病毒载体概述
病毒载体概述
引言
基因导入系统(gene delivery system)就是基因治疗得核心技术,可分为病毒载体系统与非病毒载体系统。本章主要论述用于人类基因治疗得病毒载体系统。
用于基因治疗得病毒载体应具备以下基本条件:
1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒;
2、介导外源基因得转移与表达;
3、对机体不致病。
然而,大多数野生型病毒对机体都具有致病性。因此需要对其进行改造后才能用于人体。原则上,各种类型得病毒都能被改造成病毒载体。但就是由于病毒得多样性及与机体复杂得依存关系,人们至今对许多病毒得生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展得关系等得认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性得载体。近20年来,只有少数几种病毒如反转录病毒(包括HIV病毒)、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒(包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度得应用。
第一节病毒载体产生得原理
病毒载体得产生建立在对病毒得生活周期与分子生物学认识得基础之上。研究病毒载体首先要对病毒得基因组结构与功能有充分得了解,最好能获得病毒基因组全序列信息。病毒基因组可分为编码区与非编码区。编码区基因产生病毒得结构蛋白与非结构蛋白;根据其对病毒感染性复制得影响,又可分为必需基因与非必需基因。非编码区中含有病毒进行复制与包装等功能所必需得顺式作用元件。
各种野生型病毒颗粒都具有一定得包装容量,即对所包装得病毒基因组得长度有一定得限制。一般来说,病毒包装容量不超过自身基因组大小得105～110％。
基因重组技术得发展使病毒载体得产生成为可能。最简单得做法就是,将适当长度得外源DNA插入病毒基因组得非必需区,包装成重组病毒颗粒。比如,本实验室曾将4、5kb得lacZ基因表达盒
(CMV-lacZ-polyA)插入HSV1病毒得UL44(糖蛋白C)基因得XbaI位点中,病毒基因组得其余部分不改变,构建成重组病毒HSV1-lacZ100(吴小兵等,1998)。由于UL44基因产物对于HSV病毒在培养细胞中产毒性感染就是非必需得,因此,该重组病毒可以在细胞中增殖传代。用这种重组病毒感染细胞,能将lacZ基因带入细胞并高效表达。用同样得方法,将AAV-2病毒得rep与cap基因片段(4、3kb)插入HSV1病毒得UL2(编码尿嘧啶DNA糖基化酶)或UL44(编码糖蛋白C)基因中,构建成具有提供重组AAV载体复制与包装所需得全部辅助功能得辅助病毒rHSV-rc(伍志坚等,1999)。
然而,这样得重组病毒作为基因转移载体有许多缺点。首先,许多野生型病毒通过在细胞中产毒性复制而导致细胞裂解死亡;或带有病毒癌基因而使细胞发生转化。因此必须经过改造使其成为复制缺陷性病毒并且删除致癌基因后才能用于基因治疗。其次,插入外源DNA得长度受到很大限制,尤其对于基因组本身较小得病毒如腺病毒伴随病毒(AAV,4、7kb)、反转录病毒(8～10kb)、腺病毒(36kb),如果不去除病毒基因,可供外源DNA插入得容量就十分小。因此,必须删除更多得病毒基因以腾出位置插入较大得外源DNA。为了增加病毒载体插入外源DNA得容量,除了可以删除病毒得非必需基因外,还可以进一步删去部分或全部必需基因,这些必需基因得功能由辅助病毒或包装细胞系反式提供。
病毒载体大体上可分为两种类型:
重组型病毒载体:这类载体就是以完整得病毒基因组为改造对象。一般得步骤就是选择性地删除病毒得某些必需基因尤其就是立早基因或早期基因,或控制其表达;缺失得必需基因得功能由互补细胞反式提供;用外源基因表达单位替代病毒非必需基因区;病毒复制与包装所需得顺式作用元件不变。这类载体一般通过同源重组方法将外源基因表达单位插入病毒基因组中。如在传统得重组腺病毒构建方法中,将外源基因表达盒(exogenous gene expression cassette)插入穿梭质粒(如pXCX2或pFGdX1)得腺病毒同源序列中,与辅助
第二节病毒载体得包装系统
将外源基因包装到病毒壳粒中,就是病毒载体生产得核心技术。一般地,病毒载体得制备包括以下要素: 宿主细胞
虽然现在已有可能对有些病毒载体(如AAV载体)进行体外(无细胞)包装(Zhou XH et al 、1998; Ding L et al、1997),但就是这种包装系统仍然需要细胞提取物,并且包装效率相当低,远远达不到可生产水平。至今为止,病毒载体得包装主要就是在对该病毒敏感得宿主细胞中进行得。宿主细胞不但提供了病毒复制与包装得环境条件,许多细胞成分还直接参与了病毒复制与包装得过程。
病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒
一般地,病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒由细菌质粒携带,组成病毒载体质粒,就是被包装得对象。由于病毒复制方式得不同,有些病毒载体如单纯疱疹病毒扩增子(HSV amplicon)载体在包装时,整个载体质粒都被包装进入病毒颗粒中;而有些病毒载体如反转录病毒、腺病毒伴随病毒载体得质粒骨架部分并不被包装到病毒颗粒中,只有病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因表达盒被包装到病毒颗粒中。
构建重组型病毒载体时,病毒复制与包装所需得顺式作用元件存在于病毒基因组中(病毒基因组可以由具有感染性得病毒颗粒提供,也可以质粒形式提供)。先将外源基因表达盒插入穿梭质粒携带得病毒同源序列中;将重组穿梭质粒转染至细胞中,再用辅助病毒超感染;或将重组穿梭质粒与病毒基因组质粒共转染细胞;重组质粒与病毒基因组在细胞中进行同源重组而产生表达外源基因得重组病毒。重组腺病毒(Graham FL
and Prevec L 1995)与重组单纯疱疹病毒(Pyles RB et al、1997;Kramm CM et al、1997)得传统制备方法都就是采用这种方式。
为了使病毒载体得生产更为方便,病毒复制与包装所必需得顺式作用元件与外源基因得表达盒除了可以用质粒携带以外,也可以用另一种病毒(往往就是辅助病毒)或生产细胞来携带。
辅助元件
包括病毒复制与包装所必需得所有反式作用元件。这些元件一般包括病毒基因转录调控基因、病毒DNA 合成与包装所需得各种酶类得基因、病毒得外壳蛋白基因等。辅助元件得表现形式可以多种多样。常用得形式有:
①辅助质粒(helper plasmid),如用于产生重组腺病毒得质粒JM17,用于重组AAV包装得辅助质粒pAAV/Ad(Rolling F and Samulski J 1995)等;
