果酒酵母发酵及菌种保藏

果酒酵母发酵及菌种保藏

选取1-2种酿酒酵母进行小型酿酒实验，在品尝合格并符合规定的感官及理化指标后，选用常用菌种保藏方法对有价值的菌种进行保藏。

1.实验目的和内容

1）掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。

2）用选育果酒酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程。

3）了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。

4）学习几种常用菌种保藏方法：

斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥保藏方法。

2.实验原理

果酒发酵：

果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。

可用以下反应式来说明：

果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。

果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。

微生物具有容易变异的特性，因此经过分离纯化选育的酿酒酵母要经历长期的保存必须要用实验方法对其保藏，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：

1）传代培养保藏法

又称斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4-6℃冰箱内保存。

2）液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3）载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

4）寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5）冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20至-30℃，-50至-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6）xx保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

3.实验材料和用具

样品：

xx水果及压榨汁。

试剂：

亚硫酸钠、乙醇、无菌水、化学纯液体石蜡、五氧化二磷、脱脂奶粉、10%HCl、干冰、95%乙醇、食盐、无水氯化钙、河沙、瘦黄土(有机物含量少的黄土)或者红土；器皿：

三角烧瓶(250 mL)、无菌试管、无菌吸管(1 mL及5 mL)、无菌滴管、接种环、40目及100目筛子、干燥器、安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精喷灯、滤纸条（

0.5×

1.2 cm）冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器，玻璃涂棒，血细胞计数板，显微镜，紫外线等（15W），磁力搅拌器，台式离心机，震荡混合器等。

4.操作步骤

4.1自选酵母发酵性性能的检测试验：

用选育菌种发酵果酒

4.1.1果酒酿造的工艺流程

鲜果→分选→破碎、除梗→果浆→分离取汁→澄清→清汁→发酵→倒桶→贮酒→过滤→冷处理→调配→过滤→成品

4.1.2工艺简述

1）发酵前的处理

前处理包括水果的选别、破碎、压榨、果汁的澄清，果汁的改良等。

①破碎、除梗：

破碎要求每粒种子破裂，但不能将种子和果梗破碎，否则种子内的油酯、糖苷类物质及果梗内的一些物质会增加酒的苦味。破碎后的果浆立即将果浆与果梗分离，防止果梗中的青草味和苦涩物质溶出。破碎机有双辊压破机、鼓形刮板式破碎机、离心式破碎机、锤片式破碎机等。

②二氧化硫处理：

二氧化硫在果酒中的作用有杀菌、澄清、抗氧化、增酸、使色素和单宁物质溶出、还原作用、使酒的风味变好等。使用二氧化硫有气体二氧化硫及亚硫酸盐，前者可用管道直接通入，后者则需溶于水后加入。发酵基质中二氧化硫浓度为60-100mg/L。此外，尚需考虑下述因素：

原料含糖高时，二氧化硫结合机会增加，用量略增；原料含酸量高时，活性二氧化硫含量高，用量略减；温度高，易被结合且易挥发，用量略减；微生物含量和活性越高、越杂，用量越高；霉变严重，用量增加。

2）果汁的调整

①糖的调整：

酿造酒精含量为10%-12%的酒，果汁的糖度需17-20°Bx。如果糖度达不到要求则需加糖，实际加工中常用蔗糖或浓缩汁。

②酸的调整：

酸可抑制细菌繁殖，使发酵顺利进行；使红葡萄酒颜色鲜明；使酒味清爽，并具有柔软感；与醇生成酯，增加酒的芳香；增加酒的贮藏性和稳定性。干酒易在

0.6%-

0.8%，甜酒

0.8%-1%一般pH大于

3.6或可滴定酸低于

0.65%时应该对果汁加酸。

3）酒精发酵

发酵分主（前）发酵和后发酵，主发酵时，将果汁到入容器内，装入量为容器容积的，然后加入3%-5%的酵母，搅拌均匀，温度控制在20-28℃，发酵时间随酵母的活性和发酵温度而变化，一般约为3-12天。残糖降为

0.4%以下时主发酵结束。然后应进行后发酵，即将酒容器密闭并移至酒窑，在12-28℃下放置1个月左右。发酵结束后要进行澄清，澄清的方法和果汁相同。

4）成品调配

果酒的调配主要有勾兑和调整。勾兑即原酒的选择与适当比例的混合；调整即根据产品质量标准对勾兑酒的某些成分进行调整。勾兑，一般先选一种质量接近标准的原酒作基础原酒，据其缺点选一种或几种另外的酒作勾兑酒，加入一定的比例后进行感官和化学分析，从而确定比例。调整，主要有酒精含量、糖、酸等指标。酒精含量的调整最好用同品种酒精含量高的酒进行调配，也可加蒸馏酒或酒精；甜酒若含糖不足，用同品种的浓缩汁效果最好，也可用砂糖，视产品的质量而定；酸分不足可用柠檬酸。

