基因工程 整理

1.选择基因是指可使被转化的细胞获得其亲本细胞所不具备的新的遗传特性，从而使得人们能够使用特定的选择性培养基，将转化的新细胞从其亲本细胞群体中选择出来的一类特殊的基因。报告基因特指其编码产物能被快速检测，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞、器官或组织的一类特殊的基因。

2.反式作用因子(trans-acting factor)：能直接或间接地识别或结合在靶核苷酸序列上，参与调控靶基因转录效率的蛋白质总称反式作用因子。其编码基因与其识别或结合的靶核苷酸序列不在同一个DNA分子上。顺式作用元件(cis-acting element):是指存在于基因旁侧序列中影响自身基因表达活性的DNA序列。如转录启动子和增强子等。它作为一种原位(in situ)顺序，其活性只影响与其自身处在同一个DNA分子上的基因。

3.组成性表达看家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达视为基本的或组成性基因表达。

4.基因漂流指转基因生物中的目标基因，在生物的个体、种群甚至是物种间自发转移的过程。

5.穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体

6.粘性末端：实际上是在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新接合起来。7 同裂酶：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶。同尾酶：来源和识别的靶序列均不相同，但都能形成相同的粘性末端的限制性内切酶。8.Star 活性Star activity：在极端非标准条件下，内切酶识别和切割序列的特异性降低，从原识别序列以外的其它位点切割DNA分子的现象。9..基因芯片：又称DNA芯片，是指将大量基因探针分子如寡核苷酸、基因组DNA或互补DNA固定于标记的样品进行杂交，通过杂交信号的强弱判断靶分子的数量，充分利用了分子杂交、分子克隆和聚合酶链式反应三大分子生物学技术。10.α-互补：虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补(α-complement)。11.鸟枪法：利用限制性内切酶消化供体细胞的全基因组DNA成小片段，在DAN连接酶的作用下，将其连接到载体上并转化受体细胞进行随机克隆的方法。12.DNA文库：将特定生物个体的全部DNA片段连接入载体DNA分子上，并导入受体细菌或细胞中，经扩增产生的包含该生物全部基因组序列的克隆群体。（人工构建）13.RACE：是通过简并PCR产物、差异显示片段或已知的序列表达标签(EST),利用通用引物和基因特异引物进行PCR反应,获得全长cDNA的3'端和5'端序列的有效方法。14.酵母单杂交也叫做相互作用陷阱(interaction trap)，是一种在酵母细胞中研究蛋白质间相互作用的分子生物学方法，同时可以通过筛选DNA文库获得与诱饵蛋白互作的靶蛋白编码序列的有效工具。

15.简并引物: 是指编码氨基酸的所有不同碱基可能性的不同寡核苷酸序列的混合物。16.包涵体在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露的水不溶性结构17.融合蛋白：将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架所表达出的蛋白质。18.PEST序列N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列，是胞内蛋白酶的超敏感区，称为PEST序列19.Ti质粒是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的可诱导根瘤形成的环形双链DNA分子。20.T-DNA整合在植物细胞细胞核基因组上的、决定植物形成冠瘿瘤的DNA区段；21.卸甲载体将Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其丧失对植物的致瘤性,仅保留其两侧边界和准确转移所必需的25个碱基序列，故称这种载体为卸甲载体

1.简述基因研究发展的三个阶段及特点(1)基因的染色体遗传学阶段(细胞遗传学): 20世纪50年代之前，主要从细胞染色体水平上进行研究。(2)基因的分子生物学阶段(分子遗传学): 20世纪50年代之后，主要从DNA水平上进行研究。(3)基因工程学阶段(分子生物技术): 20世纪70年代，重组DNA技术的建立，使基因的研究进入了反向生物学研究阶段。

2. DNA复性在基因工程中的应用有哪些？显示不同生物体间的遗传相关性；检测特定的DNA；考查某些序列在特定生物体DNA中的拷贝数；确定特定碱基序列在DNA中的位置；分离克隆基因。

3.简述真核基因的成熟mRNA 的组成5'端的帽子结构,5'-UTR 编码区,3'-UTR,3'端poly(A)尾巴

4. 影响限制性核酸内切酶酶活性的因素1酶的纯度2DNA的纯度3DNA的甲基化程度4酶切消化反应的温度5DNA的分子结构6消化反应的缓冲液系统

5. T4连接酶、聚合酶I、Klenow片段的基本性质及主要用途。T4连接酶:基本性质：1修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键；2修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键；3连接多个平头双链DNA分子；用途：1一条DNA链的3’末端具有一个游离的羟基(-OH), 而在另一条DNA链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)；2、连接反应中需要ATP或NAD+和Mg2+作为辅助因子和激活因子、3、被连接的两条DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部