②辅助病毒(helper virus),如用于HSV 扩增子载体包装得辅助病毒HSV1 tsK株;
③包装细胞系如用于反转录病毒载体包装得PA317细胞。
这些表现形式之间可以相互转化或合并。例如,辅助病毒可以转化为辅助质粒:传统得AAV载体生产系统常用腺病毒作为辅助病毒。研究发现,并非腺病毒得所有基因对AAV病毒得产生都就是必需得,只需要腺病毒E1a, E1b, E2a, E4与VA RNA 5种基因就行了。因此,将这5种基因置于同一个质粒中,构建成得这种新得辅助质粒就完全可以替代原来得辅助病毒(Xiao X et al、1998; Grimm D et al、1998 ),不但提高了包装效率,而且避免了产品中腺病毒污染得问题。
上述几种要素得不同组合,便产生了各种各样得病毒载体包装策略。根据病毒载体生产系统得组成因素得多少,可将其分成以下几种:
单组成因素生产系统(one-ponent system):
所有得组成成分都集中在生产细胞中。经典得反转录病毒生产系统就就是由产病毒细胞(VPC)组成,重组反转录病毒由VPC细胞不断分泌至培养上清中。这种生产系统操作最为简单,但就是往往产量不高或不稳
定。采用这种策略,需要将重组病毒产生所需要得所有元件都稳定地置于生产细胞中。由于许多病毒基因产物本身对细胞有破坏作用或不能在细胞中稳定表达,因此这种策略在许多病毒载体得生产中难以实施。
双组成因素生产系统(two-ponent system)
这种生产系统一般由"一株病毒/一株细胞"组成。典型得例子就是重组腺病毒生产系统。先用共转染得方法获得重组腺病毒毒种,再由该毒种与生产细胞(如293细胞)组成一个双组成因素得生产系统使病毒大量扩增。
多组成因素生产系统(multi-ponent system)
就是由两种以上得组成因素组成得生产系统。传统得AAV载体生产系统就就是由载体质粒,辅助质粒,辅助病毒与生产细胞4种因素组成。这种策略得缺点就是影响因素多,操作复杂,产量不容易稳定,不利于大规模生产。以上各种生产系统也可以相互转化。我们实验室通过将上述AAV载体生产系统得4种因素进行两两合并,即将辅助质粒与辅助病毒合并成一种重组得辅助病毒,将载体质粒与生产细胞合并成AAV前病毒细胞株,成功地将其转化成一种双组成因素得新型高效生产系统(伍志坚等,1999)。
一般来说,发展新得包装策略主要就是为了以下几种目得:
(1) 减少生产系统中得组成因素,简化操作过程;
(2)提高生产效率,降低生产成本;
(3)避免或降低野生型病毒得产生;
(4)避免使用难以与产品病毒分离得辅助病毒。
第三节病毒载体得纯化方法
重组病毒得纯化与基因工程产品得纯化既有许多共性,又有显著得不同之处。病毒可以瞧作就是一个具有特定结构得生物大分子,一般都由位于中心得核酸与包裹于其外得蛋白外壳组成。有些病毒还具有脂质膜与糖蛋白或糖脂。许多分离纯化蛋白质得方法如离心与梯度离心、盐析、柱层析、超滤、透析等方法都可用于病毒得纯化。然而,由于病毒结构得复杂性,纯化时不能采用蛋白质变性与复性得方法,因为一旦病毒蛋白
发生变性,或病毒结构发生破坏,在体外就很难再重建成有感染性得病毒颗粒。因此,在病毒得纯化过程中必须保持病毒得结构不受破坏,并且监测其感染活性。
病毒得纯化一般分为以下几个步骤:
初始物(start material)得收集或制备
根据病毒产生方式得不同而采取不同得方式。对于不导致细胞病变与死亡得病毒如反转录病毒,可不断收集产毒细胞(VPC细胞)得培养上清作为初始物;对于在生产病毒过程中宿主细胞发生病变与死亡得病毒如腺病毒,在病毒产生达到高峰时,收集培养上清,并裂解细胞以释放细胞内得病毒。
培养上清与细胞裂解液都可作为纯化得初始物。在实验室得小规模制备中,往往采用将培养上清与细胞一起反复冻融3～4次得方法制备细胞裂解液作为初始物。对于初始物体积大于500ml得较大规模得制备,则需要考虑采用不同初始物得损益率。如果收集时大部分(90％以上)目标病毒仍存在于细胞中,为了减少操作大体积初始物带来得不便,可以考虑放弃上清中含有得目标病毒,而通过低速离心收集细胞,重悬于较小体积得缓冲液中进行细胞裂解制备细胞裂解液。对于腺病毒与AAV病毒得大规模制备都可以采用这种方式。如果通过延长培养时间可以使大部分得目标病毒释放到培养液中,也可以只收集培养上清而弃去细胞,从而省去反复冻融得步骤。
除了用反复冻融方法裂解细胞外,还可以根据目标病毒得生物学性质采用其它不影响其感染性得方法,如超声法、化学法(如在AAV病毒制备中用脱氧胆酸或氯仿)等。
初始物得浓缩
当初始物体积较大时,要考虑对其进行浓缩后再分离纯化。浓缩时最好同时能获得初步纯化对于效果。在不影响目标病毒得感染性得前提下,可选用盐析、超滤、透析等方法进行浓缩。盐析法不仅可以用来浓缩初始物,同时也能达到一定得分离纯化效果。最常用得盐就是硫酸铵;许多病毒如腺病毒、AAV病毒与单纯疱疹病毒用聚乙二醇/氯化钠系统沉淀可获得很好得效果并且不影响病毒得感染性。
目标病毒得分离纯化
第五节安全性检测
总得来说,病毒载体制剂得安全性检测主要涉及以下几个方面(Aderson RW 1996):
有复制能力得病毒(replication petent virus, RCV)
RCV一般产生于重组病毒生产过程中基因重组事件。由于RCV具有复制能力,在生产过程中一旦出现,就可能呈现优势生长,从而影响载体病毒得产量;另外,含有RCV得制品用于人体内可能导致严重得病毒感染或急性/慢性病毒血症。
RCV就是对用于基因治疗得病毒载体制剂安全性检测得特有项目。检测RCV得方法因不同得病毒载体而异。对于反转录病毒载体,检测有复制能力得反转录病毒(RCR)得方法主要就是PG4 S+L- 分析法;也可采用其它得变通方法。对于腺病毒载体,检测有复制能力得腺病毒(RCA)主要采用空斑分析方法及PCR方法。
辅助病毒
对于生产过程需要辅助病毒参与得病毒载体如AAV病毒载体,由于这些辅助病毒本身具有复制能力并对机体细胞有破坏性,因此检测病毒制剂中得辅助病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒得残存量十分重要。
其它成分得污染
检测指标包括细菌、霉菌、支原体、内毒素等及在纯化过程中所用试剂如氯化铯等得残余量。
第六节病毒载体得发展方向
基因治疗研究得快速发展对基因导入系统提出了越来越高得要求。病毒载体得发展也日新月异,包括对已有病毒载体得不断改进与完善,与越来越多得其它病毒被改造成为新得病毒载体。病毒载体得发展方向可归纳成以下几个方面:
简便、高效得病毒载体包装系统:考虑到包装得高效性与操作得简便性,越来越多得病毒载体生产系统将采用双组成因素系统。这种系统容易用于病毒载体得大规模生产(Liu XL et al、1999; Conway JE et al、1999 )。
