利用Red同源重组技术构建产L_苏氨酸的基因工程菌(1)
RedET同源重组技术概述
RedET同源重组技术概述RedET同源重组技术是一种利用酵母宿主的遗传重组系统，将目标基因在酵母中进行同源重组而得到转基因株系的技术。
该技术在生物医学和生物工程领域具有广泛的应用前景。
本文将对RedET同源重组技术进行概述并介绍其原理、应用以及存在的问题。
RedET同源重组技术的原理基于酵母自然发生的同源重组机制。
酵母是一种单细胞真核生物，其核糖体RNA和转录因子与哺乳动物的细胞中类似，使得酵母成为一种理想的宿主，用于表达复杂蛋白质的研究和生产。
在RedET同源重组技术中，采用了遗传重组系统来介导目标基因与酵母染色体发生同源重组，从而实现目标基因的插入和表达。
RedET同源重组技术的核心是一种诱导目标基因与酵母染色体同源重组的DNA修复机制。
该修复机制主要基于酵母中两个DNA重组酶RecE和RecT的相互作用。
RecE酶在酵母中识别并切割目标基因与酵母染色体之间的同源序列，形成单链切口。
然后RecT酶结合在切口上，介导目标基因与酵母染色体的DNA重组。
最后，通过酵母DNA修复机制，目标基因与酵母染色体实现了同源重组，并插入到酵母基因组中。
RedET同源重组技术具有广泛的应用领域，尤其在基因工程和蛋白表达中具有重要作用。
首先，该技术可以用于基因敲除和基因座替换，为基因功能研究提供了有效的手段。
其次，RedET同源重组技术也可以用于构建表达突变蛋白或蛋白片段的酵母株系，用于蛋白结构和功能研究。
此外，通过RedET同源重组技术，还可以构建酵母株系用于产生异源重组蛋白，并通过大规模筛选酵母株系实现高效蛋白生产。
然而，RedET同源重组技术在应用过程中也存在一些问题和局限性。
首先，该技术的目标基因与酵母染色体之间需要具有足够的同源性，这对于异源基因的插入造成了一定的限制。
其次，RedET同源重组技术在染色体插入位置的选择性方面存在一定的限制，这可能影响目标基因的表达水平和稳定性。
此外，酵母株系在目标基因插入后可能会发生染色体结构的重组和重排，这可能会对酵母的生长和基因表达产生影响。
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文
Red-ET同源重组技术主要内容与运用-生物技术论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——2001年人类基因组测序完成，基因中所含有的大量的功能信息越来越受到人们的关注。
为了解这些复杂的人类密码的含义，对单个基因功能的研究也显得越来越重要。
然而，对于真核生物基因片段而言，其序列中除了包含具有功能、能表达的外显子之外，还含有很多调控序列等内含子，如此一个基因片段则可能大至几十或上百Kb.虽然现今有相应的载体，如BAC（人工染色体）和PAC（P1人工染色体）能装载如此大量的基因信息，但是要找到这些基因片段的限制性内切位点，并在体外对其进行长距离的片段扩增的难度比较大[1、2].Red/ET重组技术是以传统的同源重组技术为基础，但是，相对于普通的同源重组技术而言，它具有简单、快速、高效等特点，而且整个重组过程不需要经过体外扩增阶段，这样可以避免外界环境引起的不必要的突变。
1 传统同源重组自然发生的同源重组是两个DNA分子之间进行片段交换，从而使序列重排。
1956年，在大肠杆菌中，A John Clark发现了两种与同源重组有关的酶，RacA和RecBCD.在同源重组发生的时候，RecA 结合DNA单链或双链，对双链DNA进攻，把原来配对的互补链分开，并尝试自身与被入侵DNA链配对。
当配对成功后，RecA蛋白脱落。
或者在RecBCD的引导下，使目标DNA解旋，以便使外源DNA分子插入并在RecA的帮助下进行重组。
当两条链发生重组时，会产生holliday中间体，该中间体在重组完成时由RuvAB和RecG蛋白进行拆分。
至此，形成两条含有异源序列的双链DNA.在质粒或噬菌体转入大肠杆菌的实验中，当同源区段小于75bp时会使重组率显着降低。
但是实际上，在RecA重组系统中，要求同源臂的长度在1kb左右，且反应条件要求比较苛刻。
2 Red/ET 同源重组技术Red/ET同源重组系统，其实是Red同源重组系统和ET同源重组系统的总称，其中ET系统于1998年由Stewart等在大肠杆菌中导的Rac噬菌体中发现，随后又在噬菌体中发现了Red系统。
2024年苏教版选修3生物下册月考试卷含答案
2024年苏教版选修3生物下册月考试卷含答案考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五六总分得分评卷人得分一、选择题(共8题，共16分)1、在克隆人的问题上,中国政府的态度是( )①禁止生殖性克隆人。
②不赞成；不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验。
③不反对治疗性克隆。
