微生物学 实验2 细菌的简单染色和革兰氏染色

1、造成革兰氏染色结果不正确（假阳性或假阴性）的主要原因有哪些？ 2、如果某一细菌的革兰氏染色结果为红色，能否确定该菌就是革兰氏阴性菌？
下次实验题目：放线菌及蓝细菌的形态观察 酵母菌的形态观察及大小测定
涂片不易过厚，否则造成局部菌体脱色不完全，而使G-菌呈现革兰氏阳性结果。
2、染色
（1）初染。将玻片置于玻片架上，加适量（以覆盖菌膜为度）结晶紫染液染色1～2 min；倾去 染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗，直至流下的水为无色。 （2）媒染。加卢戈氏碘液一滴，染色1 min，水洗。 （3）脱色。将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20～25s至流出液无色，立即水洗。 （4）复染。滴加蕃红复染2min后，立即水洗至流出液无色。 （5）干燥及镜检。将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。先用低倍镜找到视野后，再 换油镜观察 ，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电 离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料的染色部分带负电荷），因此， 碱性染料很容易与菌体结合而是菌体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使 肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细 菌仍保留初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫色。
G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时， 细胞壁因类脂被溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出， 而使菌体变成无色，再经番红复染就成为红色。
三、实验器材
1、菌种： 革兰氏染色：培养12 h～16 h的枯草芽孢杆菌120和培 养24 h的大肠杆菌。
脱色时间对革兰氏染色结果的影响：脱色时间过短，G-菌转呈革兰氏阳性结果； 如果脱色时间过长，G+菌转呈革兰氏阴性结果。 媒染时间对革兰氏染色结果的影响：媒染时间过短，不利于结晶紫与细胞之间 的结合，而使G+菌转呈革兰氏阴性结果;媒染时间过长，而使G-菌转呈革兰氏 阳性结果。
结晶紫 碘液
95%乙醇 番红
1、涂片：取干净载玻片，火焰灼烧后，横放于玻片架上； 在载玻片中央滴一小滴生理盐水， 用接种环以无菌操作取少许菌体于水滴中（注：不要挑破培养基）， 混匀并涂成薄膜（注：涂片不易过厚）。
2、干燥：用夹子夹住载玻片一端（菌膜面朝上），反复通过火焰高处数次， 烘干菌液（注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形）。
（二）革兰氏染色 （见P12)
1、涂片、固定
（1）涂片——“三区”涂片法。在载玻片的左端先加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取 少量苏云金芽孢杆菌与左边水滴混合；将载玻片倾斜使少量菌液延伸至玻片中央。在载 玻片的右端加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量大肠杆菌与右边水滴混合；将玻片倾 斜使少量菌液延伸至玻片中央。（三区：左区——苏云金芽孢杆菌区；中央区——两种 菌的混合区；右区——大肠杆菌区）。 （2）干燥及固定。步骤同简单染色法。
2、染色液和试剂： 结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄或蕃红
3、器材： 载玻片、接种杯、木夹子、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
菌龄对革兰氏染色结果的影响：选取处于活跃生 长期——指数生长期的菌体进行革兰氏染色。菌 体尚未成熟或菌体过老，可能使染色结果呈现相 反的结果。
四、实验步骤
（一）简单染色的步骤 （见P11）
实验二 细菌的简单染 色法和革兰氏染色法
一、实验目的
1、学习并掌握简单染色和革兰氏染色的原 理及步骤。
2、学习微生物涂片、染色技术和无菌操作。 3、巩固显微镜油镜的使用技术。
二、实验原理
1、细菌的简单染色原理
①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增 加菌体的显示力，从而更清楚地观察到其形态和结构。
初染 1～2min
媒染 1min
脱色 20～25s
复染 2min
（五）作业
绘出大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。
大肠杆菌（10×100） 枯草芽孢杆菌120（10×100）
大肠杆菌___ 色，革兰氏___性菌；枯草芽孢杆菌120___ 色，革兰氏___性菌。
（六）思考与讨论
3、固定：用夹子夹住载玻片一端，迅速过火焰2～3次， 使菌体固定于载玻片上。
4、染色：将玻片平放于玻片架上，加适量（以盖满菌膜为度）染液于涂片上。 染色时间1-2min。
5、水洗：倒去染液，用洗瓶自载玻片的一端轻轻冲洗（切勿将菌膜冲掉）， 直至流下的水为无色为止。
6、干燥：将玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水纸沿菌膜外缘吸干残留水分。 7、镜检：先用低倍镜找到视野后，再换油镜观察 。