基因工程题库及答案汇编

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一、填空题

1．基因工程是年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统的生物技术时代，走向的时代。

2．随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过、和等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。

3．Cohen 等在年构建了第一个有功能的重组DNA 分子。

4．基因工程的两个基本特点是：(1)，(2)。

5．基因克隆中三个基本要点是：；和。

6．年，美国斯坦福大学等在上发表了题为：“将新的遗传信息插入SV40 病毒DNA 的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E．coli 半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文，标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有。7．克隆基因的主要目的有四：(1)；(2)；(3)；(4)。

填空题答案

1． 70；按人们的需要而定向地改造和创造具有新的遗传性品种。2．细菌发酵；真核细胞培养；乳腺生物反应器。3． 1973

4． (1)分子水平上的操作；(2)细胞水平上的表达。5．克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择

6． 1972；P．Berg；Proc．Natl．Acad．Sci．USA；证明体外重组的 DNA 分子具有生物学功能

7． (1)扩增 DNA； (2)获得基因产物；(3)研究基因表达调控；(4)改良生物的遗传性

二、选择题(单选或多选)

1．因研究重组DNA 技术而获得诺贝尔奖的科学家是( )

(a)A．Komberg (b)W．Gilbert (c)P．Berg (d) B．McClintock

2．第一个作为重组DNA 载体的质粒是( )

(a) pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8

3．第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( )

(a)EcoRI (b)EcoB (c)EcoC (d)EcoRⅡ

4．P Berg 构建SV40 二聚体时用了几种不同的酶，其中( )的作用是制造隐蔽的5’端。

(a)末端转移酶(b)λ外切核酸酶(c)外切酶Ⅲ(d)DNA 连接酶

选择题(单选或多选)答案：1．C；2．C；3．a；4．b。

三、简答题

1．为什么说基因工程技术是60 年代末70 年代初发展起来的?

答：这是因为：(1)1967 年发现了连接酶；(2)大肠杆菌的转化技术是 1970 年获得突破；(3)限制性内切核酸酶的分离始于 1970 年；(4)Berg 在 1972 年构建了第一个重组的 DNA 分子。

2．重组DNA 的含义是什么?

答：将一个生物的 DNA 片段插入到一个载体中，并引入到另一生物体中进行繁殖。

3．如何理解基因工程的两个特点?

答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括 DNA 分离、切割和连接(还有其他一些 DNA

的修饰等)。由于体外重组 DNA

的最终目的是要改变生物的遗传性，所以分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。

4．在Cohen 构建有生物功能重组体的第一步实验中，用EcoRI 切割了R6-5 质粒，然后转化E．coli C600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了pSCl02，它是由R6-5 的三个EcoRI 片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性?

答：至少可说明两点：(1)pSC 102 含有复制起点，是一个独立的复制子；(2)重组 DNA分子中的卡那霉素抗性基因得到了表达。

5．什么是动物乳腺生物反应器?

答：能够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品，并通过乳腺分泌出来。

四、问答题

1．S．N Cohen 于1973 年构建了三个重组体，pSCl02，pSCl05，pSCl09 请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么?

答：pSCl02：用 EcoRI 切割 R6-5，混合转化大肠杆菌，在卡那霉素抗性平板上选择了一个克隆，并从该克隆中分离了重组质粒

DNA，命名为 pSCl02。该质粒是由质粒 R 6-5的 EcoRI 酶切片段Ⅲ、V 和Ⅷ在体内连接的，说明可以利用体内连接构建重组体。

pSCl05：作者分别用 EcoRI 切割质粒 pSC 101、pSC 102,然后加入 DNA

连接酶进行连接后转化大肠杆菌，在四环素和卡那霉素双抗性的平板上筛选到 pSC

105。说明用质粒作为载体，体外连接可得到有功能的重组体。

pSCl09：pSC 101 与 RSF 1010 的共整合，即用 EcoRl

分别切割这两个质粒，然后在体外进行重组。说明两个独立的复制子体外重组后仍具有生物功能。

2．基因克隆是如何使含有单个基因的DNA 片段得到纯化的?

答：大分子量的 DNA

会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的 DNA

片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时(图

A14.1)，每个片段将插入一个不同的载体分子(比如一个质粒)，同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA分子而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体 DNA

片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认了，此重组 DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。

五、概念题

1．遗传工程：

是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或DNA分子进行按图施工的遗传操作，以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。

2．生物技术：

又称生物工艺学，生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。

3．基因工程(geneengineering)：也称基因操作(genemanipulation)、重组DNA(recombinant

DNA)。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导人活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。

4．细胞工程(cellengineering)：

应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术，以及在体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品，或利用细胞体本身的技术领域。主要内容包括细胞融合、细胞拆合、染色体转移、基因转移、细胞或组织培养等。由于所用细胞的来源不同，细胞工程又分为微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程等。

5．细胞分泌工程：

是根据细胞内蛋白质合成和运输理论而发展起来的一项新的细胞工程技术，主要是通过对基因改造，如基因缺失、多效分泌突变、周质泄漏突变或拼接信号肽基因等措施，促进基因产物分泌的技术。

6．酶工程(enzymeengineering)：

又称为酶技术。它是围绕着酶所特有的生化催化特性，结合现代化的技术手段，在体外模拟或在常温常压下生成酶反应的产品；以及利用重组DNA技术定向改变酶，进行酶的修饰，或酶的全人工合成。其主要内容包括酶的化学修饰、酶的固定化、酶反应器等。

7．蛋白质工程(protein engmeenng)：

是更广义上的包括酶工程在内的蛋白质修饰操作，通过对蛋白质及酶的化学修饰及基因改造获得具有特殊功能的非天然蛋白质的技术。主要是根据蛋白质的结构和功能间的相互关系，利用基因工程技术，或用化学方法合成基因、改造基因，以便合成新的蛋白质，或改变蛋白质的活性、功能以及溶解性等。

8．发酵工程(fermentation engineering)：

又称微生物工程，微生物发酵工程。利用生物，主要是微生物的某种特定功能，通过现代化工程技术手段，生产有用物质，或把微生物直接用于某种工业化生产的一种技术体系。主要内容包括菌种选育，发酵生产微生物，或植物细胞的代谢产物，生产微生物菌体，最佳培养条件的优化组合等。

9．移动基因(movable gene)又叫转座元件(订ansposable

element)。是一类可以在同种DNA或异种DNA间移动的基因，但这种移动只是移动一个拷贝，在原来的位置仍保留一份拷贝。移动基因最早

是B．McClintock夫人1951年在玉米中发现，她因此获得1983年医学和生理学诺贝尔奖。

10．断裂基因(splitgene，intermptedgene)是被间隔序列间隔成若干部分，而形成不连续形式的基因，是真核基因的普遍形式。断裂基因首先在腺病毒中发现。将断裂基因中不出现在成熟mRNA中的部分称为内含子(inffon)，出现在成熟mRNA上的部分称为外显子(exon)。如卵清蛋白基因有7个内含子。

11．重叠基因(overlapping

gene)是指一个基因的序列中，含有另一基因的部分或全部序列。即一段DNA序列中含有合成两个或两个以上的多肽的基因。重叠包括编码区和控制区的重叠。基因重叠现象是英国分子生物学家Sanger