④不反对生殖性克隆和治疗性克隆A. ①②B. ①②③C. ②③④D. ①②③④2、在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因；只有含卡那霉素抗性基因的细胞和组织才能在卡那霉素培养基上生长。
下图为获得抗虫棉的技术流程。
请据图回答，叙述正确的是()①A过程需要的酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶②B过程需要加入卡那霉素进行选择培养③C 过程为脱分化过程，培养基中只需加入营养物质、琼脂④D过程可以用放射性同位素(或荧光分子)标记的抗虫基因作为探针进行分子水平的检测⑤D过程可以用虫感染植株进行个体水平的检测A. ①②③④⑤B. ①②④⑤C. ③④⑤D. ①③④⑤3、图是将人的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图。
已知细菌B细胞内不含质粒A；也不含质粒A上的基因。
判断下列说法正确的是（）A. 将重组质粒导入细菌B常用的方法是显微注射法B. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上，能生长的只是导入了重组质粒的细菌C. 将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上，能生长的可能是导入了质粒A的细菌D. 目的基因成功表达的标志是受体细胞能在含有氨苄青霉素的培养基上生长4、下列选项中能正确说明生物工程技术的是（）A. 植物组织培养是指离体的植物器官或细胞进行脱分化形成新个体B. 动物细胞融合技术目前的用途是培养具有双亲优良性状的经济动物C. 人工诱变、细胞工程、基因工程等都能对微生物进行定向改造D. 动物克隆技术的基础是动物细胞培养5、下列有关哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，错误的是（）A. 受精时，防止多精入卵的两道屏障是顶体反应和透明带反应B. 卵母细胞和精子一般要分别在体外进行成熟培养和获能处理后，才能用于体外受精C. 囊胚期的内细胞团细胞将来发育成胎儿，滋养层细胞将来发育成胎膜和胎盘D. “克隆羊”、“试管羊”、“转基因羊”的培育都需借助胚胎移植技术6、华南虎是国家一级保护动物，可采用试管动物技术进行人工繁殖，该技术包括的环节有（）①转基因②细胞培养③体外受精④核移植⑤胚胎移植A. ①②④B. ③④⑤C. ②③⑤D. ①②③④⑤7、下图为利用二倍体小鼠所做实验的操作流程。
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red两步同源重组法在大肠杆菌基因敲除中的应用李鑫;李亚芯;戴建君【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)007【摘要】基因敲除是研究基因功能最直接的方法.对于大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli)而言,传统的基因敲除方法是利用其原有的RecA系统,此方法依赖于特定的限制性内切酶酶切位点,且所需同源臂长,操作复杂.Red同源重组法的出现使得基因组的改造更为快速、简单,在E.coli基因敲除中的应用也愈加广泛和成熟.作者介绍了Red同源重组系统的组成和同源重组原理,阐述了常用的两步同源重组法敲除E.coli基因的操作步骤及注意事项.大肠杆菌的两步法基因敲除技术已在工程菌改造、病原菌致病机理、耐药机制研究等领域做出巨大贡献,由于两步法仍保留有Red同源重组系统电转效率低、有序列残留的缺陷,作者对几个针对两步法的经典的无痕化改造进行了总结介绍,通过对以上方法及应用进行综述,为以大肠杆菌作为工程菌的基因敲除技术提供参考.%Knock-out is the most direct way to exploregene''s function.The traditional method of Escherichia coli (E.coli) gene knock-out is to use its own RecA reorganization system, which relies onthe specific given cleavage sites of restriction enzymes, requires long homologous arm, furthermore, the operation is complex.Modification of the genome has become simple and rapid since the advent of Red homologous recombination method.And its application in E.coli gene knock-out