养、病毒感染、病毒的分离纯化和病毒计数及滴度测定等几个主要步骤. 以下从腺病毒的感染机制、生产和纯化计数几个方面论述重组腺病毒载体的生产技术.
收稿日期：2003?09?28，修回日期：2003?11?05
基金项目：国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(编号: 2001AA217121)
作者简介：祁丽(1979?)，女，河南省原阳县人，硕士研究生，生物工程专业；丛威，通讯联系人，E-mail: weicong@https://www.360docs.net/doc/8c14271318.html,.
2 腺病毒感染机制
野生腺病毒的基因组双链DNA长度为36 kb[1]. 腺病毒感染细胞主要有以下几个步骤：(1) 病毒的扩散与在细胞表面吸附. 这一步中细胞密度、直径、培养基粘度和组成是比较关键的参数；(2) 病毒颗粒与细胞膜特异受体结合后经内吞作用进入细胞，随即脱衣壳，病毒DNA进入细胞核中，这一步非常快，大约在10 min之内[7]；(3) 基因转录与病毒DNA复制，这一步又可以分为几部分，0～2 h，E1区的转录，E1区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有调控作用，2～6 h，早期转录区基因E1b, E2a, E2b, E3, E4的转录，这些基因的功能是控制宿主细胞的代谢和病毒DNA复制，有报道[8]证实感染6～8 h后宿主细胞的DNA复制完全停止，用含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体感染细胞后6 h即可在线检测到报道基因的表达，20 h后达到最大表达量[9,10]，说明病毒基因的复制与翻译在20 h时就已经完成.
3 宿主细胞感染腺病毒后的代谢变化
细胞感染腺病毒后，细胞干重、蛋白和DNA含量、细胞大小都有不同程度的增加，如293细胞在不含血清的培养基中，细胞感染病毒后直径从15 μm增至17 μm[10]. 在感染24～48 h后，细胞对葡萄糖的消耗以及氨和乳酸的生成量均增加了30%～100%[11,12], O2的消耗和ATP的生成也有类似的趋势，这可能是因为除了细胞正常生长外，感染的过程需要更多的能量[13].
4 重组腺病毒的生产方法
生产重组腺病毒通常所使用的细胞系有贴壁依赖性细胞和悬浮培养细胞，目前使用最广的是293细胞(人胚胎肾细胞)，使用这一细胞的优点是可以获得很高的病毒滴度，缺点是由于同源重组能产生野生型腺病毒. 一些实验室建立了293悬浮培养细胞系，还有在293细胞的基础上建立了911细胞[14]. 另一个较常用的是PER.C6?(人胚胎视网膜)细胞 [15],这个细胞株最大程度地减少了野生型腺病毒的产生几率，但是该细胞已经申请了专利，使用该细胞株必须获得授权.另外已经构建的A549细胞(肺癌细胞系)可以包装E1区缺陷的腺病毒，同时降低了野生腺病毒的产生几率[16]. 以下从使用的细胞系分别说明重组腺病毒的生产方法.
4.1 贴壁依赖型细胞
通常贴壁依赖型细胞培养方法是用方瓶和转瓶，也可以在搅拌条件下使用微载体进行培养. 贴壁依赖型细胞一般用于细胞外分泌蛋白的工艺，当用于腺病毒载体的培养时，只能收集细胞后再进行破碎使腺病毒释放到介质中，但是这种方法由于贴附表面的限制放大比较困难，而且培养基中的血清增加了对下游分离纯化工艺的要求.
通常在贴壁培养条件下293细胞的接种密度大约在(1～1.5)×104个/cm2，当细胞增殖到105个/cm2时接种病毒，贴壁培养的细胞比悬浮培养的细胞病毒产率要高一些，前者为7000～12000 pfu/细胞，后者为5000 pfu/细胞. 但是由于贴壁面积的限制，总的病毒产量要低于悬浮培养[17].
微载体对贴壁依赖型的细胞提供了更大的贴附表面积，Nadeau[17]评价了293细胞在不同的微载体系统的生长状况，认为Cytodex?3相对于其它的微载体是最优的. 但是293细胞本身的贴壁能力很弱，细胞很难在微载体间进行迁移.
4.2 悬浮培养细胞
相对于贴壁培养，悬浮培养更适于培养规模的放大，目前，对贴壁依赖型细胞进行改良，已
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经建立了几种适于悬浮培养的细胞，如293，PER.C6?. 同时，无血清培养基的开发使得下游的分离纯化更容易.