1977年在测定噬菌体9X174的DNA序列时发现的，在噬菌体~X174的9个基因中，O基因与A基因重叠，而E基因与D基因重叠。

12．假基因(pseudogene)是一类在基因组中稳定存在，序列组成也酷似正常基因，但不能表现出任何功能的DNA序列。它是相应的正常基因突变而丧失活性的结果。从机理上推测，有可能是插入或缺失引起了移码突变或者是点突变，改变了一些剪接信号使之不能正常加工，或是mRNA反转录后再插入的结构。

第二章限制性内切核酸酶

一、填空题

1．严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是的酶。基因工程中把那些具有识别的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。

2．年Luria和Human 在T 偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的现象。

3．1970 年，Smith 和Wilcox 从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割DNA，这个酶后来被命名为，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。

4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的。

5．Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20~40kDa，通常由亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA 杂合链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有专一性，也具有专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有，产生

末端的DNA片段或的DNA片段。作用时需要作辅助因子，但不需要和。

6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1) (2) 。

7．Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有倾向，即它们在识别序列中含量较高。

8．EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是α2 β2 γ，分子量300kDa。在这些亚基中，o 亚基具有作用；β亚基具有

的活性；γ亚基的作用则是。

9．个体之间DNA限制性片段长度的差异叫。

10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自，第二、第三两个字母取自，第四个字母则用表示。

11．限制性内切核酸酶Acy I识别的序列是5’—GRCGYG-3’，其中R ，Y 。

12．在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2 秒钟，其目的是和。

13．部分酶切可采取的措施有：(1) (2) (3) 等。

14．第一个分离的限制性内切核酸酶是；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是。

15．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是，它们属于。

16．由于DNA是由4 种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是。

17．Sal I和Not I都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb 片段中，找到NotI切点的概率是。18．部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是。19．I类限制酶识别DNA 的位点和切割的DNA位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是，另一种是。20．限制性内切核酸酶通常保存在浓度的甘油溶液中。

填空题答案

1．限制—修饰系统的一个组成部分；双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构2．1952；限制和修饰。3．HindⅡ。4．限制性酶切图谱5．2~4 个相同的；切割位点；识别位点的；平切和交错切；平；具有突出黏睦末端；Mg2+；ATP；SAM 6①能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；②两条互补链的5’ →3’的序列组成相同，即将一条链旋转180°，则两条链重叠7．4～6；GC。8．限制性内切核酸酶的作用；甲基化酶；识别DNA。9．限制性片段长度多态性(RFLP)。

10．属名的第一个字母；种名的前两个字母；株名。11．代表A 或者是T；代表G 或者C。12．混合均匀；防止部分酶切

13．(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积。14．EcoK；EcoRl。15．GGCC；异源同工酶。16．4n。17．1／200

18．酶切速度是不均衡的’。19．限制酶移动；DNA 弯曲。20．50％

二、判断题

1．限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA 的修饰和对自身DNA的限制实现的。

2．限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率。一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍。

3．如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaⅡ和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。

4．能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。

5．限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图。

6．用限制性内切核酸酶HaeⅢ分别切割载体DNA 和供体DNA 后，可用E．coli DNA连接酶进行连接。

7．已知某一内切核酸酶在一环状DNA上有3 个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3 个片段。

8．迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。

9．基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。

10．DNA多态性就是限制性片段长度多态性。

11．用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后，再用外切核酸酶ExoⅢ进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。

12．甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是在酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。

13．具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。

14．从Esherichiacoli K中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK。

15．同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端都是相同的。

16．在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。

17．稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。

判断题答案

1．错误。对外源DNA 的限制，对自身DNA 的修饰。2．正确。3．正确。

4．错误。细菌本身基因组中核酸酶的识别序列因C 或A 残基的甲基化作用而受到保护，可免遭切割。

5．正确。6．错误。限制性内切核酸酶HaeⅢ切割DNA 产生平末端的DNA 片段，E．coliDNA 连接酶不能连接平末端。7．正确。8．错误。9．错误。Ⅱ类限制性内切核酸酶没有甲基化酶的活性。

10．错误。DNA 多态性是指中性突变不低于1％的一种群体，一般是不能检测的。如果这种突变发生在限制性内切核酸酶的识别位点上，就会改变酶切的模式，可以通过电泳检测出来。所以，RFLP 是DNA 多态性的一部分。

11．错误。限制性内切核酸酶PstI 切割DNA 后产生3，突出的黏性末端，而外切核酸酶ExoⅢ只能从突出的5，端降解DNA。

12．正确。13．正确。14．错误。应是EcoK。15．错误。同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端不一定相同。如果识别序列不是完整的回文序列，产生的末端就不相同。

16．错误。限制与修饰是一对保护系统，修饰了就不能被同一系统中的限制性内切核酸酶切割，但是对不同限制—修饰系统中的酶没有作用。17．错误。在某种生物基因组DNA 中切割频率很低的酶称为稀有酶。

三、选择题(单选)

1．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当。

(a)由作用于同一DNA 序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统

10．因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )

(a) J．Lederberg (b) WArber (c) H．Smith (d) FSanger

11．第一个被分离的Ⅱ类酶是：( )

(a)EcoK (b)HindⅢ(c)HindⅡ(d)EcoB

12．双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征：( )

(a)有对称轴(b)两条链的5’→ 3’方向的序列相同(c)是Ⅱ类酶的识别序列(d)可增强基因的表达

13．在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )

(a)反应时间(b)酶量(c)反应体积(d)酶反应的温度

14．在下列试剂中，那一种可以螯合Ca 2＋离子?( ) (a)EDTA (b)柠檬酸钠(c)SDS (d)EGTA ，

15．在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( ) (a)S1 单链核酸酶(b)末端转移酶(c)碱性磷酸酶(d)Bal 31核酸酶16．限制性内切核酸酶可以特异性地识别：( )

(a)双链DNA的特定碱基对(b)双链DNA 的特定碱基序列(c)特定的三联密码(d)以上都正确

17．在下列酶中，催化反应不需要A TP的是( ) (a)EcoK (b)EcoB (c)T4DNA 连接酶(d)BamHl

18．下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( )。(a)Sau3AI (b)E．coRI (c)hindIII (d)Sau 3A1

19．限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )

(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。(b)活性大大提高(c)切割速度大大加快(d)识别序列与原来的完全不同20．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )

(a)甘油含量过高(b)反应体系中含有有机溶剂(c)含有非Mg2＋的二价阳离子(d)酶切反应时酶浓度过低

21．DNA被某种酶切割后，电泳得到的电泳带有些扩散，下列原因中，那一项不太可能?( )

(a)酶失活(b)蛋白质(如BSA)同DNA结合(c)酶切条件不合适(d)有外切核酸酶污染

22．关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的

(a)是限制性内切核酸酶的识别序列(b)是某些蛋白的识别序列(c)是基因的旁侧序列(d)是高度重复序列

23．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当

(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶

(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA 进行修饰(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统

选择题(单选或多选)答案

1．b；2．C；3．b；4．C；5．C；6．b，d；7．c；8．a，e；9．b，c，d，e；10．b；11．c；

12．a，b，c；13．b；14．d；15．d 16．b；17．d；18．d；19．a；20．d；21．a；22．d；23．b

四、简答题

2．说明SangerDNA 测序法的原理。

答：SangerDNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5，端向3，端聚合(DNA 聚合酶参与了细菌修复DNA 合成过程)；(2)可延伸的引物必须能提供游离的3，羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3，羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用 4 种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的序列。

3．在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?机理是什么? 答：目的是保护酶活性，机理是通过提高溶液中蛋白质的浓度，防止酶失活。4．Fredrick 和McClarin等用一个由13 个碱基对的DNA片段与EcoRI、反应，然后分离到酶和DNA 共结晶的复合物，通过X射线分析发现了什么?