分，DNA连接酶并不能连接两条单链DNA分子或环化的单链DNA分子。4、实际上，DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现的缺口(Nick)，即封闭双链DNA上两个相邻核苷酸之间所断裂的磷酸二酯键。聚合酶I 基本性质：5’—3’的聚合酶活性；5’—3’的核酸外切酶活性；3’—5’的核酸外切酶活性用途：缺口平移法制备核酸分子杂交探针；cDNA第二链的置换合成；3’突出末端的DNA分子的末端标记；Klenow片段基本性质：5’—3’的聚合酶活性；3’—5’的核酸外切酶活性；5’—3’的核酸外切酶活性失去；主要用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端；标记DNA片段的末端；cDNA克隆中第二链的合成；DNA序列测定

6. 核酸酶及核酸修饰酶的种类及基本性质核酸酶1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII(ExoVII)：大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2+2、双链核酸外切酶：核酸外切酶III(ExoIII)：大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3‘端外酶切3、双链核酸外切酶：l核酸外切酶(lExo)：l核酸外切酶特异性地从5‘端外酶切4、单链核酸内切酶：S1核酸酶：内切单链DNA或RNA；内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA 5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶核酸修饰酶1、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）：不需要模板的DNA聚合酶，在3′端随机掺入dNTPs；可在平端添加同聚尾：效率较低；可在5′突出的3′OH端添加同聚尾：效率较低2、碱性磷酸单酯酶3、T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）：T4-PNP的基本特性：在DNA、RNA的5‘-OH上加磷,用于探针的末端同位素标记

7. 简述质粒的基本特性。（1）自主复制（2）不相容性（3）转移性（4）编码性状

8. 简述考斯质粒的特点。（1）能像λ-DNA那样进行体外包装,并高效转染受体细胞；（2）能像质粒那样在受体细胞中自主复制；（3）重组操作简便,筛选容易；（4）装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围；（5）不能体内包装,不裂解受体细胞。

9. 试阐述λ-DNA载体上常用的选择标记及原理。1lacZ蓝白斑选择标记：原理：lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal 生成蓝色化合物；当外源基因插入到lacZ基因中，基因失活，不能合成蓝色化合物；而空载体λ-DNA则产生蓝色透明斑。2、选择标记cI：透明斑；原理：cI 基因编码一种阻止λ-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物，含有完整标记基因的λ-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因失活，λ-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑；援例：野生型的λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖(Spi+)，这种生长抑制表型受λ-DNA上的red和gam两个基因控制。若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。

10.简述提高重组率的方法有哪些？1、提高外源DNA片段与载体的分子比：5:1-10:1 2、载体DNA分子在连接前先除去磷酸基团3、加装同聚尾末端

11. 简述常用的转化子筛选方法。1、抗药性筛选法：将外源DNA片段插在EcoRI位点：非重组子呈Apr、Tcr；重组子呈Apr、Tcr。将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr；非重组子呈Apr、Tcr。2、营养缺陷型筛选法：载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组份的培养基上，长出的便是转化子。3、显色筛选法：载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选，如大肠杆菌质粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等。

12. 鸟枪法克隆目的基因的有哪些局限性？1、工作量较大，需要了解目的基因的背景知识

2、不能获得的最小长度的目的基因

3、不能除去真核生物目的基因的内含子结构

13. 简述cDNA法克隆目的基因的局限性。1、并非所有的mRNA分子都具有polyA结构

2、细菌或原核生物的mRNA半衰期很短

3、mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难

4、仅限于克隆蛋白质编码基因

14. 基因文库的质量标准是什么？1、重组克隆的总数不宜过大以减轻筛选工作的压力；

2、载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆；

3、克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；

4、克隆片段易于从载体分子上完整卸下；

5、重组克隆能稳定保存、扩增、筛选；

6、具有较高的完备性。

15. 何为图位克隆？请简述其操作的基本程序。图位克隆是在利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，使用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，分离克隆目的基因的一种方法。基本程序：1、先将目的基因定位到染色体上，在目的基因的两侧确定与目的基因紧密连锁和共分离的分子标记；2、利用这些分子标记作探针从基因组文库中筛选出相应的克隆；3、通过染色体步移等技术构建复盖目的基因的克隆重叠群，从重叠群中将候选基因分离出来；4、最后再通过遗传互补试验鉴定出目的基因。

16. 简述包涵体表达形式的优点与缺点优点：1、能简化外源基因表达产物的分离操作

2、能在一定程度上保持表达产物的结构稳定缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的回收率至关重要。

然而，这也是一个技术难题,尤其当目标蛋白分子中的Cys残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%。

17. 试分析以融合形式表达目的蛋白的优缺点。优点：1、目的蛋白稳定性高2、目的蛋白易于分离3、目的蛋白表达率高4、目的蛋白溶解性好5、目的蛋白需要回收缺点：从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。

18.融合蛋白表达质粒的构建原则是什么？1、受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化；2、外源基因应连接在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的蛋白分离回收创造条件；3、精心设计两个结构基因拼接位点处的序列，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺；4、两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架。

19.融合蛋白的位点专一性断裂方法有哪些？化学断裂法溴化氰酶促裂解法单残基位点多残基位点

20. 请阐述利用基因工程制取人胰岛素的策略方法及技术评价。

策略方法：1、A链和B链分别表达法2、A链和B链同时表达法

技术评价：由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10%-20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。3、人胰岛素原表达法技术评价：在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷,使得每克最终产品的成本仅50美元。目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。