在批式悬浮培养中，293细胞和PER.C6?的最终细胞密度都可以达到3×106个/mL[12]，有些报道称293细胞的最终密度可达(7～9)×106个/mL[18]. 批式培养操作比较简单，不用流加物质，所以染菌的机会较少. 在病毒感染后营养消耗很大，所以为了获得较高的病毒滴度，接种病毒后需要更换新鲜培养基.
灌注可以提高细胞密度，也可以用于腺病毒的生产，灌注培养条件下，PER.C6?的最终细胞密度可以达到(7～8)×106个/mL，也有人[19]建议用灌注的方法使细胞保持在很高的密度和营养状态，再进行病毒接种.
表1列出了一些利用293细胞生产腺病毒的生产工艺数据和参数. 其中给出了用293细胞生产腺病毒载体常用的方法，除了用微载体培养外都是悬浮培养. 在进行病毒感染时除流加和灌注培养方式外，大部分方法都要更换培养基，保证包装病毒过程的营养需要. 在测定病毒产量时采用了不同的方法，所以，最终产量的表示方式不一样.
表1 293细胞生产重组腺病毒载体的参数及数据
Table 1 Data for production of adenovirus by cell 293
Method V olume
(L)
Media
Inoculation
(×104 cell/mL)
Infection
(×105 cells/mL)
MOI1)
Harvest
(d)
Virus yield
(×103 cell?1)
Batch 3
IS293-SF
43
21
10
6
25
vp Batch sparged[17] 3 IS293-SF 3 7.2 10
6
54
vp
Batch cyto-3[20]2～4 DMEM+10%FBS2)15 19～22 5～10 2～3 3.6～7.3 pfu
Batch uspension[17] 2 293-SFMII 20 10 10
2 5.6
ip
Fed-batch suspension[13] 3.5 NSFM13 30 10 10 2 1.6
ip Perfusion suspension[12]0.5 DMEM+5%FBS 30 60 5 2.5 1.3
ip/mL
Perfusion suspension[13]10 293-SFMII 50 50 10 2 1.5
ip/mL
Note: 1) Multiplicity of infection; 2) Fetus bovine serum.
5 重组腺病毒的纯化和计数方法
重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题，病毒最经典的纯化方法是CsCl密度梯度离
心，但是，这一工艺耗时并且放大困难. 为了满足基因治疗的需要，建立适用于大规模生产的纯化
技术非常必要. Shabram等[21]使用了两步法，首先将粗提液通过DEAE阴离子交换柱，再通过羟基
磷灰石柱进行吸附，这种方法是用于分离Ad2的，直接用于Ad5的分离需要改变分离的条件.
Huyghe等[22]实验了阴离子交换树脂、体积排阻色谱、疏水色谱和固定化锌吸附色谱(Immobilized
Zinc Affinity Chromatography, IZAC)四种方法，总结出的优化方案为先通过DEAE阴离子交换柱，
再通过固定化锌吸附色谱(IZAC)柱.
在生产过程中病毒颗粒数和病毒滴度是两个非常关键的参数，这二者又与构建的病毒种类和
宿主细胞种类有密切的关系. 准确的计数病毒可以检测纯化工艺的可靠性，通常所用的方法是生物
检测，但是生物检测耗时长，操作复杂，而且对实验条件要求高，人为造成的误差大. 最早Maizel
等人使用了OD260的方法，用SDS处理病毒后在260 nm测定其吸光度，再乘以消光系数就可以
得到病毒颗粒数. 但是这一方法的精确度不能满足临床治疗的需要[21]. 为了满足临床的需要，人们
尝试了各种方法. 表2列举了一些腺病毒的计数方法.
其中病毒颗粒数包括具有感染效力的病毒和不具感染效力的病毒，在临床应用中一般采用总
颗粒数来计算病人的接受剂量. 病毒滴度的测定是观察细胞感染病毒后的感染斑，是对具有感染效
478 过 程 工 程 学 报 第4卷 力的病毒的测定，为了保证临床应用的正确性，应该知道二者的比例，所以两种测定方法都非常关键. 感染滴度的测定与使用的生物材料和操作条件有密切的关系[28]. 由于病毒受到培养基体积的影响并不能充分感染细胞[27]，空斑法测定的结果偏低. 野生腺病毒的出现在临床应用中是非常危险的，从安全的角度出发，对它的检测非常关键.