答：发现：具有活性的EcoRI是一个二聚体，它们同DNA结合形成一个直径为50A 的球形结构，两个EcoRI位于DNA的两侧。

5．有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用? 答：某些噬菌体的基因组中有修饰的碱基，因此对限制性内切核酸酶具有免疫作用。另一种避免限制酶切割的途径是抑制SAMase的活性，该酶制造S—腺苷甲硫氨酸。某些限制酶作用时需要S—腺苷甲硫氨酸。然而，噬菌体在发育过程中不能同某些单碳的供体反应。

6．某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因? 答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。7．在序列5’—CGAACATA TGGAGT-3’中含有一个6bp 的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?

答：回文序列是：5’-CA TATG-3’

8．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：GAATCG，AAATTT，GATA TC，ACGGCA?为什么?

答：GATATC；AAATUF，因为它们是回文序列。

9．用连接酶将Sau 3AI(,bGATC)切割的DNA与经BamHI(G↓'GATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamHI 切割的机率有多大(用百分比表示)? 答：25％。

10．用Klenow 酶填补的办法可使5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失? BamH I(G↓GATCC)；Taq I(T↓CGA)，BssHⅡ(G↓CGCGC)。

答：BssHⅡ不会。

11．请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8 个碱基的内切酶? 怎样验证?

答：关于这个问题没有明确的答案。这些酶的作用不仅仅限于噬菌体的感染，因为大多数噬菌体并不含有8 个碱基序列的酶切位点，一种可能是8 个碱基的酶是质粒整合后加上去的，作为质粒附加系统的一部分。

12．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?

答：注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。

五、问答题

1．什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modificationsystem，R-Msystem)

答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。

2．细菌的限制—修饰系统有什么意义?

答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA中某些碱基进行甲基化修饰，由于宿主自身DNA上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。由于外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将人侵的外来DNA分子降解掉。所以DNA限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。3．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。

答：限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。基本原则：3—4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号；首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母：取种名的第一个字母，斜体小写；第三字母：(1)取种名的第二个字母，斜体小写；(2)若种名有词头，且已命名过限制酶坝，j 取词头后的第一字母代替。第四字母：若有株名，株名则作为第四字母，是否大小写，根据原来的情况而定，但用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、…等，用正体。8．双酶消化法(doubledigests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。

答：双酶消化法是绘制DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA 分子的基础上，然后再用这两个酶同时或先后消化此DNA，根据它们的结果，构建物理图谱。

10．限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。

当DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA 片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA 多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。

11．计算下列三种酶各自在某染色体 DNA 序列上识别位点间的平均距离：

Alu I ： 5’ AGCT 3’， EcoR I ： 5’ GAATTC 3’ Acy I ： 5’ GPuCGPyC 3’

3’ TCGA 5’ 3’ CTTAGG 5’ 3’ CPyGCPuG 5’

12．在细菌质粒 pBPI 的四环素抗性基因 tet R 的中间有一个 Hind Ⅱ的切点。用 Hind Ⅲ切割果蝇基因组 DNA ，以 pBPl 为载体构建基因组文库。分子杂交证明克隆 15 带有果蝇的目的基因。用 Hind Ⅲ和 EcoRV 对克隆 15 进行了酶切分析，电泳结果如图 15．1(用酶切的 pBPl 质粒 DNA 作对照)，旁边标出了片段的大小。

(1)绘制含有插入片段和不含插入片段时的 pBPl 的限制性图谱，并标明四环素抗性基因的位置； (2)如果用克隆在另一个与 pBPl 完全不同源载体上的四环素抗性基因作为探针进行 Southern 印迹杂交，预测上述电泳图会出现怎样的杂交带

(3)如果用克隆 15 的果蝇 DNA 片段作为探针进行 Southern 印迹杂交，放射自显影的结果又是如何?

答： (1) 酶切图谱示于图 A15.1

图 A15.1 限制性图谱 (2)除 No.2 的2.5kb ，No.6 的1.5kb 和1.0kb 没有带外，其他都有带。 (3) (2)项中没有带的都有带，有带的都没有带。

13．为什么大多数内切酶被称为“限制”酶。

答： 大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶，只在特定的位点(即一段特定的核酸序列或甲基化核苷酸)作用。另外，限制性内切核酸酶主要是用来切割外源片段(例如侵染的噬菌体 DNA)。噬菌体对宿主具有专一性，因为在其他生物中，其 DNA 会成为细胞限制系统攻击的对象。从这种意义上说是内切核酸酶限制了噬菌体的宿主范围。

14．据 Science 杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致 DNA 中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。

答： 这要求基因座已被作图，其目的在于分离基因，测定核苷酸序列以及确定是否碱基替换突变。碱基替换突变可以改变 DNA 修饰酶(例如甲基化酶、限制酶)的识别序列。

15．为了绘制长为 3．0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用 EcoRI 、Hpa Ⅱ、EcoRI+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离 DNA 片段，溴化乙锭染色后观察 DNA 带型(图 15．2)。请根据这些结果，绘制一个限制性图谱，要标明 EcoRI 和 Hpa Ⅱ识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离(kb)。

图15.2 用 EcoRI 、Hpa Ⅱ单独切割及用这两种酶 图 A15．2 3．0kb 的 BamHI 片段的限制性酶谱

混合切割 3.0kb BamH Ⅰ片断产生的 DNA 带 数字表示片段的大小(kb)

答： 图 A15．2是 BamHI 片段的限制性图谱。倒装法绘图是同样有效的，制作这种图谱的一种方法如下：画一条适当长度的线段表示 3.0kb 的BamHI 片段，由于 Hpa Ⅱ只切割一次，Hpa Ⅱ的位点可以明确地定位，从片段的任一端起 1.6kb 处标出其位置。EcoRI 切割片段两次，如果你从片段的任一端起 1.7kb 处确定 EcoRI 位点的位置，你会发现它与 Hpa Ⅱ的距离同那些用双酶消化所得到片段的大小不相符，因此1.7kb 的片段必定位于中间，两个 EcoRI 位点必定离两端各为 0.4 和0.9kb 。

(注： Py 二任何一种嘧啶：Pu 二任何一种嘌吟)