has been more mature.The structure and functional principle of Red homologous recombination is introduced, besides, this reviewexpounds the operating steps and notices of the common two-step Red-mediated recombination.The Red homologous recombination technology in E.coli has made great contribution in the area of modifications of engineering strain, pathogenicity and bacterial resistance of the pathogenic bacteria.Additionally,the advantages and shortcomings of the method are set forth.According to the disadvantage that the traditional method do leave recombinase recognition site scars and has low efficiency, a sum of classical methods for scar-less gene replacement are described in the final part of the article.These approach can provide better applications for the construction of E.coli genome.【总页数】7页(P1934-1940)【作者】李鑫;李亚芯;戴建君【作者单位】南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095;南京农业大学动物医学院,南京 210095【正文语种】中文【中图分类】Q784【相关文献】1.Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用 [J], 吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿2.Red同源重组在大肠杆菌基因组修饰中的应用 [J], 孙旭;周长林;方宏清3.利用Red同源重组系统进行牛β酪蛋白基因敲除 [J], 薛可;李峰;罗光彬;黄玮玮;陈学进4.Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用 [J], 吴程华;严玉霖;高洪;谭锐;董骎5.以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用 [J], 武有聪;孟媛媛;丁百兴;韩海燕;瞿涤;白丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RedET同源重组技术概述.pptx
引物设计方法
同源臂的长度在15～50bp时，重组效率就能满足实验要求， 重组效率随着同源臂长度的增加而增加。
同源臂长度对Red/ET重组效率的影响（数据来自Zhang et al. 1998）
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red/ET同源重组链退火模型
四、 Red/ET重组中的功能元件
1. Redα、Redβ和Redγ Redα：以三聚体的形式形成“漏斗型”活性的蛋白， 5’-3’外切 酶活性。
Redα结构（A）和与DNA相互作用的模式（B） （图片来自Subramanian et al. 2003）
Redβ：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。 Redγ：抑制RecBCD外切酶和SbcCD外切酶对外源DNA的降解。
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
3. 特点：
Red同源重组技术具有同源序列短(15～50bp)、重组效率高、操作 简单、快速的特点。
4. 应用
这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突 变等操作,无需使用限制性内切酶和连接酶。此外,这种新型重组技术可 直接将目的基因克隆到载体上,目的基因既可来源于细菌人工染色体也 可是基因组DNA。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行, 大大推动功能基因组研究的发展。
red同源重组操作流程