表2 常见的腺病毒载体计数方法
Table 2 Common methods used for adenovirus quantitation
Total particle (vp)
Titre (IU) RCAs Plaque assay Plaque assay and PCR TCID50 [28] Green fluorescent protein [29] OD 260
Continuous bed matrix-HPLC [23]
RP-HPLC [24]
AE-HPLC
PicoGreen fluorescent dye [25]
Capillary zone electrophoresis [26]
Electron microscope
6 质量控制
生产过程中野生腺病毒数的测定非常关键，通常是用敏感细胞的细胞致死效应来测定，比如：hela 细胞和A ?549细胞，但是这种测定方法周期长，通常需要28 d. 现在更灵敏的方法是PCR.野生腺病毒的出现也促使人们去寻找更可靠的包装细胞株，如PER.C6?，但应用更多的还是293细胞. 对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化工艺，包括包装细胞、病毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品. Roitsch 等[30]从稳定性、有效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段. 稳定性包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性，前者的检测用酶切、电泳和Southern blot 等方法，后者的检测用ELISA 法. 有效性包括总病毒颗粒数与病毒滴度之间的比例和具有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例，在临床治疗中病人接受的剂量用病毒总颗粒数表示，所以，上述两种比例就显得尤为重要，其中总颗粒计数用AE ?HPLC 法，病毒滴度测定用免疫荧光法，外源基因表达检测用ELISA 法. 纯度包括RCAs 的检测、杂蛋白污染检测，RCAs 的检测用生物法和PCR 法，杂蛋白污染的检测用反相HPLC 和MALDI ?TOF 质谱联用法.
7 发展趋势与存在问题
在过去几年中，新的腺病毒载体不断研制成功，对腺病毒载体的大规模生产工艺提出了迫切的要求. 尽管面临着很多困难，人们尝试了各种方法，通过腺病毒载体生产方式的改进，使重组腺病毒的大规模生产成为可能. 首先，随着各种适合悬浮培养的培养基的出现，从传统的贴壁细胞生产方式转向利用悬浮细胞培养方式；其次，另一个重要转变就是生产过程中无血清培养基的应用，传统的血清培养方式给下游的分离纯化工艺造成很大的困难，无血清培养基的应用大大简化了下游的纯化工艺；第三就是培养方式的改变，从批式培养到流加和灌注方法的应用，克服了细胞达到一定浓度后的营养缺乏，减少了副产物的产生. 总之，包装细胞的培养工艺逐渐转向无血清悬浮灌注培养方式，以增加细胞密度，提高病毒产量.
由于目前大量的研究主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化计数方法，对病毒在宿主细胞中的DNA 复制和成熟的机制知之甚少，最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解.
第5期祁丽等：重组腺病毒生产技术研究进展479
在整个重组腺病毒的生产纯化工艺中，纯化计数以及质量控制是比较薄弱的环节. 目前，虽然探索了不少的纯化计数方法，但是其中所用到的设备和材料价格昂贵，所以还有待进一步开发适合大规模纯化要求的设备和材料，或成本低廉的纯化工艺. 质量控制是生产中非常重要的一环，它应该包括两方面的内容，首先，它不仅是对最终产品质量的把关，还应该贯穿在整个生产过程中；其次，国内目前对于应用在临床的重组腺病毒载体还没有颁布相应的质量标准，甚至发达国家相关的质量标准也还很不完善，所以在质量标准的制定方面应加大研究力度，从而提高产品的治疗效果，减少副作用的发生.
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Progress in the Production of Adenovirus Vector
QI Li, GU Ming, CONG Wei
(State Key Lab. Biochem. Eng., Institute of Process Engineering, CAS, Beijing 100080, China) Abstract: Though there are still many challenges to overcome, gene therapy has led to high expectation for curing a broad range of diseases, especially on the treatment of cancer. One of the key problems in clinical application is to construct safe and efficient gene transfer systems. Replication-defective adenoviruses are main vectors of choice, and many kinds of adenovirus vectors have been designed. With the development of research, more adenoviral particles are required. To meet the need of experimental and clinical applications, 293 cell lines which include adherent cell line and suspension cell line are frequently used in production. Methods used in production include batch, fed-batch and perfusion. Quality control of recombinant adenovirus vectors is also very important in the process of production. This review summarizes the production process of adenovirus vectors, mainly concentrated on the adenovirus infection mechanism and methods of production, purification and quantification.