无病毒基因得病毒载体(gutless viral vector):去除病毒载体中所有得病毒基因,只保留其复制与包装所必需得顺式作用元件,就是病毒载体得重要发展方向。这种策略可最大限度地扩大载体得容量与减少病毒对细胞得直接毒性与病毒蛋白表达引起得免疫毒性。腺病毒得微载体(mini-Ad)、AAV载体、HSV扩增子载体都就是无病毒基因得病毒载体。这一发展方向需要解决得主要问题就是建立高效、安全(无辅助病毒污染)得包装系统。
可调控表达外源基因得病毒载体:在许多疾病得基因治疗中,实现外源基因得可调控表达十分重要。如糖尿病得基因治疗,外源得胰岛素基因得表达最好能受血糖水平得调控;肾性贫血得基因治疗,EPO基因得表达最好能受血氧含量得调控等。目前所研究得表达调控系统主要包括各种药物诱导得表达"开关"。其中四环素控制系统(Tet-on与Tet-off)就是人工设计得一种基因表达调控模式。这个系统在体外与动物体内实验中都表现出良好得表达调控作用(Fotaki ME et al、1997; Miller N and Whelan J 1997)。然而,由于其中得反
式作用蛋白(tTA或rtTA)就是异种蛋白,在机体内可能引起毒性作用与免疫反应,因此用于人体前还需考虑其安全性与长期有效性。
最近Binley K等(1999)报道了用缺氧反应元件(hypoxia response element ,HRE)腺病毒载体中外源基因得表达。缺氧可激活bHLH/PAS 家族转录因子得表达,它们可结合HRE核心序列上,诱发其下游基因得表达。
自我扩增型载体(self-amplifying vector)(Herweijer H and Wolff JA 1997):目前得基因转移方法基因转移得效率仍相对较低,尤其就是在体内。为了提高外源基因表达总水平,除了提高基因转移效率外,另一种方法就是尽量提高外源DNA在细胞中得表达水平。用自我扩增型得表达载体就是达到此目得得方法之一。这些载体就是以正链RNA病毒Sindbis病毒与Semliki Forest 病毒为基础得。用目得基因代替病毒得外壳蛋白编码序列,导入靶细胞中,病毒得复制蛋白大量复制重组得基因组,mRNA水平得大量增加导致高水平得转导基因表达。自我扩增型载体得表现形式可以就是RNA,DNA与重组病毒。
特异性复制型性病毒载体(specifically replicating vector):指可在某种特性得组织中产毒性复制,而在其它组织中不增殖得病毒载体。这类病毒载体主要用于特异性裂解肿瘤细胞。如腺病毒突变株Onyx-015就是55Kdal E1B基因功能缺失得腺病毒突变株,可以选择性地在p53基因突变得肿瘤细胞中增殖,而在正常组织细胞中不增殖。用这种突变株联合化疗治疗恶性肿瘤II期临床结果令人鼓舞(Kirn D et al、1998),已进入III期临床试验,从此,许多人工改造得腺病毒突变体被用于肿瘤治疗研究中。如将腺病毒E1基因得表达用甲胎蛋白(AFP)启动子控制,使得该病毒只能在甲胎蛋白阳性得肝癌细胞中增殖导致细胞死亡。也可以将这种病毒得基因组分开装在两个互补得缺陷性腺病毒载体上(Alemany R et al、1999),其中一个载体除了腺病毒复制与包装所必需得顺式作用元件外,只含有E1区基因,其中E1A基因得表达受AFP启动子得控制;另一个载体为E1区缺失得重组腺病毒。这两个载体同时感染AFP阳性得肝癌细胞时,病毒可不断增殖而引起细胞死亡;对于AFP阴性得细胞,E1A基因不表达,因而病毒不能增殖。类似得设计在HSV载体系统也有报道。
除了用甲胎蛋白作为反式激活因子外,各种其它组织特异性表达得蛋白与调控序列都可被用来控制病毒得增殖。
嵌合型病毒载体(hybrid viral vector):就是指将不同病毒得基因元件进行组合,形成得重组杂合病毒。如腺病毒与AAV病毒得杂合体病毒,既具有腺病毒得感染性与基因组特性(双链线状DNA),又具有AAV病毒得染色体整合性(Lieber A et al、1999)。各种病毒基因元件组合形成新得杂合载体得报道层出不穷,如单纯疱疹病毒扩增子与AAV病毒杂合载体(Johnston KM et al、1997)、腺病毒与EB病毒复制子杂合载体(Tan BT et al、1999)腺病毒与反转录病毒杂合载体(Caplen NJ et al、1999)等,不一而足。这些杂合载体使重组病毒得特性多样化,以适应不同基因转移目得得需要。
靶向性病毒载体(targeted viral vector):就是指能特异性地结合并感染某种细胞得病毒载体。靶向性病毒载体得产生主要有两种方法。一种方法就是将病毒颗粒与某一靶向分子(Harari OA et al、1999 )或特异性抗体(Bartlett JS et al、1999)偶联;另一种方法就是通过改变病毒外壳蛋白得结构,使其对细胞得亲嗜性发生改变(Reynolds P et al、1999;Krasnykh VN et al、1996 )。
用各种其它病毒构成新型病毒载体:略。
参考文献
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病毒学论文
辽宁大学 病毒学课程综述 设计题目：关于禽流感病毒及其概述姓名：邹虎山 学号：121303111 院系：生命科学院 专业：生物技术（1）班 课程号：1330472 教师：郑方亮 2014年6月5日
关于禽流感病毒及其概述 邹虎山 （辽宁大学生命科学院生物技术1班） 摘要：禽流感是禽流行性感冒的简称，这是一种由甲型流感病毒的一种亚型引起的传染性疾病综合征，被国际兽疫局定为Ａ类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。不仅是鸡，其它一些家禽和野鸟都能感染禽流感。按病原体的类型，禽流感可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。非致病性禽流感不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，发病率和死亡率高，感染的鸡群常常“全军覆没”。最早的禽流感记录在1878年，意大利发生鸡群大量死亡，当时被称为鸡瘟。到1955年，科学家证实其致病病毒为甲型流感病毒。此后，这种疾病更名为禽流感。禽流感被发现100多年来，人类并没有掌握有效的预防和治疗方法，仅能以消毒、隔离、大量宰杀禽畜的方法防止其蔓延。高致病性禽流感暴发的地区，往往蒙受巨大经济损失。 关键词：禽流感；致病性；感染；人流感；免疫 0引言 禽流感病毒（AIV）属甲型流感病毒。流感病毒属于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3个型。其中甲型流感病毒多发于禽类，一些甲型也可感染猪、马、海豹和鲸等各种哺乳动物及人类；乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。感染人的禽流感病毒亚型主要为H5N1、H9N2、H7N7，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。 要预防禽流感病毒，除了要勤洗手，减少接触家禽，食用家禽应当彻底煮熟以外，建议可以适当饮用星群夏桑菊。星群夏桑菊含有“夏枯草、桑叶、菊花”三味优质中药，能提高人体对禽流感病毒的抵抗力，被誉为“中药达菲”；在2009年，独家获得了国家防治流感、禽流感的专利号。 1：病原 禽流感是由A型流感病毒引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽的传染病，同时也是一种人畜共患病、我国将其列为一类动物传染病[1]。鸡、火鸡、鸭和鹌鹑等家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染，发病情况轻重不一，从急性败血性死