red同源重组操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!Red同源重组操作流程：1. 构建载体，构建包含目标基因同源序列的载体。
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统的差异
质粒: pSC101-BAD-gbaA(amp) pSC101-BAD-gbaA(tet) pSC101-BAD-gbaA(hyg) SC101-Tet-gbaA(tet) pSC101-BAD-ETgA(tet) pSC101-Tet-ETgA (amp)
Red/ET同源重组技术
2015年3月25日
内容
一、 什么是Red/ET同源重组 二、 技术的特点 三、 作用机制 四、 功能元件 五、操作流程及关键因素 六、在基因工程中的主要应用 七、 新技术的发展 八、在其他细菌中的应用
遗传重组
• 基因组的可变性和稳定性之间必须维持 一个恰到好处的平衡，这样才能使生物 体得以生存并能世代相传，繁衍不息。
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
“线状DNA＋线状DNA”重组，选用RecE/RecT重组酶系统； “线状DNA＋环状DNA”重组，选用Redα/Redβ重组酶系统；
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
引物设计方法
RedET同源重组技术概述(PPT 49页)
广义遗传重组：任何造成基因型变化的基因交流过程
◘ 狭义遗传重组：涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流 ◘ 重组可分为四类（DNA序列、蛋白质因子）
异常
◘ 遗传重组与重组DNA技术
一、 什么是Red/ET同源重组
1. 概念
Red/ET重组是新近出现的一种利用来自E. coli中λ 噬菌体的重组 酶Redα/Redβ 或者是来自 Rac 噬菌体的重组酶RecE/RecT 进行基因同
六、 Red/ET重组技术的主要应用
1. 重组质粒的构建 2. 染色体的修饰 3. 亚克隆（Subcloning） 4. 直接克隆（Direct cloning）
1. 重组质粒的构建
(1) 传统基因克隆技术的缺点
➢ 传统克隆技术依赖限制性酶切位点和内切
酶的消化，当缺
少合适的酶切位点或者某个酶切位点在目的片段中大量存在时，
降低模板对筛选工作带来的难度；
（1）纯化回收PCR产物； （2）内切酶消化处理模板； （3）使用R6K复制子。
3. 线性载体的制备
线性化载体可以通过酶切或PCR扩增两种方法获得。 1）酶切
选取合适的位点，单酶切或双酶切皆可,质粒的线性化不彻底，将导致阴性 克隆的产生，为了提高阳性率，建议通过双酶切进行质粒线性化。 2）PCR扩增
“质粒多聚体”问题解决办法：
采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统；
减低质粒拷贝数。
“质粒多聚体” 现象
卡那霉素抗性基因（Kan）替换pUC19中的氨苄抗性基因（Amp）
解决办法： 采用“线性DNA+线性DNA”重组方式； 利用RecE/RecT重组酶系统； 减低质粒拷贝数。
基因敲除技术在微生物中的应用
基因敲除技术在微生物中的应用王雪; 黄建忠; 李力【期刊名称】《《微生物学杂志》》【年(卷),期】2019(039)004【总页数】7页(P100-106)【关键词】基因敲除技术; 微生物; 研究进展; 成功案例【作者】王雪; 黄建忠; 李力【作者单位】福建师范大学生命科学学院福建福州 350108【正文语种】中文【中图分类】Q939.9基因敲除技术，又名基因打靶，自20世纪80年代发展起来，主要建立在同源重组的基础上，属于一种新型分子生物学技术。
经典的基因敲除技术是指通过同源重组原理将标记基因定点地整合入目标细胞基因组上某一特定的位点，以达到细胞内某一目的基因敲除的一种技术。
基因敲除技术已经广泛应用于动植物、微生物，应用形式多种多样，主要有同源重组法、随机插入突变法、RNA干扰法、ZFNs法、TALEs法，此外，还有目前热点研究的CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除技术。
基于同源重组的基因敲除技术主要有RecA系统同源重组法、Red系统同源重组法、基于自杀载体的同源重组法、基于温敏型质粒的同源重组法。
这四种方法各有优缺点，要根据不同的微生物不同的条件选择不同的方法，其基本原理如图1。
基因敲除技术的热门也使得一大批发明专利涌现。
本文对几种广泛应用于微生物的基因敲除方法进行介绍，并提供一些成功案例及发明专利，各种方法的比较见表1。