图 15．1 酶切电泳图谱

1～2： Hind Ⅲ切割；3—4：EcoRV 切割；5—6：HindIII+EcoRV ；

1、3、5 是质粒 DNA ；

2、4、6是 15 号克隆。

第三章DNA 和RNA 合成修饰酶

一、填空题

1．连接酶(ligase)是一类用于核酸分子连接形成——键的核酸合成酶，有DNA 连接酶RNA连接酶之分。

2．原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：E．coliDNA连接酶和T4DNA 连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4 噬菌体感染的E．coli 中分离的种单链多肽酶，分子量为——』Oa，由T4 噬菌体基因——编码。E．coli DNA连接是由大肠杆菌基因一编码，也是一条多肽链的单体，分子量为kDa。这两DNA 连接酶有两个重要的差异：第一是它们在催化反应中所用的能量来源不同，TDNA连接酶用，而E．coli DNA连接酶则用作为能源。第是它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下只有T4DNA连接酶能够连接平末端E．coliDNA连接酶则不能。即使是调整反应条件，E．coli DNA连接酶催化平末端连接效率也只有T4 DNA连接酶的。

3．DNA连接酶的单位通常用Weiss 单位表示，一个Weiss单位是：。

4．DNA聚合酶I是在1965 年从大肠杆菌细胞中分离的，所以又称为合酶。该酶由大肠杆菌基因编码，是一种单链球蛋白，分子量为109kDa，酶蛋白中含有一个Zn 原子。

5．T4 DNA 聚合酶与Klenow酶一样，具有5’→ 3’，聚合酶和3’→ 5’外切酶两种性，但是它的3’→ 5’外切酶的活性比Klenow酶强

倍。该酶的3’→ 5’外切活性既能作用于单链DNA 也能作用于双链DNA，不过作用于的活性要强于链。6．反向转录酶(reverse transcriptase)是由kDa 和kDa 两个单位组成的二聚体，作用时以RNA为模板合成DNA。7．从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将，同时释放出离的无机磷。催化反应时不需，但需要引物，单链DNA是最好的引物单链DNA 受体的长度最短需有个dNTP。具有3，突出末端的双链DNA是较好的反应底物。二价离子和DNA末端状态对催化反应影响较大，但是用

为辅助离子，可以催化任何形式的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的3’端效率较高。以Mn2＋／Mg 2+ 作为辅助因子，只能在单链DNA或双链DNA3’突出端加尾。

8．S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含金属蛋白，分子量为32kDa，是一种耐热的酶(37—65％)。9．在S1 保护实验中，S1 切割的温度有两种：20℃和45℃，这是因为：在20℃时，；在45~C 时，。10．技术可以用来鉴定DNA分子中与DNA结合蛋白相互作用的特定序列。

11．真核生物有两种DNA 连接酶，连接酶I 主要是参与，而连接酶Ⅱ则参与。

12．T4RNA连接酶是1972年发现的，并于1977年纯化。该酶是由T4噬菌体基因编码，作用是不需要模板。它在体内的作用是参与T4 噬菌体，它不参与DNA合成的连接，但在中可能有作用。

13．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用切割DNA聚合酶I得到的分子量76kDa 的大片段，具有两种酶活性：

(1) ；(2) 的活性。

14．反向转录酶除具有以DNA 和RNA为模板合成DNA 的5’→ 3’合成酶的活性外，还具有4 种酶的活性：

(1) ；(2) ；(3) ；(4) 。

15．RNA连接酶作用时除了需要A TP和Mg2＋外，还需要。

16．DNA聚合酶I是一种单体酶，分子量为109kDa，它含有金属离子。

17．为了防止DNA的自身环化，可用——脱去双链DNA 。

18．T4 单核苷酸激酶进行DNA片段的5’端标记时，主要是通过两种反应即和。

19．CIP催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是37℃，适用于端脱磷酸；另一种是56℃，适用于端脱磷酸。

20．λ外切核酸酶可从双链DNA 的5’端依次切下5’单核苷酸，但对不同末端的底物来说，作用效率不同，最高，最低。21．EGTA是离子螯合剂。

22．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有酶的活性，而没有酶的活性。

23．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用的和的作用。

24．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA 分子转变成平末端的双链形式，通常可采用或。25．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有的作用，可以将DNA/RNA杂种双链中的水解掉。

一、填空题

1．磷酸二酯。2，68；30；51；74；A TP；NAD；1／100。3．在37℃下20分钟内催化焦磷酸交换1nmol 32p到ATP 所需要的酶量4．A．Komberg；Komberg；polyA。5．200；单；双。6．62；94。7．脱氧单核苷酸添加到DNA的3’—OH端；模板；3；C02+

8．锌。9．S1核酸酶只切割DNA-RNA双链中的环出结构；S1核酸酶不仅切割环出部分，也能切割与环出的相对链

10．DNA足迹。11．DNA的复制；DNA的修复。12．63；尾丝的装配；tRNA 的修复

13．枯草杆菌蛋白酶；(1)5’→ 3’合成酶的活性；(2)3’→5’外切核酸酶

14．(1)5’→3’外切核酸酶活性；(2)3’→5’外切核酸酶活性；(3)DNA 内切核酸酶的活性(Mn2+，切割SC DNA)；(4)解旋酶的活性15．-SH。16．Zn。17．碱性磷酸酶；5’端的磷酸基团。18．交换反应；向前反应。19．5’突出端；平末端和突出的3’端

20．5’突出末端；3’突出末端。21．Ca2+。22．5’→3’合成；3’→5’外切。

23．DNA 聚合酶I：5’→3’外切核酸酶：5’→3’合成酶。24．S1 核酸酶切割；DNA 聚合酶补平。25．核酸水解酶H；RNA。

二、判断题

1．T4DNA连接酶和E．coli 连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。

2．T4DNA连接酶和E．coli 连接酶都能催化双链DNA和单链DNA的连接。

3．反转录酶能够以单链RNA或单链DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。以RNA 为模板合成的DNA 是互补

DNA(complementary DNA，cDNA)。若是以DNA模板合成DNA，dNTP 的掺人速度很低(约5个核苷酸／秒)，比T7DNA聚合酶的合成速度差不多低100 倍。

4．以RNA为模板，，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远低于外加寡核苷酸引物引导的合成。

5．Bal31核酸酶(Bal31nuclease)是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA便可抑制它的活性。

6．λ外切核酸酶不能在双链DNA 的gap 和nick 处切割DNA。

7．当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带(与对照相比)，这就是DNA足迹法。

8．T4DNA连接酶和E．coli 连接酶作用时都需要A TP和NAD+作为辅助因子。

9．多核苷酸激酶之所以能够用于DNA片段的标记，是因为它能够将单个的32 P标记的单核苷酸加到每一DNA链的5’端。

10．在反转录过程中，使用AMV比使用M-MLV可得到较多的产物。

11．真核生物可能有两种DNA连接酶，连接酶I和连接酶Ⅱ都能在DNA合成和连接中起作用。

12．DNA 聚合酶I 有三种酶活性，其中3’→ 5’ 外切核酸酶的活性在较多的dNTP 存在下，常被5’→ 3’合成酶的活性所掩盖。

13．用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP将它们脱磷酸。

14．λ外切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物。

15．用外切酶Ⅲ作系列缺失突变时，可以从突出的3’端开始。

16．nick和gap 的含义是不同的，前者指DNA的单链中有较小的缺失，后者仅是断开了一个磷酸二酯键。

判断题答案：

1．错误。E．coli 连接酶不能催化平末端连接。2．错误。都不能催化单链DNA 的连接。3．正确。4．正确。

5．错误。加入EGTA 可抑制活性，因为EGTA 是Ca2+螯合剂。6．正确。7．正确。8．错误。前者需要A TP，后者需要NAD+。9．错误。将A TP 上的32p 加到5’端。