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
反病毒技术发展四部曲
击，开始把这些攻击称为APT。2010年，随着震网（Stuxnet）病毒重挫伊朗核进程，APT终于成为了以国家和政经集团为支撑，对特定目标长期持续作业的网络新威胁的统称。 由于APT广泛使用0day漏洞、隐蔽通信、签名仿冒，加之攻击者承担成本能力之强大、攻击意志之坚决，前所未有，其对安全体系的冲击和造成的心理恐慌都到达了空前的程度。这种压力一方面驱动了传统反病毒厂商进行产品和技术的改进，另一方面也驱动了新兴厂商的出现。FireEye倡导了传统网络侧检测设备与沙箱结合的产品形态，其核心价值不仅是可以将可执行对象直接投放到设备附带的虚拟环境中运行，进行行为判定，更重要的是利用这个虚拟环境实现利用不同的解析器、也包括不同的解析器版本打开，以诱发文件格式溢出。这样就可以让0day漏洞在数据向代码转换的过程中被显现出来。而国内瀚海源的星云、安天的追影等都是同类方向的产品。 图1 安天在分析Stuxnet过程中临时搭建的工控沙盘Bit9则引领了企业级终端防护产品基于白名单和安全基线进行重构的浪潮。由于反病毒是一种易于获得的资源，导致其易于进行对抗测试的传统软肋难以改变，因此利用企业网络环境相对单纯的特点，建立一套自定义的白名单则成为一个新的安全选择。当然，如果只有单纯的相关机制只是一种静态执行体的可信，其对溢出、脚本等依然不能有效应对，需要传统的主动防御机制进行补充，在这一点上，无疑传统反病毒厂商更有优势。而在白名单线路上传统企业反病毒的成熟架构、公有云安全知识的积累，也都有独特的优势。因此我们也看到，国内的金山安全、360企业级产品线也纷纷跟进形成解决方案，不仅发布了私有云产品，也将基于沙箱的鉴定器前置。总体来看，无论是网络侧与沙箱结合，还是私有安全云，都反映出在APT的高度定向化以及持续化攻击的压力下，安全解决方案呈现出了能力前置、知识私有的趋势。网络侧的沙箱与传统反病毒的后端自动化行为分析并无本质的差异，而私有安全云亦可看成是厂商安全云的微缩版本。其革命意义不在于技术点，而在于部署位置和安全资产所有者的变化。 结束语 反病毒技术和体系从20世纪80年代后期发展至今，如一道穿越时空的硝烟火线，是信息技术的保卫者和使用者联合与威胁对抗的不屈历史。每当恶意代码展现出新的趋势、威胁和压力时，反病毒工作者都在积极求变，作出应对。虽然魔道之高下，难有公论，但显然作为守方的我们，虽有短暂被动尴尬之时，但从无无计可施之日。在这种持续的对抗中，既形成了反病毒的体系能力和方法，也历练了反病毒团队和从业者的价值取向。 此间的精彩过程显然不止我所描述的四段，只是这些对于我而言参与更多而已。作为一名反病毒老兵，从20世纪90年代分析学习国外反病毒引擎起步，2001年正式开始反病毒引擎的设计工作，完整经历了团队建立网络恶意代码检测能力和驱动后台分析机制成熟的全程，今天亦与同事们依托这些工作积累，投身APT的检测与对抗。虽心力微薄，才华拙劣，依然虔诚前行，值2013岁尾临近，作此总结，希望能带领读者分享我们一直以来的经验与坚持、以及我们对这份正直而有原则之事业的热爱。 文章系根据作者在ISF2013
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腺病毒中文操作手 册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
流行性感冒
第二节流行性感冒 Avian Influenza（AI） 一、流行性感冒 （一）概述 流行性感冒（简称流感），是由流行性感冒病毒（简称流感病毒）引起人和多种动物的一种急性、热性、高度接触性传染病 在人和哺乳动物，此病以发热和伴有急性呼吸道症状为特征，在禽类则表现为急性败血症、呼吸道症状、隐性感染等多种临床症状 发病急骤、传播迅速，感染谱广，呈流行或大流行性 本病分布于世界各地，普遍存在于多种动物和人群之中 历史很久。鸡群—1878，意大利；猪群—1918，美国；马—1955，欧洲；人—1918，美国。有详细记载的人流感共有6次世界大流行，分别是1918（全球2100万人死亡）、1946、1957、1967、1976、1999 危害和损失与FMD相似。1997年以来，流感在全球范围内的流行有泛滥肆虐之势，引起高度警惕 对人具有感染性的亚型及大事件 （二）病原学 1 病原 流感病毒(Influenza virus)，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae) ，RNA病毒，有囊膜 2 分类 主要有A型、B型、C型流感病毒属 A型在禽类、哺乳动物和人群中存在，B、C型流感病毒，主要是人类的病原 造成危害的禽流感病毒主要是A型 3 形态结构 流感病毒粒子呈多型性，多呈球形，还常见椭圆形或长丝状等。A、B型流感病毒的基因组分为8个节段，C型为7个节段 囊膜上有两种密集排列的纤突，即血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA） HA具有凝集红细胞的特性，并可被相应抗体所阻断，HA、HI试验 HA能够与宿主细胞上的特异受体结合，便于病毒侵入细胞 NA主要与病毒成熟后从细胞内通过细胞膜出芽释放或从细胞膜上脱落有关 4 抗原和血清型 表面抗原：HA和NA，糖蛋白，良好的免疫原性，很强的变异性。至今，A型流感病毒HA抗原有16个亚型（H1～H16），NA有9个亚型（N1～N9）。两者可组合形成众多的血清亚型，如H1N1、H1N2、H1N3、H5H2、H7N1、H9N2等 作用：HA诱导的抗体能够中和病毒和抑制病毒血凝活性;NA诱导的抗体可以干扰病毒释放、抑制病毒复制 内部抗原：核蛋白(NP)和膜基质(M)抗原，保守性强。据此可将流感病毒分为A、B、C三型（琼脂扩散试验），其中B型仅感染人，C型感染人很少引起动物发病，A型可对人、猪、马、禽致病 抗原变异：流感病毒基因组具有多个片段，复制时不同片段间很易发生重组和交换。 主要发生在HA和NA抗原上 抗原漂移（antigenic drift）:HA或NA抗原的微小变异，只引起个别氨基酸或抗原位点的变化。只产生新的毒株