Key words: gene therapy; recombinant adenovirus vector
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
刺激响应性药物传递载体的研究进展
刺激响应性药物传递载体的研究进展 智能、可控、高效的刺激响应性药物传递载体是当今药物传递系统的研究及临床实验的热点。本文以”基于体内微环境”与”利用环境外加刺激激发”为主线，综述了几类重要的刺激响应性的药物传递载体材料。介绍了体内微环境信号如pH、温度、氧化还原电势、葡萄糖及酶响应性载体，环境外加刺激如电信号、光信号及超声信号响应性等体系及多响应性载体在药物传递系统中的应用。总结了药物传递系统的发展方向及亟待解决的问题，从科学研究及临床治疗角度介绍了药物传递系统的发展方向。 标签：药物传递；刺激响应；体内环境；外加刺激 药物传递系统（Drug Delivery System DDS）是现今科学领域的重点攻关项目，在各类生物医用材料研究中，大多数与药物（或者基因）传递相关。目前，药物传递系统研究的主要任务是：①控制药物在体内的持续作用时间及作用等级。②将药物靶向引导到人体中特定的区域或细胞。③克服某种不可避免的组织（如肺、皮肤和小肠等）对药物的阻碍作用。 为了实现这些目标，医学科学家设计了一系列的药物释放载体并取得了一定的效果。若想取得更加理想的效果，智能型药物传递载体显示出了更大的潜力。本文主要分别从”基于体内微环境的响应性载体”和”基于外加刺激信号的响应性载体”来综述目前刺激响应载体的研究进展。 1基于体内微环境的响应性载体 1.1 pH响应性载体人体的消化道有着明显的pH值变化，胃部的pH在2～3而在小肠出pH值升至8左右。基于此变化，简单的以聚丙烯酸PAA类水凝胶为载体包载胰岛素，由于在胃部pH较低，PAA的羧基不发生电离，整个水凝胶紧紧包裹着胰岛素，保护其不被胃液消化。一旦水凝胶来到小肠，pH升高致使PAA的羧基开始电离，整个体系溶胀，便可以通过简单的设计将胰岛素特异性的释放在小肠环境中。目前，大多数针对肿瘤治疗的pH响应性载体是基于肿瘤外部酸性微环境及内部溶酶体酸性微环境的，其中以”质子海绵效应”类载体为代表（可以在酸性下吸收氢离子，使得细胞浆大量渗透进入溶酶体中，最终使溶酶体破裂将药物释放入细胞浆中的一种机理。）发展出了一系列高效的药物及基因载体。 1.2温度响应性载体对于局部温度较高的区域如炎症与肿瘤组织附近，研究人员设计了一种存在低临界共溶温度（LCST）的聚N-异丙基丙酰胺（PNIPAm）类材料。通过调控其分子链的链段结构，使其在人体较高温度下产生亲水-疏水转变。利用材料的亲水-疏水转变，可以成功的控制载体聚集起效的位置，从而定点的释放出药物。利用温度响应性材料与光热试剂的有机整合体为治疗基体，利用外加辐射作为辅助治疗方法，将可以定点定量的对病灶进行清除。
果蔬花卉生产技术专业教学计划
果蔬花卉生产技术专业教学计划 一、培养目标 培养适应社会主义新农村建设需要，具有综合素质和种植岗位职业能力，能胜任种植业生产、经营管理、技术推广和信息服务等工作的应用型、复合型团场实用人才。具体要求是： 1．具有科学的世界观、正确的人生观和爱国主义、集体主义、社会主义思想，具有良好的道德和行为规范。 2．掌握农作物生产技术、蔬菜生产技术、果树生产技术、花卉生产技术专业所必需的基本理论、专业知识和职业技能。 3．能够承担本地区农作物生产、蔬菜生产、果树生产、花卉生产、经营管理、技术推广和信息服务工作，具备解决本地种植业生产实际问题和种植技术推广的能力。 二、招生对象 招收具有初中（或相当于初中）毕业文化水平，有志于在团场从事种植业生产、经营管理、技术推广和信息服务的基层农技推广体系职工，基层组织带头人、种植大户、农业科技示范户、复转军人以及应届初、高中毕业生。 三、学习形式与学制 1．学习形式：全日制 2．学制：3年。 四、课程设置 全部课程分为四个模块，即公共基础模块、专业通修模块、专业及专项技能模块（毕业实践与职业技能培训）和专业拓展模块。其中公共基础模块作为文化知识基础，为培养科学素养、学习专业知识、掌握职业技能和终身学习奠定基础；专业通修模块作为专业知识基础，主要是使学员掌握种植业生产所必需的基础理论、基本知识和基本技能；专业及专项技能模块（毕业实践与职业技能培训）作为必备的专项技术和技能要求，使学员熟练掌握4-5种综合生产技术，培养学员岗位职业能力；专业拓展模块是在学习专业课程的基础上的拓展、补充和完善，
培养学员一专多能。 1．公共基础模块：主要课程为新型团场建设与职工素质教育、应用文写作、法律基础与农村政策法规，计算机应用基础、农业基础化学。 2．专业通修模块：主要课程为植物生产与环境、植物病虫草鼠害诊断与防治基础、农业生产经营管理。 3．专业及专项技能模块（毕业实践与职业技能培训）：农作物生产技术方向的主要课程为作物生产技术、3门专项技术；果树生产技术方向的主要课程为果树生产技术、2门专项技术和水果蔬菜花卉贮藏保鲜技术；蔬菜生产技术方向的主要课程为蔬菜生产技术、2门专项技术和水果蔬菜花卉贮藏保鲜技术；花卉生产技术方向的主要课程为花卉生产技术、2门专项技术和实用装饰园艺；其中专项技术课程目录见附件10。 主干课程：观赏树木学花卉栽培、植物病虫害防治技术、植物遗传充种技术、园林植物栽培养护、盆景制作、苗木生产技术、果蔬栽培技术、食用菌栽培技术等。 五、课程安排及学时分配（见附表） 六、教学安排 1. 自学：学员利用多种媒体教材、网上辅导资源或教学包进行自主学习，并按课程学习指导（或教学辅导大纲）要求，全面自学文字教材。 2. 授课：有声像教材的课程，由教学班组织学员利用声像教材组织教学。无声像教材的课程由基层校组织面授。 3.辅导：学员在自学文字教材及媒体教材的基础上，由辅导教师对学员进行辅导，辅导课包括自学指导、答疑解难、作业讲评、学习讨论和技能培训等。 4.实践： （1）课程实验（实习）：按照课程教学要求，组织学员实验（实习），写出实验（实习）报告。 （2）专项技术培训：根据当地生产实际，选择相关的专项技术文字、声像教材进行教学。
慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳
中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】 慢病毒载体及其应用的研究进展 毛颖佳综述郑源强石艳春审校 【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。 【关键词】慢病毒载体；基因治疗 Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their Application MAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China） 【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper. 【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy 慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。 1.慢病毒载体的发展 1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。 1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。 慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能 基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）. 作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）. 通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@https://www.360docs.net/doc/8c14271318.html,
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
基因治疗用腺病毒载体研究进展
基因治疗用腺病毒载体研究进展 录入：wei 来源：Internet 时间：2008-9-20 【字体：大中小】〖双击滚屏〗 【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。 【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作 【正文】 基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物——蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因[1 ] , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒[2- 4 ]。 1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化 删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7～ 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤等[5 ] , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中[6 ] , 同时提供能量(A TP) 和还原力(NADH) , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环[7, 8 ] , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。 2、腺病毒的定量和计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准
重组腺病毒构建的标准操作规程
重组腺病毒构建的标准操作规程（编号：048） 1、目的及适用范围 该SOP用于规范真核细胞表达重组蛋白的操作。 2、主要仪器及试剂 电转仪、Adeasy-1系统（穿梭载体pshuttle-cmv,pAdtrack-CMV）、骨架病毒（pAdeasy-1）、重组菌（BJ5183感受态）、包装细胞（293A）、Taq酶。限制性内切酶、碱裂解法提取质粒溶液I、II、III、酚、氯仿 3、操作步骤 3.1目的基因的克隆：引物设计时要GOI中有没有Pme I/EcoRI和PacI酶切位点。 3.1.1通过限制酶切分析/PCR/基因测序确认GOI克隆到穿梭载体，翻译方向跟启动子方向相同。 3.1.2如果采用pShuttle 或pAdTrack，必须提供启动子和多聚腺苷酸信号。所有的穿梭载体必须包括一个Kozak 信号序列。 3.1.3因为在转化和转染前，用Pme I/EcoRI和PacI酶，所以要避免GOI中有这些酶的酶切位点。如果有PacI酶酶切位点，建议通过点突变除去。 3.1.4如果表达多个基因，避免头对头的方向，采用头尾相接的方式。 3.1.5建议在穿梭载体中，通过瞬时转染检测GOI的表达。 3.2制备电转 BJ5183 感受态细胞：BJ5183为链霉素抗性，固体和液体LB加终浓度为30μg/mL 的链霉素培养。划线培养、挑单菌落摇床培养，转接到200-300mL液体培养基中，37℃摇床培养至A550约0.8，转移到无菌离心管中冰浴10～30min，4℃3000rpm离心10min，用50mL灭菌的超纯水配制的10%甘油重悬,重复两次离心重悬，4℃3000rpm离心10min，用10mLWB重悬，4℃3000rpm离心10min最后用0.5mL重悬。