10．错误。使用M-MLV 反转录酶比使用AMV 反转录酶得到较多的产物。原因是AMV 反转录酶的RNase H 的活性较M-MLV 反转录酶高，所以在以mRNA为模板的反转录过程中，使用AMV 反转录酶，模板被降解得快，所以得到的产物较少。

11．错误。DNA 连接酶I 主要是参与DNA 的复制，而DNA 连接酶Ⅱ则是参与DNA 的修复。

12．正确。13．错误。载体和外源DNA 不能同时脱磷酸，一般将载体DNA 脱磷酸。14．正确。

15．错误。不可以从突出的3’端开始，只能从突出的5’端开始。

16．错误。正好相反，nick 是断开了一个磷酸二酯键，gap 指DNA 的单链中有较小的缺失。

三、选择题(单选或多选)

1．T4DNA连接酶是从T4 噬菌体感染的E．coli 中分离的，这种连接酶( )

(a)催化连接反应时既能以ATP又能以NAD 作为能量来源(b)既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接

(c)是一种单肽酶，分子量为74kDa (d)既能催化单链DNA连接又能催化双链DNA连接

2．DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA 复制、修复中封闭缺口，( )

(a)将双链DNA分子中的5，磷酸基团同3，-OH末端重新形成磷酸二酯键(b)作用时不消耗能量

(c)需要Mn2+等二价辅助离子(d)也可以连接RNA分子

3．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )

(a)T4DNA聚合酶(b)Klenow酶(c)大肠杆菌DNA聚合酶I (d)T7DNA 聚合酶

4．末端转移酶是合成酶类，( )

(a)作用时不需要模板(b)在C02＋的存在下，可以在突出的3’末端延长DNA链

(c)在C0 2＋的存在下，可以在隐蔽的3，末端延长DNA链(d)上述说法有两种是正确的

5．在以下关于噬菌体SP6RNA聚合酶特性的描述中，( )是不正确的。

(a)能够特异性识别SP6 启动子(b)可能在DNA模板的切口(nick)处停止(c)具有核酸酶活性(d)用于体外标记RNA探针。

6．在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )

(a)防止DNA的自身环化(b)同多核苷酸激酶一起进行DNA的5，末端标记(c)制备突出的3，末端(d)上述说法都正确7．从E．coli 中分离的连接酶：( )

(a)需要A TP作辅助因子(b)需要NAD作辅助因子(c)可以进行平末端和黏性末端连接(d)作用时不需要模板

8．下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性(a)λ核酸外切酶(b)外切酶Ⅲ(c)单核苷酸激酶(d)碱性磷酸酶

9．下列哪一种酶作用时需要引物? ( ) (a)限制酶(b)末端转移酶(c)反转录酶(d)DNA连接酶

10．EDTA 是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的影响

(a)外切酶Ⅲ(b)EcoRI (c)Bal31 核酸酶(d)PstⅠ

11．S1 核酸酶的功能是( ) (a)切割双链的DNA (b)切割单链的RNA (c)切割发夹环(d)以上有两项是正确的12．Klenow 酶与DNA 聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。(a) 5’→ 3’合成酶(b) 3’→ 5’外切酶(c) 5’→ 3’外切酶(d) 转移酶13．用Bal31 核酸酶作系列缺失突变时，( ) (a)缺失从一端开始(b)需要Mg 2＋作辅助因子(c)需要Ca2＋作辅助因子(d)以上有两项是正确的14．在cDNA 技术中，所形成的发夹环可用( )

(a)限制性内切核酸酶切除(b)用3’外切核酸酶切除(c)用S1核酸酶切除(d)用5’外切核酸酶切除

15．λ外切核酸酶：( )

(a)作用时不需要模板(b)可以从3’末端降解DNA (c)可以从nick 部位降解DNA (d)可以从gap 部位降解DNA

16．T4RNA连接酶：( ) (a)作用时不需要模板(b)作用时需要模板(c)是1972 年发现的(d)是1967 年发现的17．下列DNA不是λ外切核酸酶作用底物的是( )

(a)具有3’突出端的双链DNA b)具有5’突出端的双链DNA (c)切口DNA (d)平末端DNA

18．可以在切口部位起作用的酶是( ) (a) S1核酸酶(b)外切酶Ⅲ(c) λ外切核酸酶(d)Bal31核酸酶

择题(单选或多选)答案：

1．b；2．a；3．d；4．C；5．C；6．a，b；7．b；8．a；9．C；10．c；

11．d；12．c；13．c；14．c；15．a；16．a，c；17．C；18．a

四、简答题

1．按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA 克隆到表达载体所用到的酶。

答：(1) 反转录酶以mRNA 为模板复制出单链cDNA；

(2) DNA 聚合酶以单链cDNA为模板合成双链DNA；

(3) S1 核酸酶切割双链DNA形成平末端；

(4) 用限制性内切核酸酶切割载体；

(5) 用DNA连接酶将cDNA 插入载体中。

2．为什么反转录酶在聚合反应中会出错?

答：由于反转录酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的3’→ 5’外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500 个碱基中可能有一个错配。

3．什么是测序酶(sequenaseTM)?

答：所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3’→ 5’的外切核酸酶活性，只有5’→ 3’聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3~9倍，测序时常用此酶。

4．什么是S1 核酸酶作图? S1 核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。

5．基因工程中，为什么不喜欢用BAP来脱去DNA的5’端的磷酸基团? 因为BAP耐热和耐酚抽提。

6．RNaseA和RNaseH在催化活性和应用上有何不同? RNaseA切单链RNA，RNaseH切DNA-RNA 中的RNA。

7．切口移位标记DNA前，用DNaseI处理DNA时，应注意什么? 应注意Mg2+离子浓度和处理时间及温度。

8．核酸酶与外切核酸酶Ⅲ用于系列缺失突变有什么不同? Bal31 核酸酶是对称缺失，而外切核酸酶Ⅲ是不对称缺失。

五、问答题

2．简述DNA和RNA连接酶的催化反应机制。

答：所有已发现的DNA连接酶以及RNA连接酶在作用过程中都形成两种以共价键相接的中间产物，即：

(1)酶与AMP的络合物(E-A)；(2)底物与AMP的络合物(DNA-A)。催化反应分三步进行：

①酶—核苷酸中间产物的形成：将NAD或ATP的腺苷酰基团转到连接酶的赖氨酸残基的ε-NH2 上形成酶—核苷酸中间产物，如果辅助因子是NAD’，另一个产物就是NMN，若是用A TP作为辅助因子，另一个产物就是PPi；

②腺苷酰基团被转移到DNA末端的5’-P，将DNA缺口的5’端激活；

③DNA缺口的3’-OH同激活的5’-P 形成磷酸二酯键，释放出AMP。

3．影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?