流感病毒基础的知识
流感的危害 流行性感冒简称流感，是由流行性感冒病毒引起的呼吸道疾病，具有传染性强、流行面广、潜伏期短、发病率高等特点，在儿童、老人及高危人群中的死亡率很高。有数据表明，每年冬季流感爆发期会使全球人口近10％感染致病。 流感病毒简介 流行性感冒病毒（influenza virus）简称流感病毒，是引起流行性感冒（流感）的病原体，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）。(是与粘液蛋白有特殊亲和性病毒中的1科)粘病毒是指对人或某些动物红细胞表面的黏蛋白有亲和力的病毒。正、副粘病毒的区分以其核酸是否分节段为标准，分节段者为正粘病毒，不分节段者为副粘病毒，正粘病毒科只有流感病毒一个种。 （一）形态与结构 流感病毒具有多形态，一般为球形，也有的呈丝状或杆状，病毒直径为80-120nm。流感病毒的结构主要包括内部的核心、衣壳（核衣壳）和外面的包膜（附图）。 Fig. (1) Schematic representation of the influenza A virus (Reference [22]) 1、核心（core）流感病毒的核酸为分节段、负链单股RNA，称为分节段基因组（segmented genome）。其中甲型和乙型流感病毒的核酸分为8个节段，而丙型流感病毒的分为7个节段。每一基因节段分别编码不同的蛋白，决定流感病毒的遗传特性。第1~6基因节段分别编码RNA多聚酶（RNA polymerase）PB 2、PB1、PA、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、神经氨酸酶（neuraminidase, NA）；第7基因节段编码包膜蛋白，包括内膜基质蛋白（M1）和膜蛋白（M2）；第8节段编码非结构蛋白（nonstructural protein, NS）NS1和NS2。流感病毒各基因节段复制后，组装入子代病毒体中，但在组装过程中极易发生基因重组而导致新病毒株的出现，这是流感病毒容易发生变异而出现大流行的主要原因。 2、衣壳（caspid）核蛋白是流感病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳卷曲包绕在RNA外，并与3种RNA多聚酶（PB1、PB2、PA）一起与RNA节段形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），即螺旋对称的核衣壳。RNA多聚酶PB1、PB2、PA与RNA的转录有关，核蛋白的抗原性稳定，很少发生变异，具有型特异性。 3、包膜（envelop）流感病毒包膜由内向外，可分为内膜基质蛋白（matrix protein, MP）和脂蛋白（lipoprotein，LP）两层。内膜基质蛋白M1，是包围在病毒核心外的一层膜结构，介于核蛋白与脂质双层膜之间，与组成脂质双层膜的类脂紧密结合，在维持病毒形状与完整性上起重要作用，具有型特异性。脂蛋白层是脂质双层膜的结构成分，来源于宿主细胞膜或核膜。基质蛋白M2为镶嵌其中的膜蛋白，形成膜通道，有利于病毒脱壳及血凝素的生成。 流感病毒包膜上镶嵌的两种糖蛋白向外突出形成刺突（spike），一种是血凝素（hemagglutinin，HA），另一种是神经氨酸酶（neuraminidase, NA）。HA的数量是NA的4~5倍。
pAAV-CMV-iRFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CMV--‐iRFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10016 pAAV--‐CMV--‐iRFP pAAV--‐CMV--‐iRFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CMV--‐iRFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CMV 载体大小: 5603 b p 5' 测序引物及序列: pCAX--‐F (CAGCTCCTGGGCAACGTGC) 3' 测序引物及序列: C--‐CMV--‐24 (TATTAGGACAAGGCTGGTGGGCAC) 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红外荧光蛋白iRFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CMV--‐iRFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CMV--‐iRFP载体序列: ORIGIN 1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCGTCG G GCGACCTTT 61 G GTCGCCCGG C CTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT G CGGCCGCAC G CGTGGAGCT A GTTATTAAT A GTAATCAAT T ACGGGGTCA 181 T TAGTTCATA G CCCATATAT G GAGTTCCGC G TTACATAAC T TACGGTAAA T GGCCCGCCT 241 G GCTGACCGC C CAACGACCC C CGCCCATTG A CGTCAATAA T GACGTATGT T CCCATAGTA 301 A CGTCAATAG G GACTTTCCA T TGACGTCAA T GGGTGGAGT A TTTACGGTA A ACTGCCCAC 361 T TGGCAGTAC A TCAAGTGTA T CATATGCCA A GTACGCCCC C TATTGACGT C AATGACGGT 421 A AATGGCCCG C CTGGCATTA T GCCCAGTAC A TGACCTTAT G GGACTTTCC T ACTTGGCAG 481 T ACATCTACG T ATTAGTCAT C GCTATTACC A TGGTGATGC G GTTTTGGCA G TACATCAAT 541 G GGCGTGGAT A GCGGTTTGA C TCACGGGGA T TTCCAAGTC T CCACCCCAT T GACGTCAAT 601 G GGAGTTTGT T TTGCACCAA A ATCAACGGG A CTTTCCAAA A TGTCGTAAC A ACTCCGCCC 661 C ATTGACGCA A ATGGGCGGT A GGCGTGTAC G GTGGGAGGT C TATATAAGC A GAGCTCGTT 721 T AGTGAACCG T CAGATCGCC