图1 同源重组法进行基因敲除的一般原理Fig.1 Ceneral principles of gene knockout by homologous recombination表1 基因敲除方法的比较Table 1 Comparison of gene knockout methods方法来源动力常见质粒特点RecA系统大肠埃希菌功能蛋白-同源臂长,反应条件苛刻,操作复杂Red系统λ噬菌体功能蛋白pKD46同源序列短,相对简单自杀型载体其他生存压力pK18mob、pSVP202同源序列较短,重组效率高,简单温敏型质粒其他生存压力pKC1139、pBV220操作简单,应用范围广CRISPR/Cas系统细菌、古细菌Cas蛋白-编辑效率高,靶向性强,操作简单,脱靶效应注：“-”表示无特定质粒1 基因敲除技术原理1.1 RecA系统同源重组法RecA同源重组系统是大肠埃希菌中的内源性同源重组机制，组成它的蛋白质包括RecA蛋白和RecBCD等[1] 。
基因工程菌株的构建方法 同源重组法
基因工程菌株的构建方法同源重组法一、同源重组法概述同源重组法是一种基于DNA同源序列的精确重组技术，常用于基因工程和分子生物学研究中。
通过同源重组，可以将外源DNA片段准确地插入到目标基因组位点，实现基因的敲除、敲入、点突变等操作。
同源重组法在基因治疗、基因组编辑、代谢工程等领域具有广泛的应用价值。
二、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA的同源序列，通过DNA的碱基配对实现精确的基因重组。
在同源重组过程中，首先需要构建一个同源臂（通常是几百bp至几千bp的DNA片段），一端与外源DNA片段相连，另一端与目标基因组位点配对。
当同源臂与目标基因组位点配对时，DNA聚合酶可以延伸同源臂，并引导外源DNA片段插入到正确的位置。
由于同源序列的高度特异性，同源重组具有很高的精确度，减少了随机整合的风险。
三、同源重组的过程同源重组的过程通常包括以下步骤：1.构建同源臂：根据目标基因组位点的序列信息，设计并合成一对同源臂，一端与外源DNA片段相连，另一端用于与目标基因组位点配对。
2.基因组靶点定位：将含有同源臂的外源DNA片段导入细胞或生物体中，并定位到目标基因组位点。
3.同源臂与目标基因组位点配对：同源臂与目标基因组位点上的同源序列通过碱基配对结合。
4.DNA延伸和重组：DNA聚合酶在同源臂的引导下，延伸同源序列并实现外源DNA片段的精确插入。
5.筛选和鉴定：通过特定的筛选和鉴定方法，如PCR、测序等，对经过同源重组的基因工程菌株进行鉴定和筛选。
四、同源重组法的应用同源重组法在基因工程和分子生物学领域有广泛的应用价值，包括以下几个方面：1.基因敲除：通过构建含有同源臂的敲除载体，将敲除载体导入细胞或生物体中，实现特定基因的敲除。
2.基因敲入：将外源基因通过同源重组法精确地插入到目标基因组位点，实现外源基因的稳定表达。
3.点突变：通过同源重组法实现基因组中特定位点的突变，用于研究突变对蛋白质功能的影响。
4.基因治疗：利用同源重组法将正常的基因精确地插入到病变细胞中，以补偿缺陷基因的功能，实现基因治疗的目的。
实验93RedET同源重组2015325
根据需要选择含不同抗生素抗性基因（Ampr、Hygr、Tetr）和不同 的诱导型启动子（pBAD、pTet）的重组酶系统表达质粒。
RecE/RecT和Redα/Redβ两重组系统对不同类型底物重组效率的差异
源重组的DNA工程技术。
2. 原理
首先重组酶沿5’→3’方向消化双链DNA，露出粘性末端（15-50bp）。 随后重组酶介导单链退火修复（single- strand annealing），即载体 和插入片段的黏性末端（15-50bp） 互补形成稳定的带缺刻的环状重组 质粒，转化大肠杆菌后能自动被修复为闭合的环状质粒
Red同源重组技术相关文献
Nature Genetics (1998)
Nature Biotechnology (2000)
二、Red/ET同源重组技术的特点
1. 不依赖RecA蛋白，在重组酶系统（Redα/Redβ或 RecE/RecT）的相互配合下，含短同源臂（15~50bp）的供体
DNA分子能直接重组到受体DNA分子上，实现替换、插入、删 除、突变等；
λ噬菌体的pL操纵子示意图
l phage
gba
Rac phage
ET
Rac recE/recT 操纵子 = λ red 操纵子, 操纵子中的重组酶 （Redα/Redβ 或者RecE/RecT）协同配合完成重组作用；
recE = red α ：5’→3’ dsDNA核酸外切酶；
recT = redβ ：ssDNA结合和退火蛋白；
• 染色体的遗传差异主要由两种 机制产生， 一种是突变，一种是遗传重组。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
终浓度为 100 mm ol /L 的阿拉伯糖继续培养至 OD600为 0. 5 ~ 0. 6。将 50 m l过夜培养液冰浴至 0e , 4e 离心后 用去离子水重悬, 12 000r/m in 离心收集菌体; 用预冷到 0e 的 10%甘油洗 3次, 最后将菌体重悬于 600 Ll冷的 10% 的甘油中, 取 50 L l菌液与约 200 ng的打 靶分子 DNA 片段进行电转化 (电转化条件 1800 V, 5 m s)。电 击后立即加入 1 m l SOC 液体培养液。 37e 振荡培养 2 h, 涂布于 LB 平板 ( Cm r 34)筛选阳性克隆。
收稿日期: 2009-09-23 修回日期: 2009-11-04 * 国家 / 8630计划 ( 2006AA 02Z216 ) 资助项目 ** 通讯作者, 电子信箱: w enty@ im. ac. cn
苏氨酸生产菌 株, 由于随机 突变造成菌 体遗传背 景改 变、生产能力减 弱、发酵周期长, 不利于 进一步提 高产 量。而利用分子生 物学的研究 方法和 技术, 通过 对基 因的表达和调控进行有目的性的改造而构建的工程菌 株, 不产生次 级突 变, 代 谢副 产物 少, 产 量容 易 提高。 随着分子生 物学技术以 及系统代谢工 程理论 的发展, 更多的分子生 物学手段运 用于菌种的 构建和改 造, 以 提高生产菌 L-苏氨酸的产量。
通过电转化的方法将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065分别 转入构 建的突 变菌 株 ITHR vm etA、 ITHRv ilvA 和 ITH R v m etA v ilvA 中, 通过 氯霉素 抗性 筛选阳性克隆, 得到基因工程菌。 1. 6 5 L 罐流加补料发酵
种子 培养: 接种 单菌 落于 LB 活 化平 板 ( Cm r 34 ) 37e 培 养 24h。 接种一 环菌 体于 200 m l种子 培养 基
WY 027 5c-GAGGTG ACA AAGCCTGGA C-3c
WY 028 5c-GGAAGTGGTG CTGG AAAACA-3c
1. 4 利用 R ed同源重组 技术敲除大肠 杆菌 ITHR 的 m etA 和 ilvA 基因 R ed同源重组系统如图 1所示, 在第一轮体内重组
过程中, 以 pKD46-R ed为介导, 在大肠杆 菌 ITH R 菌株 体内以带 56 bp同源臂的 ca t基因线性打靶序列替换其 染色体上的 m etA ( ilvA )目的基因, 通过氯霉素抗性筛选 获得重组子 ITHR v m etA J ca t ( ITH R v ilvA J cat )。在 第二轮体内重组过程 中, 将编码 FLP 位点特异 性重组 酶的 质 粒 pCP20 转 入 突 变 菌 株 ITHR v m etA J ca t ( ITH Rv m etA J ca t)中, 在含氨苄青霉素抗性的 50 m g/ L 平 板 上 培 养, 菌 落 PCR 筛 选 ITHR vm etA ( ITHR v ilvA ) 阳性 重组子。并在已敲除 菌株 ITH R vm etA 基 础上转入 pKD46 再敲除 ilvA 基因, 构建双敲除菌 ITHR vm etA v ilvA。 1. 5 质粒转化
表 1 本研究所用引物
T ab le 1 Pr im ers in th is study
引物名
引物序列 ( 5c-3c)
WY
041
5c-TCTTCAGCTATCTGGATGTCTAAA CGTA TAAGCG TATGTA G TGAGGTAATCAGGTTTTGAGCGATTGTG TAGGCTGG A G-3c
80
中国生物工程杂志 China B io techno logy
Vo .l 30 No. 3 2010
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌株和质粒 大肠杆菌 ( E schericher coli ) ITH R 为天津科 技大学代 谢工程 研究室保 藏菌种。含 有 th r 操纵子的质粒 pWYE065( Cm r )为中国科学院工业微生 物与生物技术研究室保藏。质粒 pKD46( 温度敏感型, 含有受阿 拉伯 糖启动 子调 控的 exo、bet 和 gam 基 因, Am pr )、pKD 3(含有两端带有 FRT 位点的氯霉素抗性基 因, Cm r ), pCP20( 温度敏感型, 编码能够识别 FRT 位点 的 FLP重组酶, Cm r, Am pr ) 均由军 事科学院 生物工 程 研究所王恒梁研究员惠赠。 1. 1. 2 培养基 培养基见参考文献 [ 7] 。 1. 1. 3 主要试剂与仪器 限制性内切核酸酶、Ex-T aq DNA 聚合酶、dNTP、DL2000核酸 M arker等购自大连宝 生物工程有限公司; 酵母粉、胰蛋 白胨购 自英国 Oxoid 公司; 琼脂粉、DGL4000核酸 M arker购自北京鼎国生物 技术有限责任公司; 染色体 DNA 提取试剂盒和质粒提 取试剂盒等购自天根生 化科技 (北 京 ) 有限 公司; L-阿 拉伯糖、氨苄青霉素、氯霉素均购自美国 S igm a公司; 其 它葡萄糖、无机盐、有 机试剂等均 为国产 分析纯试 剂。 UVP凝胶成像仪 ( JY04S-3B, 北京君意东方电泳设备有 限 公 司 ); PCR 仪 [ 5332, 德 国 艾 本 德 股 份 公 司 ( EppendorfAG ) ]; 电泳仪 ( JY300C, 北京君意东方电泳 设备有限公司 ); 紫外分 光光度计 ( UV-1800, 上海美 普 达仪器有限公司 ); 5 L 四联离位灭菌发酵罐 ( B IOTECH 系列, 上海保兴生物设备 工程有限公司 ); 高效液相 色 谱 ( Ag ilent 1200系列, 安捷伦科技有限公司 )。 1. 2 引物设计与合成