分装20μL/管，-80℃冻存。 3.3用卡那抗性培养基培养2mL含有GOI穿梭质粒的细菌培养过夜。提取质粒DNA。推荐使用碱裂解法提取质粒，保证穿梭质粒的完整性可以提高在BJ5183细菌中重组的效率。 3.4 用Pme I或EcoRI线性化穿梭质粒：必须保证酶切完全。0.1μg-0.5μgDNA用300U的酶100μL 体系。电泳检测酶切是否完全。 3.5乙醇沉淀法回收纯化线性化的穿梭载体。 3.6 冰上操作：向20μLBJ5183感受态细胞中加入pAdeasy-1腺病毒骨架质粒和线性化的穿梭质粒，混匀，总体积不超过30μL。 3.7 将感受态和DNA混合物转移到用冰预冷的电转杯中，电击转化。电击完成后加入预热的LB 101
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
花卉生产技术
四川农业大学网络教育专科考试 花卉生产技术试卷 （课程代码392388） 学号姓名 一、名词解释（本大题共5小题，每小题4分，共计20分） 1、阴性花卉：该类花卉要求在适当阴蔽条件下方能生长良好,不能忍受强烈的直射光线,生长期间一般要求有50-80%的阴蔽度环境条件。 2、球根花卉：球根花卉是多年生花卉中的一大类，在不良环境条件下，于地上部茎叶枯死之前，植株地下部的茎或根发生变态，膨大形成球状或块状的贮藏器官，并以地下球根的形式渡过其休眠期，至环境条件适宜时，再度生长并开花。 3、滴灌：滴灌是将具有一定压力的水,过滤后经管网和出水管道(滴灌带)或滴头以水滴的形式缓慢而均匀地滴入植物根部附近土壤的一种灌水方法。 4、半软枝扦插：它是利用半木质化的绿色的枝条作插穗的扦插方法。 5、花期调控：花期调控就是指利用某些栽培手段或措施，人为地改变花卉自然花期的技术，又称催延花期或花期调节。 二、填空题（本大题共10小题，每小题2分，共计20分） 1、牡丹、虞美人等属于（）植物，要求日照时数大于临界日长才能开花。 长日照 2、仙人掌、景天等属于（）花卉，它们的耐旱性较强。 旱生 3、荷花、香蒲等属于（）类水生花卉，根生于泥水中，茎叶挺出水面。 挺水 4、按生物学特性分类，菊花属于（）花卉。 花卉生产技术试卷第1页（共2页）
宿根 5、大部分球根花卉地下部分分生能力强，每年能长出新球，常用（）繁殖。 分球 6、观赏葱、薯蓣等花卉除采用分球繁殖外，还可用（）进行繁殖。 种子 7、遮光处理可促使短日照花卉在（）季节开花。 日照长 8、月季常用砧木为（）。 容易扦插繁殖 9、自古尊为“花王”，称为“富贵花”的花卉是（）。 牡丹 10、多浆多肉类植物在休眠期应节制浇水，保持（）即可。 盆土不过分干燥 三、判断题（本大题共10小题，每小题1分，共计10分。正确打√，错误打×） 1、栀子花、八仙花等花卉属于喜酸性土壤的花卉。（√） 2、荷花、美人蕉等花卉属于块根类，地下根膨大呈块状。（×） 3、对于陆续成熟且成熟后易散落的花卉种子，应成熟一批采收一批。（√） 4、扦插繁殖培育的植株比播种苗生长快、开花早，但不能保持原有品种的特性。（×） 5、芽接可在生长季节和休眠季节进行。（×） 6、疏剪有利于通风透光，且使树体造型更加完美。（√） 7、室内盆栽观叶类花卉常选用阳性花卉。（×） 8、松、竹和蜡梅被誉为“岁寒三友”。（√） 9、花烛、红鹤芋等花期持久的花卉适宜盛开时采收用作切花。（√） 10、凡是采用天然土壤以外的基质进行栽培植物的方法，统称为无土栽培。（√） 花卉生产技术试卷第2页（共2页）
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展
专题八作业：基因治疗中病毒载体的研究进展？ 基因治疗自1990年成功应用于重症联合免疫缺陷综合征(SCID-X1)患者的治疗，已走过了十几个年头，给人类一些疑难杂症如肿瘤的治愈带来了曙光。但其发展却屡遭挫折，比如近来发现经基因治疗的SCID-X1患者之一出现了类白血病反应，可能是基因随机整合染色体所致，使得人们不得不以怀疑的目光审视它的成长。而基因载体是阻碍其发展的主要因素，主要表现为安全性、靶向性、转染效率不高及表达时问短等问题。病毒载体是目前临床基因治疗中应用最多的载体，各种病毒载体有自身的利弊，除了对它们的选择外，病毒载体只有通过自身的不断改造完善，才能更好的服务于基因治疗，进而真正造福于人类。 1 逆转录病毒(retrovirus vectors，RVJ载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体；另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因。1990年世界上首例临床基因治疗采用的就是逆转录病毒载体n]。到目前为止，RV载体是基因治疗临床试验使用最多的载体，较常用的是基于moloney鼠白血病病毒(MMLV)改造而来的各种Rv载体。RV载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，但只能感染分裂期细胞，载体容量<8kb，与宿主细胞基因组的随机整合可引起基因突变及产生可复制的野生型病毒等危险，故需要进一步的改造完善。将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞，具有广泛的宿主范围和更高的转染效率，可高效的转染静止细胞，并能抵抗血清补体灭活的作用。诸多的优点使该载体在造血系统疾病和肿瘤的基因治疗方面有潜在的应用前景。