T GGAGACGCC A TCCACGCTG T TTTGACCTC C ATAGAAGAC 781 A CCGGGACCG A TCCAGCCTC C GCGGATTCG A ATCCCGGCC G GGAACGGTG C ATTGGAACG 841 C GGATTCCCC G TGCCAAGAG T GACGTAAGT A CCGCCTATA G AGTCTATAG G CCCACAAAA 901 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 961 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 1021 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1081 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1141 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1201 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1261 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GAATTGGGA T TCGAACATC G ATTGAATTC 1321 C CCGGGGATC T GCCGCCACC A TGGCGGAAG G ATCCGTCGC C AGGCAGCCT G ACCTCTTGA 1381 C CTGCGACGA T GAGCCGATC C ATATCCCCG G TGCCATCCA A CCGCATGGA C TGCTGCTCG 1441 C CCTCGCCGC C GACATGACG A TCGTTGCCG G CAGCGACAA C CTTCCCGAA C TCACCGGAC 1501 T GGCGATCGG C GCCCTGATC G GCCGCTCTG C GGCCGATGT C TTCGACTCG G AGACGCACA 1561 A CCGTCTGAC G ATCGCCTTG G CCGAGCCCG G GGCGGCCGT C GGAGCACCG A TCACTGTCG 1621 G CTtCACGAT G CGAAAGgAC G CAGGCTTCA T CGGCTCCTG G CATCGCCAT G ATCAGCTCA 1681 T CTtccTCGA G CTCGAGCCT C CCCAGCGGG A CGTCgccga g ccgcaggcg t tcttccgcc 1741 g caCCAACAG C GCCATCCGC C GCCTGCAGG C CGCCGAAAC C TTGGAAAGC G CCTGCGCCG 1801 C CGCGGCGCA A GAGGTGCGG A AGATTACCG G CTTCGATCG G GTGATGATC T ATCGCTTCG 1861 C CTCCGACTT C AGCGGCGAA G TGATCGCAG A GGATCGGTG C GCCGAGGTC G AGTCAAAAC 1921 T AGGCCTGCA C TATCCTGCC T CAACCGTGC C GGCGCAGGC C CGTCGGCTC T ATACCATCA 1981 A CCCGGTACG G ATCATTCCC G ATATCAATT A TCGGCCGGT G CCGGTCACC C CAGACCTCA 2041 A TCCGGTCAC C GGGCGGCCG A TTGATCTTA G CTTCGCCAT C CTGCGCAGC G TCTCGCCCG 2101 T CCATCTGGA A TTCATGCGC A ACATAGGCA T GCACGGCAC G ATGTCGATC T CGATTTTGC 2161 G CGGCGAGCG A CTGTGGGGA T TGATCGTTT G CCATCACCG A ACGCCGTAC T ACGTCGATC 2221 T CGATGGCCG C CAAGCCTGC G AGCTAGTCG C CCAGGTTCT G GCCTGGCAG A TCGGCGTGA 2281 T GGAAGAGTG A GTCGACGCG G CCGCTCGAG C CTAAGCTTG C CTCGAGCAG C GCTGCTCGA 2341 G AGATCTACG G GTGGCATCC C TGTGACCCC T CCCCAGTGC C TCTCCTGGC C CTGGAAGTT
流行性感冒简介
流行性感冒简介 一、什么是流行性感冒？ 流行性感冒简称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。其特点是起病急，传染性强，流行广泛，传播迅速，易引起流行和大流行。 二、流感病源体的特点有哪些？ 流感的病源体是流感病毒，流感病毒在外界的抵抗力弱，在56℃30分钟条件下易被灭活，在室温下传染性很快丧失，100℃1分钟即被灭活，但在0～4℃能存活数周，在-20℃真空干燥条件下可长期保存。对紫外线和化学有毒剂敏感。流感病毒可分甲、乙.丙三型，同型病毒又可分为若干个亚型。甲型病毒易发生变异，常引起流行，乙型病毒变型缓慢，流行比较局限，丙型病毒很少变异，多呈散发，各型之间无交叉免疫。 三、流感的传染源有哪些？ 流感病人是主要的传染源，自潜伏期即有传染性。发病3天内传染性最强，轻型患者在传播上有重要意义。隐性感染者排病毒的数量较少而时间短，故传染意义不大。 四、流感是怎样传播的？ 流感是通过飞沫传播的。当病人咳嗽.喷嚏及大声说话时，病毒随飞沫喷到病人周围空气中，侵入正常人的鼻粘膜而传染，通过尘埃及日常用品的间接接触传播也有可能。 五、流感的易感人群有哪些？ 人群对流感普遍易感，病后免疫时间短，而流感病毒变异性大，但型间无交叉免疫，所以人在一生中可多次患流感。 六、流感的流行特征有哪些？ 本病常突然发生，传播迅速，发病率高，流行时间短，常沿交通线迅速蔓延，先集体后散居，先城市后农村，在几个月内，可遍及世界各地，造成全球性的大流行。本病一年四季均有发生，但以冬春季节多发。 七、流感的临床表现有哪些？ 流感临床上分单纯型流感和肺炎型流感两种，潜伏期1—3天。 1.单纯型流感：起病急、畏寒.发热.头痛、肌肉酸痛.动眼痛.身软无力.恶心.食欲减退，并有轻度呼吸道症状，鼻塞.流涕.喷嚏.咳嗽.干咳.咽痛.咽痒.剧咳时可伴有胸骨后痛，少数患者有胃肠道症状。体温升高时，脉搏.呼吸相应加快，病人呈急性发热面容。发热与临床症状可在1--2日达高峰，3--5日内退热，症状也随之消失，但咳嗽可持续1--2周。 2.肺炎型流感：较少见，易发生于老.幼.弱及原有心肺疾病的患者。起病时与典型流感病人相似，起病24小时后，病情迅速加重，出现高热。烦躁、剧烈咳嗽，痰呈血性，并有呼吸困难及发绀，双肺呼吸音低，布满干.湿罗音，但无肺实变的体征。调线胸片呈双肺弥漫性结节性阴影，近肺门区较多，症状日益加重，多于5--10日内发生呼吸和循环衰竭，病死率较高。 八、流感的诊断依据有哪些？ 诊断流感有以下几点： 1.流行病学资料。该地区是否有流感流行，有否接触史，是否多发季节。 2.临床表现。突发高热、头痛、肌肉酸痛、身软无力.全身中毒症状重而呼吸道症状较轻。 3.实验室检查。血象：白细胞总数正常或减少，肺炎型流感可有白细胞总数与中性粒细胞增高。鼻粘膜细胞检查：下鼻甲鼻粘膜压印片中，可见纤毛柱状上皮细胞堆积，并在细胞浆中