答：黏性末端链通常以12℃～15℃最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10～100倍。DNA中有残存的tRNA 不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl 的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coli DNA连接酶具有激活作用E．coliDNA 连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4DNA连接酶需要ATP。

4．什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?

答：Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5’→ 3’聚合酶和3’→ 5’外切核酸酶的活性，小片段具有5’→ 3’外切核酸酶活性。Klenow酶主要有下列用途：

(1)修复反应，制备平末端(2)标记DNA3’突出末端(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。

5．如何利用T4DNA聚合酶制备3’隐含末端或双链平末端?

答：T4DNA聚合酶具有5’→ 3’聚合酶和3’→ 5’外切核酸酶两种活性，在无dNTP时，该酶只有3’→ 5’外切核酸酶活性；如只有一种dNTP(如只有dA TP)，链的3’端的降解则到出现该碱基(A)为止。这可使降解反应得到控制，产生一定长度的3’隐含末端；当有4 种dNTP(且浓度较高)时，则产生3’平末端的DNA。无论是降解还是合成反应，都是两侧同时进行。

6．如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3，末端标记?

答：首先利用T4 DNA聚合酶的3’→ 5’外切核酸酶的活性在缺乏dNTP的条件下切割双链DNA，产生突出的5’末端，然后加入放射性标记的dNTP,利用T4DNA 聚合酶的5’→ 3’合成酶的活性进行填补合成，得到两端的3’端都是标记的双链DNA 分子。如果被标记的双链DNA中有限制性内切核酸酶的切割位点，则可以得到两段放射性标记的探针。

7．如何利用T4DNA聚合酶制备平末端？

答：可用T4 DNA 聚合酶将任何形式的双链DNA 转变成平末端的双链DNA。虽然Klenow酶能够进行这种反应，但是T4DNA聚合酶是更好的选择，因为T4DNA聚合酶的3’ → 5’外切核酸酶的活性比Klenow 酶强得多，并且在高浓度的dNTP存在时，降解作用即会停止。根据这样一种特性，可以调整反应条件，用T4DNA聚合酶的3’ → 5’外切核酸酶的活性将具有3’突出末端的双链DNA切成平末端；用T4 DNA聚合酶的5’→ 3’合成酶的活性将具有5’突出末端的双链DNA填补成具有平末端的双链DNA。

8．反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV，avian myeloblastosisvirus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV,Moloney murine leukemia virus)，它们之间有什么不同?

答：(1)AMV反转录酶是一个二聚体(α＝62kDa，β＝94kDa)，具有5’→ 3’合成酶和很强的RNase H的活性。M-MLV反转录酶是一条多肽链，分子量为84kDa 具有5’→ 3’合成酶和较弱的RNaseH的活性。当用长的RNA合成互补的cDNA 时，这种较低的RNase H活性很有利。反应开始时，引物与RNA模板形成的杂交体正是RNaseH的底物，故cDNA合成一开始就存在mRNA 模板降解和DNA 合成起始之间的相互竞争。另外，如果反转录酶在合成过程中暂停作用，RNaseH就会在DNA链3’末端附近切割mRNA模板，因此禽酶的高RNase H的活性会影响cDNA 的产量和长度。

(2)在反应温度上，AMV 反转录酶为42℃，M-MLV 则是37℃。鼠酶在42℃下会迅速失活，因此对复制富含二级结构的RNA来说，使用禽酶的效率高于鼠酶。但要注意，禽酶制品中常含有切割DNA的内源核酸酶活性。

(3)反应的最适pH：AMV反转录酶为8.3，M-MLV反转录酶为7.6。两种酶对pH都非常敏感，即使误差为0.2，反应产物也会大大缩短。由于Tris 缓冲液的pH 值随温度而变化，因此在实验中必须校正pH值。

(4)DNA内切核酸酶的活性：在Mn2+存在时，AMV反转录酶能够切割单链DNA，这种活性无专一性位点，对热稳定。而M-MLV反转录酶没有此活性。

9．与E．coliRNA聚合酶相比，细菌噬菌体的SP6RNA聚合酶、T7RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶具有哪些优越性?

答：首先，它们是非常高效的酶，可获得长度为几千个碱基的转录物；

第二是转录速度快，2μg 模板DNA,在30 分钟之内能够合成出60μg 的转录物；

第三是起始转录的启动子序列非常特异，这对于进行链特异的放射性RNA探针的标记非常有利；

第四，目前纯化的T3 和T7RNA 聚合酶是从过量表达的细胞中分离的，价格便宜，比活性高。

10．什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应?

答：多核苷酸激酶能够把A TP的γ-P转移到ssDNA、dsDNA、ssRNA 或dsRNA分子的 5 ’-OH端上。反应的方式有两种：

(1)向前反应(forward reaction)

若DNA的5’端是羟基，激酶直接将A TP的γ-P转移到DNA的5’-OH 末端。

(2)交换反应(exchange reaction)

如果DNA的5’端是P的话，则该反应需分两步走，首先在过量的ADP 存在下，T4多核苷酸激酶将磷酸化的DNA5’末端磷酸转移到ADP 上，然后再从[γ-32p]A TP上将标记的γ—P转移到DNA链上，使其重新磷酸化。

11．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?

答：主要差别是：CIP68℃时失活，而BAP68℃稳定，且耐酚抽提。应用：

(1)dsDNA 的5，端脱磷酸，防止DNA 的自身连接。但是用CIP 处理后，最好将CIP

除去后，再进行连接反应。

(2)DNA 和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。

12．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?

答：λ外切核酸酶是从丸噬菌体感染的E．coli 中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5’单核苷酸，作用底物是双链DNA的5’磷酸末端，不能切割羟基化5’端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200 倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5’末端，以便让末端转移酶加尾。

13．Mn2＋、Mg2＋对DNaseI(deoxyribonucleasel)的活性有什么影响?DNaseI在基因工程中有什么作用?

答：DNaseI是一种内切核酸酶，在Mg 2+存在下，DNaseI随机切割DNA两条链中的任意一条链；当Mn2+代替Mg2+时，DNaseI几乎

是在双链DNA 两条链相对的位置上打开缺口，使双链DNA 断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出1~2 个核苷酸的DNA 片段。DNaseI有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护DNA；(3)除去RNA 制备物中的DNA；(4)体外转录中除去DNA 模板；(5)检测染色体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体M13 载体上进行测序的随机克隆。

14．比较S1-Mapping和Footprinting 在原理上、方法上、应用上海何不同?