5）过滤、杀菌、装瓶

过滤有硅藻土过滤、薄板过滤、微孔薄膜过滤等。果酒常用玻璃瓶包装。装瓶时，空瓶用2-4％的碱液在50℃以上温度浸泡后，清洗干净，沥干水后杀菌。果酒可先经巴氏杀菌再进行热装瓶或冷装瓶，含酒精低的果酒，装瓶后还应进行杀菌。

4.1.3发酵性能测定

测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。

还原糖、总糖的测定：

直接滴定法。

总酸的测定：

中和滴定法。

酒度的测定：

蒸馏法。

5.菌种保藏（下列各法可根据实验室具体条件与需要选做）

见实验十二。

6.实验结果分析

1）绘制发酵周期糖度及酒精度变化曲线。

2）对酒样作感官品评，并作理化分析，测定葡萄酒的酒精、残糖、总酸。

7.问题和讨论

1）菌种保藏中，石蜡油的作用是什么？

2）经常使用的细菌菌株，使用那种保藏方法比较好？

3）简述果酒发酵主要影响因素。

附：

总糖和还原糖的测定

（一）──xx试剂比色法

1.实验目的

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用直接滴定法测定还原糖的方法。

2.实验原理

斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O （砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。

3.实验材料和用具

1）试剂

xx甲液：

称取

68.29g硫酸铜（CuSO4?5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。

xx乙液：

称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。

0.25％葡萄糖标准溶液：

准确称取

2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml 容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。

2）器具

电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。

4.操作步骤

1）标定预备试验：

吸取费林溶液

A、B各

5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。

2）标定正式试验：

戏取费林溶液

A、B各

5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和比预备试验少1 mL的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

计算

式中：

F——费林溶液

A、B各5 mL相当于葡萄糖的克数，g；

m——称取葡萄糖的质量，g；

V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

3）葡萄酒样品还原糖测定：

准确吸取一定量的样品（V1）于100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为

0.2～

0.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液

A、B各

5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为

0.2-

0.4g），加热至沸，并保持2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式

（4）计算。

4）葡萄酒样品总糖测定：

准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为

0.2～

0.4 g，加5 mL盐酸溶液，加水至20 mL，摇匀。于68±1℃水浴上水解15 min，取出，冷却。用200 g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）。调温至20℃，加水定容至刻度（V2）。吸取费林溶液

A、B各

5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为

0.2-

0.4g），加热至沸，并保持2min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。

式中：

X——总糖或还原糖的含量，g／L；

F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5 mL相当于葡萄糖的克数，g；

V1——吸取的样品体积，mL；

V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；

V3——消耗试样的体积，mL；

G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；

V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。

所得结果应表示至一位小数。

5.注意事项

1）本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2＋量固定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2＋，得到错误的结果。

2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗

量。4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

5）样品溶液应预测，其目的：

一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（

0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在10ml左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml 左右样液在继续滴定时加入，以保证在1分钟之内完成继续滴定工作，提高测定的准确度。

6）必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。

热原一般采用800W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过

0.1ml。

滴定酸的测定—中和滴定法

1.实验目的和内容

1）采用中和滴定法测定葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。

2）适用于各种类型葡萄酒（果酒）中滴定酸含量的测定。以g/L报告其结果，测定值保留一位小数。

2.实验原理

利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。

3.试剂

酚酞指示剂溶液，10g/L：

称取酚酞

1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。

0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。

氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝

0.1mol/L。

1）配制

将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。

2）标定

称取

0.6g于105～110℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至

0.0001g。溶于50mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。

3）计算

按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：

C＝m/(v1-v2)×

0.2042

式中：

C——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；

m——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；

V——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；

V1——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；

0.2042——与

1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=

1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

4.操作步骤

1）样品的测定

取调温至20℃的样品

2.00-

5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝

0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。

2）空白的测定

吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。

3）结果计算

按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：

式中：

X——样品中滴定酸的含量，g/L;

c——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；

V1——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

V0——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；

V2——吸取样品的体积，mL；

Si——与

1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=

1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。S酒石酸＝

0.075；S苹果酸＝

0.067；S柠檬酸＝

0.064；S草酸＝

0.045酒度的测定

1.实验目的和内容

1）采用酒精计法测定葡萄酒(果酒)中酒精度。

2）适用于各种类型葡萄酒(果酒)中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%(v/v)，保留一位小数。

2.实验原理

以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20℃时乙醇的体积百分数，即酒精度。

3.实验材料

全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。

4.操作步骤

1）用一洁净、干燥的100 mL容量瓶准确量取100 mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温20℃）于500 mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL

2）将试样倒入洁净、干燥的100mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。所得结果表示至一位小数。