21. 试分析二元载体系统的组成及特点

组成：在二元载体系统中，根癌农杆菌菌株中含有两个Ti质粒，一个称为微型Ti质粒，一个称为辅助Ti质粒；微型Ti质粒缺失了vir区，其T-DNA区也进行了卸甲处理，同时引入多个酶切位点，以方便外源基因的插入；此外，它还具有广谱复制元件，可同时在大肠杆菌和根癌农杆菌中生存；辅助Ti质粒只是去掉了T-DNA区，由于它保留了vir区，因此可激活微型Ti质粒上的T-DNA区发生转移；

优点：1、二元载体构建方便，只需将外源目的基因整合到微型Ti质粒上，然后转入农杆菌菌株即可；而一元载体则需要在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低；2、由于一元载体的T-DNA区中含有中间载体，它会随同外源基因一起转入受体细胞，而二元载体则不会带入大量无用的冗余DNA序列。

22. 与一元载体相比，二元载体有哪些优点。1、二元载体构建方便，只需将外源目的基因整合到微型Ti质粒上，然后转入农杆菌菌株即可；而一元载体则需要在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低；2、由于一元载体的T-DNA区中含有中间载体，它会随同外源基因一起转入受体细胞，而二元载体则不会带入大量无用的冗余DNA 序列。

23. 请阐述影响T-DNA转移的因素有哪些1农杆菌菌株2农杆菌菌株高侵染活力的生长期3基因活化的诱导物4外植体的类型和生理状态5外植体的预培养6外植体的接种与共培养

24.何为生物安全？通常是指转基因技术及遗传修饰体在其研究、生产、开发和利用的全过程中可能对植物、动物、人类的身体健康和安全、遗传资源、生物多样性和生态环境带来的不利影响和危害，以及研究和避免这种潜在风险的方法、程序和法律措施。

25.何为“基因流”和“基因污染”? 二者之间的关系如何？

基因流：指生物的个体或群体之间由于杂交而导致的基因交流，在生物安全的文献中特指外源转基因在转基因生物与其有亲缘关系的生物间的流动。

基因污染：指转基因生物的外源基因通过某种途径转入并整合到其它生物的基因组中，使得其它生物尤其是植物的种子或产品中混杂有转基因成份，造成自然界基因库的混杂和污染。

关系：基因流是原因，基因污染是后果，只有从源头上阻断基因流才能防止基因污染的发生

1. DNA的体外重组及重组DNA的遗传转化？

DNA的体外重组同种内切酶生产的粘性末端的连接同尾酶生产的粘性末端的连接

不同粘性末端的连接人工粘性末端的连接粘性末端的更换重组率

重组DNA的遗传转化Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌等)，1970年建立此技术；其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态.大肠杆菌感受态细胞的制备：100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体；用10 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴25 min，离心收集菌体；用1 ml 冰冷的100 mM CaCl2溶液悬浮菌体，即可使用；或加入总体积15％的甘油，-80℃长期保存。

大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的

重组DNA连接液，混匀；冰浴放置半小时；在42℃保温90秒钟（热脉冲）；

快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟；加入1ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增）涂在合适的固体培养基平板上进行筛选

2. 转化子、重组子及目的重组子的筛选与鉴定？

由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子

载体遗传标记检测

1）抗药性筛选法

抗药性筛选法的基本原理抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子

将外源DNA片段插在EcoRI位点: 非重组子呈Apr、Tcr 重组子呈Apr、Tcr

将外源DNA片段插在BamHI位点：非重组子呈Apr、Tcr 重组子呈Apr、Tcs

抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板；再将Ap平板上的转化子影印至含有Ap和Tc的平板上；在Ap平板上生长、但在Ap和Tc平板上不长的转化子即为重组子克隆DNA序列检测

2）菌落噬菌斑原位杂交法

原理根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。

基本操作：用硝酸纤维素薄膜影印克隆平板；用0.4N的NaOH溶液浸泡影印薄膜；80℃烘干固定影印薄膜；用SSC溶液浸泡清洗影印薄膜；薄膜置于含有探针的杂交溶液中保温；用SSC-SDS液洗涤杂交薄膜；用X光胶片覆盖薄膜感光

杂交探针的制备：

用于菌落或噬菌斑原位杂交的探针必须满足下列条件：单链结构（双链DNA可用碱变性）足够长度（至少12个碱基）内部不含互补区

探针的制备方法或来源包括：人工合成；cDNA合成；同源序列；mRNA

杂交探针的标记：T4-PNP介导的末端标记

杂交探针的标记：逆转录酶介导的反转录标记

杂交探针的标记：DNA聚合酶介导的缺口平移标记

杂交探针的标记：ABC荧光标记

杂交探针的标记：ABC显色酶标记

杂交探针的标记：地高辛系统标记

3. 融合表达载体的构建及融合蛋白的表达与分离。