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在原来的病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的多肽，目前应用较多的是单链可变区抗体(acFV)；还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系aF-crip和m 使载体与包装细胞问至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了RV载体的安全性。 2 腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒载体自1993年首次被应用于临床试验以来，迄今为止大约有40％基因治疗临床试验方案采用腺病毒为载体，仅次于RV载体_3 J。至今AV载体已经发展了4代，第2、3代腺病毒去除EI、E2和E4编码序列，与第一代相比，有更低的免疫原性和更大的载体容量。第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列
第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景
class2switch recombination[J].Nat Immunol,2003,4:10232 10281 6 Liddament M T,Brown WL,Schumacher AJ,et al.APOBEC3F properties and hypermutation preferences indicate activity against HIV21in vivo[J].Curr Biol,2004,14(15):1385213911 7 Wiegand HL,Doehle BP,Bogerd HP,et al.A second human an2 tiretroviral factor,APOBEC3F,is suppressed by the HIV21and HIV22Vif proteins[J].EMBO J,2004,23(12):2451224581 8 Zheng YH,Irwin D,Kurosu T,et al.Human APOBEC3F is an2 other host factor that blocks human immunodeficiency virus type1 replication[J].J Virol,2004,78(11):6073260761 9 Dussart S,Douaisi M,Courcoul M,et al.APOBEC3G Ubiquitina2 tion by Nedd421Favors its Packaging into HIV21Particles.J Mol Biol,2005,345:54725581 10 Douaisi M,Dussart S,Courcoul M,et al.The tyrosine kinases Fyn and Hck favor the recruitment of tyrosine2phosphorylated APOBEC3G into vif2defective HIV21particles.Biochemical and Biophysical Research Communications,2005,329:91729241 11 Navarro F,Bollman B,Chen H,et https://www.360docs.net/doc/8c14271318.html,plementary function of the two catalytic domains of APOBEC3G.Virology,2005,333: 37423861 12 Marin M,Rose KM,K ozak SL,et al.HIV21Vif protein binds the editing enzyme APOBEC3G and induces its degradation[J]. Nat Med,2003,11:1398214031 13 Sheehy AM,G addis NC,Malim MH.The antiretroviral enzyme APOBEC3G is degraded by the proteasome in response to HIV21 Vif[J].Nat Med,2003,9:1404214071 14 Kao S,Khan MA,Miyagi E,et al.The human immunodeficiency virus type1Vif protein reduces intracellular expression and inhibits packaging of APOBEC3G(CEM15),a cellular inhibitor of virus infectivity[J].J Virol,2003,77:113982114071 15 Mehle A,G oncalves J,Santa2marta M,et al.Phosphorylation of a novel SOCS2box regulates assembly of the HIV21Vif2Cul5com2 plex that promotes APOBEC3G degradation[J].G enes and devel2 opment,2004,18:2861228661 16 Yu YK,Xiao ZX,Elana S,et al.Selctive assembly of HIV21Vif2 Cul52ElonginB2ElonginC E3ubiquitin ligase complex through a novel SOCS box and upstream cysteines[J].G enes and develop2 ment,2004,18:2867228721 17 Yu X,Yu