S1—作图(S1-mapping)和足迹法(footprintig)在原理上、方法上、应用上的差异列于1：

第四章质粒的分子生物学与质粒载体

一、填空题

1. 基因工程中有3 种主要类型的载体：、、。

2. 由于不同构型的DNA 插入EB 的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA 的泳动速度，OC DNA 泳动速度，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。

3. 质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点开始的。然而，质粒的复制可以是向的、或是向的。在杂种质粒中，每个复制子斑点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下的复制起点可能被关闭。

4. 就克隆一个基因(DNA 片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：、、。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。

5. 如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于群，这是因为它们的所致。

6. 质粒拷贝数是指细胞中。

7. 复制子由三部分组成：(1) (2) (3) 。

8. 酵母的2μm质粒有，可以配对形成哑铃结构。

9. 一个带有质粒的细菌在有EB 的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫。

10. pBR322 是一种改造型的质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来自于，它的氨苄青霉素抗性基因来自于。

11. 粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过恢复该基因的性状。

12. ColEl 质粒复制的起始需要三种酶，即、和。

13. YAC 的最大容载能力是，BAC 载体的最大容载能力是。

14. pSCl01 是一种复制的质粒。

15. 把那些没有可检测表型的质粒称为。

16. 转座子主要由下列部分组成：(1) (2) (3) 。

17. pUCl8 质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。

18. 在基因型的表示中，符号表示；符号△表示。

填空题答案：

1．质粒DNA；病毒DNA；质粒和病毒DNA杂合体。2．最快；最慢。3．单；双；具有低拷贝数

4．复制区：含有复制起点；选择标记：主要是抗性基因；克隆位点：便于外源DNA的插入

5．同一个不亲和；复制机制相同。6．质粒的份数同染色体的比值，即质粒／染色体。7．(1)复制起点；(2)复制IX；(3)复制终点

8．两个599bp的反向重复序列。9．质粒消除(或治愈)。10．pMB 1；pSCl01；pSF2124(R质粒)。11．回复突变

12．RNA聚合酶I；DNA聚合酶I；RNase H。13．1000kb：300kb。14．严紧。15．隐蔽性质粒。

16．(1)反向重复序列；(2)转座酶；(3)标记基因。17．pBR322和M13；pMBl；转座子。18．插入；缺失

二、判断题

1．迄今发现的质粒DNA 都是环状的。

2．线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。

3．有a、b、c 三个质粒，因为a 和b能够共存于一个细胞，a和c 也可共存于同一个细胞，所以b 和c一定能够共存于同一个细胞。

4. 插入元件(1S)也是一种转座元件，它除了有转座酶基因外，还有附加基因。

5. 如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，这两种质粒则属于同一个不亲和群。

6. 一个带有反向重复序列的双链DNA 经变性后，复性时其单链可形成发夹环。

7. 能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。

8．任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法，增加它的拷贝数。

9．只有完整的复制子才能进行独立复制，一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。

10．CsCl-EB 密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB 可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。

11．质粒ColEl 同pSCl01共整合后，得到重组质粒pSCl34，具有两个复制起点，这两个起点在任何细胞中都是可以使用的。

12．pBR322 可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接，无论用哪种方法连接，都可以用同一种酶回收外源片段。

13．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。

14．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。

15．ColEl 是唯一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。

16．某一染色体DNA经内切酶Sal I切割后，产生了若干个具有黏性末端的DNA片段，将这些片段分别在T4 DNA连接酶的作用下自身连接成环，然后导入受体细胞，都可以进行独立地复制。

17．如果细菌的某种表型特征在UV处理下丧失后不再恢复，这种表型有可能是质粒赋予。

18．基因克隆中，低拷贝数的质粒载体是没有用的。

判断题答案：

1．错误。质粒也有线性的，如土壤中能够产生抗生素的链霉菌属的质粒。2．错误。线性质粒携带有编码宿主菌的主要表面蛋白基因。3．错误。a和b能够共存于一个细胞，说明a和b具有不同的复制机制；a和c也可共存于同一个细胞，说明a和c具有不同的复制机制，但是不能说b和c一定能够共存。因为b和c的复制机制有可能是相同的，也有可能是不同的。

4．错误。插入元件除了携带有与转座有关的基因外，不带有其他附加基因。5．错误。只有不同的不亲和群的质粒才能共存于同一个细胞中。6．正确。7．正确。8．错误。并非所有的质粒都能用氯霉素进行扩增，如氯霉素抗性质粒就不能。9．正确。

10．错误。在CsCl-EB密度梯度离心中，EB插入SC DNA的量较少，密度改变也较小，离心后停留在较高部位密度小的地方。

11．错误。一般使用质粒ColEl的复制起点。12．正确。13．正确。14．错误。一般情况下，质粒主要是独立存在。

15．错误。ColEl上没有四环素抗性基因，不能通过抗性筛选。16．错误。只有含有复制子的片段重接后才能复制。17．正确。18．错误。对于那些有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。

三、选择题(单选或多选)

1．线性质粒复制的引物来自于( )

(a)细胞中合成的小分子RNA (b)自身末端的端粒序列(c)外加的寡聚DNA (d)自身断裂的小分子DNA

2．下面关于松弛型质粒(relaxed plasmid)性质的描述中，( )是不正确的

(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数(b)可以在氯霉素作用下进行扩增(c)通常带有抗药性标记(d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子

3．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体

(a)pBR322 (b)pSCl01 (c)pUBll0 (d)pUCl8

5．反向重复序列：( ) (a)可以回折形成发夹结构(b)可以是某些蛋白的结合位点(c)参与转座子的转座(d)以上说法都不对

6．松弛型质粒：( ) (a)在寄主细胞中拷贝数较多(b)可用氯霉素扩增(c)一般没有选择标记(d)上述(a)、(b)两项正确7．ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒：( )

(a)是松弛复制型(b)具有四环素抗性(c)能被氯霉素扩增(d)能产生肠杆菌素

8．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )

(a)OC DNA>SC DNA>L DNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA (c)L DNA>OC DNA>SC DNA (d)SC DNA>OC DNA>L DNA 9．pBR322 是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：( ) (a) ColEl (b)Ri 质粒(c)pSCl01 (d)pUCl8 10．关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( )

(a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞(b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群

(c)如果a、b 两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同(d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，且拷贝数和分子量也相同11．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( )

(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制(b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点

(c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率

12．能够用来克隆32kb 以下大小的外源片段的质粒载体是( ) (a)charomid (b)plasmid (c)cosmid (d)phagemid

13．第一个作为重组DNA载体的质粒是( ) (a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8

选择题(单选或多选)答案：

1．b；2．c；3．b；4．c；5．a；6．d；7．a，c，d；8．b；9．c；10．d；1 l_b；12．a；13．c；14．a,c,d,e

四、简答题

1．YAC 载体具有什么样的功能性DNA'序列?为什么在克隆大片段时，YAC 具有优性？

答：YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

2．列举质粒载体必须具备的4 个基本特性。(1)独立复制；(2)有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。

3．什么叫穿梭载体? 答：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)乙

4．说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。

答：质粒：体外诱变或体内诱变(通过具有限制性作用的宿主)。噬菌体：体外诱变。

7．解释为什么不同的Hfr 菌株具有不同的转移起点和方向?

答：不同Hfr株的F因子整合到细菌染色体中的位点及方向不同;F因子的位置和方向决定了转移起点和方向。

8．怎样从一个E．coli的Hfr 菌株中分离到一个F ' gal＋的菌株?

答：用一个F因子整合在最后被转移的gal+基因附近的Hfr株，F- gal-与Hfr gal+杂交，30分钟后中断，筛选含gal+的接合体。在这种情况下，只有含gal+的接合体才是接收了F’ gal+质粒的菌株，稀有的含F’ gal+质粒的菌株是在Hfr群体中自发产生的。

9．你已经分离了一个新的F’因子，怎样用最简便的方法知道最初的F因子的部分DNA已经被切除，并被一个外源DNA(也就是细菌DNA)所替代?