pAAV-CAG-GFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐CAG--‐GFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV--‐CAG--‐GFP pAAV--‐CAG--‐GFP载体基本信息 载体名称: pAAV--‐CAG--‐GFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β--‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p 5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: EGFP 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系 备注: --‐--‐ 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐CAG--‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息
pAAV--‐CAG--‐GFP载体序列: ORIGIN 1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT 61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT 241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA 361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT 421 C CAAGCTGGG C TGTGTGCAC G AACCCCCCG T TCAGCCCGA C CGCTGCGCC T TATCCGGTA 481 A CTATCGTCT T GAGTCCAAC C CGGTAAGAC A CGACTTATC G CCACTGGCA G CAGCCACTG 541 G TAACAGGAT T AGCAGAGCG A GGTATGTAG G CGGTGCTAC A GAGTTCTTG A AGTGGTGGC 601 C TAACTACGG C TACACTAGA A GAACAGTAT T TGGTATCTG C GCTCTGCTG A AGCCAGTTA 661 C CTTCGGAAA A AGAGTTGGT A GCTCTTGAT C CGGCAAACA A ACCACCGCT G GTAGCGGTG 721 G TTTTTTTGT T TGCAAGCAG C AGATTACGC G CAGAAAAAA A GGATCTCAA G AAGATCCTT 781 T GATCTTTTC T ACGGGGTCT G ACGCTCAGT G GAACGAAAA C TCACGTTAA G GGATTTTGG 841 T CATGAGATT A TCAAAAAGG A TCTTCACCT A GATCCTTTT A AATTAAAAA T GAAGTTTTA 901 A ATCAATCTA A AGTATATAT G AGTAAACTT G GTCTGACAG T TACCAATGC T TAATCAGTG 961 A GGCACCTAT C TCAGCGATC T GTCTATTTC G TTCATCCAT A GTTGCCTGA C TCCCCGTCG 1021 T GTAGATAAC T ACGATACGG G AGGGCTTAC C ATCTGGCCC C AGTGCTGCA A TGATACCGC 1081 G AGACCCACG C TCACCGGCT C CAGATTTAT C AGCAATAAA C CAGCCAGCC G GAAGGGCCG 1141 A GCGCAGAAG T GGTCCTGCA A CTTTATCCG C CTCCATCCA G TCTATTAAT T GTTGCCGGG 1201 A AGCTAGAGT A AGTAGTTCG C CAGTTAATA G TTTGCGCAA C GTTGTTGCC A TTGCTACAG 1261 G CATCGTGGT G TCACGCTCG T CGTTTGGTA T GGCTTCATT C AGCTCCGGT T CCCAACGAT 1321 C AAGGCGAGT T ACATGATCC C CCATGTTGT G CAAAAAAGC G GTTAGCTCC T TCGGTCCTC 1381 C GATCGTTGT C AGAAGTAAG T TGGCCGCAG T GTTATCACT C ATGGTTATG G CAGCACTGC 1441 A TAATTCTCT T ACTGTCATG C CATCCGTAA G ATGCTTTTC T GTGACTGGT G AGTACTCAA 1501 C CAAGTCATT C TGAGAATAG T GTATGCGGC G ACCGAGTTG C TCTTGCCCG G CGTCAATAC 1561 G GGATAATAC C GCGCCACAT A GCAGAACTT T AAAAGTGCT C ATCATTGGA A AACGTTCTT 1621 C GGGGCGAAA A CTCTCAAGG A TCTTACCGC T GTTGAGATC C AGTTCGATG T AACCCACTC 1681 G TGCACCCAA C TGATCTTCA G CATCTTTTA C TTTCACCAG C GTTTCTGGG T GAGCAAAAA 1741 C AGGAAGGCA A AATGCCGCA A AAAAGGGAA T AAGGGCGAC A CGGAAATGT T GAATACTCA 1801 T ACTCTTCCT T TTTCAATAT T ATTGAAGCA T TTATCAGGG T TATTGTCTC A TGAGCGGAT 1861 A CATATTTGA A