Y,Liu B,et al.Induction of APOBEC3G ubiquitina2 tion and degradation by an HIV21Vif2Cul52SCF complex[J].Sci2 ence,2003,302:1056210601 18 Kao S,Miyagi E,Khan MA,et al.Production of infectious hu2 man immunodeficiency virus type1does not require depletion of APOBEC3G from virusproducing cells[J].Retrovirology,2004, 1:272391 19 G oncalves J,Santa2marta M.HIV21Vif and APOBEC3G:Multi2 ple roads to one goal[J].Retrovirology,2004,1(1):281 20 Liu B,Yu X,Luo K,et al.Influence of primate lentiviral Vif and proteasome inhibitors on human immunodeficiency virus type1 virion packaging of APOBEC3G[J].J Virol,2004,78:20722 20811 21 Xu H,Svarovskaia ES,Barr R,et al.A single amino acid substi2 tution in human APOBEC3G antiretroviral enzyme confers resis2 tance to HIV21virion infectivity factor2induced depletion[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(15):5652256571 22 Schrofelbauer B,Chen D,Landau NR.A single amino acid of APOBEC3G controls its species2specific interaction with virion in2 fectivity factor(Vif)[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004, 101(11):3927239321 23 Bogerd HP,Doehle BP,Wiegand HL,et al.A single amino acid difference in the host APOBEC3G protein controls the primate species specificity of HIV type1virion infectivity factor[J].Proc Natl Acad Sci U.S. A.,2004,101(11):3770237741 (2003207223收稿;2003212222修回) 第三代腺病毒载体的研究进展和应用前景林芳综述 蔡荣钱程审阅 【摘要】 由于腺病毒载体转导目的基因高效率、低致病性、高滴度以及在体内不整合入宿主细胞染色体等优点,腺病毒载体已被认为是最为有效的转基因载体之一,并广泛运用于人类基因治疗。但是腺病毒载体还存在许多不足,故在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体,通常称为辅助病毒依赖型腺病毒或无肠腺病毒或具有高包装能力的腺病毒(high2capacity or gutted or help2dependent Adenovirus,HD2AdV),现将第三代腺病毒载体的特性研究进展作一综述。 【关键词】 第三代腺病毒载体;辅助病毒;Cre/loxP 作者单位:310018浙江理工大学生命科学院 第一代腺病毒载体具有稳定、滴度高、高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版 Construction of recombinant adenovirus vector, amplification and purification 合同编号：XX-2020-01 甲方：___________________________乙方：___________________________ 签订日期：____ 年 ____ 月 ____ 日
腺病毒载体构建重组扩增纯化委托技术服务规范版 前言：合同是民事主体之间设立、变更、终止民事法律关系的协议。依法成立的合同，受法律保护。本文档根据服务合同内容要求和特点展开说明，具有实践指导意义，便于学习和使用，本文档下载后内容可按需编辑修改及打印。 服务方（甲方）：___________________ 地址：____________________________ 邮编：____________________________ 电话：____________________________ 传真：____________________________ e-mail：___________________________ 开户银行：_________________________ 帐号：____________________________ 委托方（乙方）：___________________ 地址：____________________________ 邮编：____________________________ 电话：____________________________
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT