宏基因组测序技术检测方法

用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增的rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。

测序深度：

数据分析：

使用免费的软件包对微生物的种群多样性进行鉴定，并进行比较。

1.MEGAN：一个宏基因组分析工具，可以在大量的测序数据中对测序结果进行

聚类分析。

2.MG-RAST：用于注释宏基因组样品的全自动软件。

3.IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体的功能性。

4.CAMERA：致力于微生物生态学研究。

5.CARMA：可以通过未拼接的序列来进行物种组成和微生物的遗传潜力的研究。

6.GALAXY：用于高等真核生物的研究，例如昆虫等。

7.Greengenes：16S rRNA的数据库，可以用来做16S rRNA的比对。

8.QIIME：针对454测序数据的宏基因组分析。

9.The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序的分析方法。Miseq Platform：

Miseq平台读长可以是2X250bp或2X300bp。使用Miseq Reagent Kit V2可以产出7.5-8.5Gb的数据，使用Miseq Reagent Kit V3可以产出13.2-15Gb 的数据。

文库构建：

根据感兴趣的片段设计引物，通过PCR扩增出片段做为模板构建文库。使用Nextera XT Sample Prep Kit构建文库，按照试剂盒说明书操作。将建好的文库归一化处理并将其混到一起。在Miseq系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。

文库检验：

用Agilent 2100检测文库大小片段是否与预期一致。文库片段是否集中。

测序深度：

16S rRNA测序深度应至少在50,000条reads以上，以保证较好的覆盖度。

数据分析：

对微生物生态进行定量观察

Greengenes：16S rRNA基因数据库和分析工具；

宏基因组分析工具：MEGAN

核糖体数据库计划(RDP)

Ion Torrent Platform：

Ion Torrent平台主要有两个测序系统：Ion PGM System和Ion Proton System。Ion PGM有两种读长，200bp和400bp，Ion PGM主要应用三种芯片，

Ion 314 Chip，Ion 316 Chip和Ion 318 Chip，最多数据产出可以达到2Gb。Ion Proton读长为200bp，最多数据产出可达到10Gb。

文库构建：

使用Ion Plus Fragment Library Kit为16S rRNA扩增产物加上barcode 标签，一共有96个barcode可以选择。加上标签后使用Ion PGM? Template OT2 200 Kit在Ion OneTouch? DL System上进行乳液PCR，完成文库构建。测序时根据需要不同的读长选择不同的测序试剂盒。

测序深度：

对于人体肠道微生物16S rRNA测序，对于检测高丰度的样品，每个样品至少要测10000条reads，而对于检测低丰度的样品，则需要1,000,000以上的reads数。

1)全宏基因组测序Whole-metagenomics Sequencing Roche 454 platform:

文库构建：

提取宏基因组DNA，总量不低于10ug，且样品DNA应相对完整。使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit构建文库，按照说明书进行相应操作。

文库检验：

DNA reads数与微球的比例在8%左右，可以达到比较理想的测序结果。

测序深度：

每个样品应至少保证10,000条以上的reads数。

Hiseq platform:

Hiseq平台主要有Hiseq 2000和Hiseq 2500两个测序系统。Hiseq 2000测序读长是2X100bp Paired-end测序，一次运行通量可达600Gb以上，Hiseq 2500有两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行可以达到2X150bp，产生最多180Gb的数据，高通量读长在2X125bp，数据产出在600Gb以上。

文库构建：

将提取的宏基因组DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNA XT/LT

Sample Prep Kit (illumina)按照protocol进行文库构建，DNA起始投入量应在1ug以上。

文库检验：

将建好的宏基因组文库使用KAPA SYBR FAST ABI Prism 2X qPCR Master Mix (KAPA Biosystems) 试剂盒，利用ABI 7500荧光定量PCR仪，测定文库的浓度。文库的浓度必须大于2nM。

使用DNA 1000分析试剂（Agilent），利用Agilent 2100生物分析仪分析文库的片段长度范围和质量。文库片段的大小范围在目的大小区间内且相对集中。测序深度：

每个样品应至少测3,100,000条reads以保证比较好的覆盖度。