L-苏氨酸是人体必需的八种氨基酸之 一, 在食品、 医药等方面有极其重要的用途 [ 1-3] 。 L-苏氨酸是除谷氨 酸和赖氨 酸 外世 界 范围 内 年产 量 最 高的 氨 基 酸, 在 2005 年 L-苏氨酸的年产量约为 7 万吨 [ 4]。 L-苏氨酸生 产方法主要有化学合成法、酶解法和微生物发酵法 [ 5]。 由于成本低廉且废 弃物排放比 较少, 微生物 发酵法 是 目前工业生产 L-苏氨 酸的最常 用方法。目前, L-苏 氨 酸的 主 要 生 产 菌 株 有 黄 色 短 杆 菌 ( B rev ibacterium f lavum )、谷氨酸棒杆菌 (C orynebacterium g lutam icum )和 大肠杆菌 (E scherich ia coli), 而 E. coli 由于繁殖迅速、发 酵温度高、生理生化基础研究比 较深入等特征 成为 L苏氨酸生产的 最常 用菌 株 [ 6] 。为提 高 L-苏氨 酸的 产 量, 各种不同的育种方法被 广泛应用于 L-苏氨酸生 产 菌的选育。通过传统的化学和物理诱变技术选育的 L-
本研究通 过分析 L-苏氨酸 的代谢途 径, 应用 R ed 同源重组技术敲除大肠杆菌 ITH R 中 L-苏 氨酸合成的 支路代谢途径中编码高丝氨酸转酰基酶的 m etA 基因和 编码苏氨酸脱 氢酶的 ilvA 基因, 分别构 建了单敲 除突 变菌和双敲除突变菌。将携带苏氨酸操纵子的工程质 粒 pWYE065转入突变株中, 进行 5 L 发酵罐连续发酵 培养, 结果表明阻断 L-苏氨酸的代 谢旁路途径 可以增 强 L-苏氨酸的积累。
2010, 30( 3)
闫继爱 等: 利用 R ed同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌
81
pW YE065与 ITHR / pW YE 065L-苏氨酸产量差异的统计 学意义 检 验 采 用 Coch ran 检 验 方 法 分 析 比 较; 菌 株 ITHR v m etA v ilvA / pW YE 065 与 ITH R /pWYE065 L-苏 氨酸产量差异的统计学意义检验采用 W ilcoxon 秩和检 验方法分析比较。p < 0. 05时结果具有统计学意义。
采用 P rmi er 5. 0软件根据 G enB ank 中 m etA、ilvA 和 质粒 pKD 3中的 cat基因序列信息, 设计引物并由上 海 英骏生物技术公司合成, 引物序列见表 1, 其中下划 线 部分为同源臂序列。引物 WY 041 和 W Y042用于扩 增 ca t 基 因 以 替 换 m etA 基 因 编 码 区; 引 物 WY 019 和 W Y020为 m etA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条引物 各位于打靶序列区的左右两侧; 引物 WY 039 和 WY 040 用于扩增 ca t基因以替换 ilvA 基因编码区; 引物 W Y027 和 W Y028为 ilvA 基因敲除后重组菌鉴定引物, 两条 引 物各位于打靶序列区的左右两侧。 1. 3 感受态的制备与电击转化 [ 8]
中国生物工程杂志 China B io techno logy, 2010, 30( 3) : 79-84
利用 Red同源重组技术构建产 L-苏氨酸的基因工程菌*
闫继爱 1, 2 张 雪 1, 2 张 芸 2 左佃光 2 陈ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ宁 1 温廷益 2**
( 1 天津科技大学生物工程学院 天津 300457 2 中国科学院微生物研究所 北京 100101)
WY
039
5c-GCA ACCAG CG CCGA CAAAG GCGCG GTGCGCGATAA ATC GAAACTGGGGGGTTAA TA TTGAG CGATTGTGTAGGCTGGAG-3c
WY 040
5c-AATGA CGTTGTCGCG CGGGTAGG CCTGATAAG CGAAGCG CTATCAGGCATT TTTCCTAACGGCTGACATGGGAATTAGC-3c