TGTATTTAG A AAAATAAAC A AATAGGGGT T CCGCGCACA T TTCCCCGAA 1921 A AGTGCCACC T AAATTGTAA G CGTTAATAT T TTGTTAAAA T TCGCGTTAA A TTTTTGTTA 1981 A ATCAGCTCA T TTTTTAACC A ATAGGCCGA A ATCGGCAAA A TCCCTTATA A ATCAAAAGA 2041 A TAGACCGAG A TAGGGTTGA G TGTTGTTCC A GTTTGGAAC A AGAGTCCAC T ATTAAAGAA 2101 C GTGGACTCC A ACGTCAAAG G GCGAAAAAC C GTCTATCAG G GCGATGGCC C ACTACGTGA 2161 A CCATCACCC T AATCAAGTT T TTTGGGGTC G AGGTGCCGT A AAGCACTAA A TCGGAACCC 2221 T AAAGGGAGC C CCCGATTTA G AGCTTGACG G GGAAAGCCG G CGAACGTGG C GAGAAAGGA 2281 A GGGAAGAAA G CGAAAGGAG C GGGCGCTAG G GCGCTGGCA A GTGTAGCGG T CACGCTGCG 2341 C GTAACCACC A CACCCGCCG C GCTTAATGC G CCGCTACAG G GCGCGTCCC A TTCGCCATT 2401 C AGGCTGCGC A ACTGTTGGG A AGGGCGATC G GTGCGGGCC T CTTCGCTAT T ACGCCAGCT 2461 G CGCGCTCGC T CGCTCACTG A GGCCGCCCG G GCAAAGCCC G GGCGTCGGG C GACCTTTGG
pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)
pAAV--‐hSyn--‐RFP 编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV--‐hSyn--‐RFP pAAV--‐hSyn--‐RFP载体基本信息： 载体名称: pAAV--‐hSyn--‐RFP 质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点 启动子: human S ynapsin 1 载体大小: 5909 b p 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3' 载体标签: --‐--‐ 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress 克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble 宿主细胞（系）: 神经细胞 备注: pAAV--‐hSyn--‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。 稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 腺病毒 pAAV--‐hSyn--‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：
pAAV--‐hSyn--‐RFP载体序列： ORIGIN 1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC 61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT 181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC 541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA 781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA 841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC 901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA 961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC 1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA 1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC 1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT 1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC 1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA 1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG 1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA 1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC 2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC 2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA 2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA 2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G CATGGCTAC G TAGATAAGT A GCATGGCGG G TTAATCATT A ACTACAAGG 2341 A ACCCCTAGT G ATGGAGTTG G CCACTCCCT C TCTGCGCGC T CGCTCGCTC A CTGAGGCCG 2401 G GCGACCAAA G GTCGCCCGA C GCCCGGGCT T TGCCCGGGC G GCCTCAGTG A GCGAGCGAG 2461 C GCGCAGCTG G CGTAATAGC G AAGAGGCCC G CACCGATCG C CCTTCCCAA C AGTTGCGCA