答：分离F和F’质粒并缓慢加热DNA使解离为单链，将变性的DNA混合，缓慢冷却，使DNA之间退火。有的双链分子是由F因子和F’

因子的DNA单链组成的杂交双链，电镜下可以看见非同源区为单链环(图1)

图1 F和P质粒DNA杂交鉴定非同源区

10．你能用哪一种基因转移的方法确定

(1)E．coli 染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置；(2)一个新分离的突变在基因内的位置。

答：(1)Hfr转化和中断接合；(2)转导。

五、问答题

1. 什么是复制子(replicon)?

答：复制子是能够进行独立复制的一种遗传因子。每一个复制子都含有一个与特定的RNA聚合酶结合的序列和DNA复制起始部位，即开始复制的复制区。另外，复制子也包括一个复制的终止区。一个染色体可以是一个复制子(例如细菌的染色体)，也可以含有多个复制子(如真核生物的染色体)。一个失去了复制起点的DNA不能独立进行复制，但是，当它和另一个复制子连接起来时，就能在后者的带动下进行复制。

2. 什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么?

答：质粒的相容性(compatibility)是指两种质粒是否可以共存于同一个细胞，如果能够共存则叫相容(又叫亲和)，不能共存则称为不相容。从本质上说，能够共存于同一个细胞中的质粒具有不同的复制机制，因而复制时互不于涉，并保持稳定。根据质粒的这一特性将质粒分为若干个不相容群(incompatibility group)。同一个不相容群中的质粒不能共存于同一个细胞，因为它们的复制机制相同，因此凡能共存于同一个细胞中的质粒属于不同的不相容群，因为它们的复制机制不同。

3. 什么是质粒的带动转移?

答：质粒带动转移的转移作用(mobilization)是指由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的迁移过程。带动转移型质粒由于缺少10个以上合成纤毛所需的基因，因此，它们要转移的话，必须使用同一个细胞中由自主转移型质粒形成的纤毛。带动转移型质粒必须含有自主转移型质粒的oriT位点，因为自主转移性质粒的tra基因产物能够作用于任何质粒的oriT位点，可带动转移的质粒也含有一些基因，称为mob基因，这些基因负责DNA的转移，并有一个oriT序列。这些基因位于称为mob的区域，并且与自主转移型质粒的tra基因相类似。产肠杆菌素质粒ColEl、ColE2等就是非接合型质粒的例子。ColEl的分子小(6.6kb)不足以编码全部转移体系所需的基因，因而不能够自身转移，但它具有两个参与带动转移的基因：一个是bom，另一个是mob。

4. 说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。

答：变性定位法(denaturation mapping)是根据环状双链DNA基因组中某些特异性区段比该分子上其他区段对热、碱、酶等变性因子有较高的敏感性，而采用热、碱、酶等变性因子使环状DNA进行变性，结合电子显微镜技术，比较不同复制时间的复制区同变性部位的距离变化，以确定环状双链DNA复制起点和方向的方法。用此法确定λ噬菌体的复制是一个起点、双方向对称复制。限制性内切核酸酶定位法是用限制性内切核酸酶切割质粒DNA，结合电子显微镜技术，比较不同复制时间的复制叉同两端距离的变化，以确定复制的起点和方向。用这种方法确定了ColEl质粒复制是从离EcoRI切点的17％的特异位点开始的，并从起点开始单向复制。

5. ColEl 衍生质粒拷贝数调节的机理是什么?

答：这类质粒的复制主要是通过一种由质粒编码的小分子的RNA，称为RNA I的分子来调节。这种小分子的RNA主要是通过干扰另一种称为RNAⅡ的加工来抑制DNA的复制。质粒DNA复制的引物是由RNAⅡ提供，在复制起始区，RNAⅡ同DNA形成一种RNA-DNA杂种分子，RNAⅡ被RNA内切核酸酶RNase H切除，在3’端形成一个羟基作为DNA聚合酶I催化的复制起始引物。RNAⅡ必需被正确地加工，否则不能作为复制起始的引物。RNA I和RNAⅡ是互补的，它们是由DNA双链的同一区域互补链合成的。正因为互补，这两种RNA就可以配对形成双链的RNA螺旋，这种双链的RNA干扰了RNAⅡ的加工，干扰了复制。用这种机制能够解释ColEl质粒是如何维持它的拷贝数的。因为RNA I是由质粒DNA合成的，当质粒的浓度增高时，同时合成了较多的RNA I。高浓度的RNA I干扰了大多数RNAⅡ的加工，复制受到抑制。当质粒的拷贝数达到每细胞16个时，这种复制的抑制作用几乎是完全的。除了RNA I外，质粒编码的一种蛋白质，叫作Rop蛋白，协助维持拷贝数。这种蛋白形成一个二聚体，可以增强RNA I和RNAⅡ的配对。所以在RNA I的浓度相对低时引物的加工也受到抑制。ColEl 质粒的复制的调节模式得到实验证明，这也是最早发现的反义RNA的调节作用。

8. 引起质粒不相容性的主要原因是什么?

答：质粒不相容性主要是由两方面的因素引起的：(1)由于复制控制而产生的不相容性。复制控制系统不能将它们作为两个质粒来识别，因而只能随机选择进行复制；(2)由于分离引起的不相容性。如果两个质粒具有相同的par功能，这两个质粒有可能是不亲和的。当共存的质粒具有相同的par功能时，在细胞分裂时只有一种能够被分配到子细胞。然而，有时一个子细胞只能得到一种类型的质粒，而另_个细胞得到另外一种类型的质粒，这样得到的子细胞都是丢失了一种质粒的细胞。

9. 由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?

答：(1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移。(2)具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307(ColEl的衍生质粒)在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。

(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。(4)有较小的宿主范围。

11．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColEl 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容?

答：基本内容包括：(1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段，削减载体的分子量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2)加上易于选择或检测的标记。(3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4)加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。(5)安全性改造，限定载体的宿主范围。

14．有人用限制性内切核酸酶EcoRl 分别切割松弛型质粒ColEl 和严紧型质粒pSCl01(各有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒pSCl34，请推测这种质粒有什么特性和用途。

答：由于ColEl不能在缺失DNA聚合酶I的细菌中复制，所以在这种细胞中就使用pSCl01的复制起点。而质粒pSCl01不能在不合成蛋白质的细胞中复制，在这种情况下则使用ColEl的复制起点。一般情况下优先使用ColEl的复制起点。这种质粒由于具有两个复制起点，可以根据需要，选用不同的宿主菌，表达特定的外源基因。

16．YAC 克隆载体常出现哪些问题?

答：(1)YAC有嵌合现象，一个YAC中克隆的DNA片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的5％～50％。由特定的染色体构建的文库，嵌合体占克隆总数的5％～15％。

(2)YAC内部有重组现象，插入的DNA较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一

致，重组很难检出。

(3)YAC还有缺失现象，影响YAC文库的代表性。

(4)YAC结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC和酵母天然染色体分开。

(5)构建好的YAC转化原生质化的酵母菌，转化效率低。

(6)建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大。