【小初高学习]2017-2018学年高中生物 第五章 植物的组织培养技术 第一节 植物快速繁殖技术学

第一节植物快速繁殖技术

1．了解植物组织培养的基本原理。

2．掌握植物组织培养的基本技术，进行月季或其他植物的组织培养。

一、植物组织培养

1．基本原理与概念

高度分化的植物细胞所具有的全能性，使我们能够将植株上的小块组织（如一段茎节、一个小芽），在适宜条件下培养成一株完整的植株，这就是植物的组织培养。

2．选材

不同植物的组织，培养的难易程度差别很大。一般说来，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养，如草莓、葡萄、猕猴桃、菊花、秋海棠等。

思考：是否可以选择花粉进行上述植物的快速繁殖？

提示：利用花粉培养出的植株为单倍体植株，有矮小、高度不育等特点

3．意义

可以在较短时间内利用一株植物繁殖出几十万至几百万株幼苗。对濒危植物的保护、名贵花木的大规模生产有积极的意义，如所需空间小，繁殖速度快，条件可控制，不受季节限制，可以进行连续生产。

二、植物组织培养的基本过程

1．获得外植体

在植物组织培养过程中，用于离体培养的植物器官或组织片段称为外植体。从一株植物上可取下大量的外植体进行组织培养，并在短期内大量繁殖植物种苗，实现植物的快速繁殖。

2．脱分化

外植体在培养基中培养一段时间后，会通过细胞分裂形成愈伤组织。其细胞是一种高度液泡化的薄壁细胞，呈无定形状态，排列疏松而无规则，具有很强的分生能力。由高度分化的细胞重新回复到未分化的状态，这一过程称为脱分化。

3．再分化

脱分化形成的愈伤组织，在适当的人工培养基上继续进行培养又可以重新分化成芽、根等器官，进而发育成一棵完整的植株。这一过程称为植物细胞的再分化。

三、植物组织培养的培养基

1．培养基中的激素

培养基中添加的生长素和细胞分裂素，在启动细胞分裂、脱分化和再分化过程中起着重要作用。当同时使用这两类激素时，两者用量的比例会影响植物细胞的发育方向。当该比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；当该比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值适中时，促进愈伤组织的生长，诱导根芽分化。

2．外植体在不同的发育阶段对培养基要求不同，在进行植物快速繁殖时，需要配制“脱分化培养基”“生芽培养基”“生根培养基”。

3．无菌条件对组织培养的成功至关重要。在组织培养过程中，培养基的灭菌要彻底、外植体的消毒要充分、接种时的无菌操作要严格。

此外，pH、温度、光照等外界条件对植物组织培养也很重要。

四、月季的快速繁殖过程

1．配制培养基

配制三种培养基：脱分化培养基——在MS培养基中加入质量浓度为0.1 mg·L－1的6BA 和IAA。生芽培养基——去掉脱分化培养基中的IAA，其余成分不变。生根培养基——无机盐浓度为MS的1/2，其他成分不变，另外添加质量浓度均为0.1 mg·L－1的NAA和IAA。

具体步骤为先将琼脂和蔗糖溶化，再加入其他成分，并用蒸馏水定容，随后调节pH，最后分装、封瓶，高压蒸汽灭菌。

2．外植体消毒

将月季嫩茎用清水洗净，再用体积分数为70%的酒精浸泡5 s，随后放入质量分数为2%的次氯酸钠溶液中浸泡，再在无菌水中清洗3次，漂净消毒液，用无菌滤纸吸干。

3．接种

将已消毒的月季嫩茎切成小段，接种到“脱分化培养基”上。插入时应注意方向，使嫩茎的形态学下端接触培养基，不要倒插。

4．培养

温度控制在18～22 ℃，20天左右就可在茎段基部形成愈伤组织。将其接种到“生芽培养基”上，每天日光灯光照12小时，10天左右可见愈伤组织上长出小芽，继续生长成枝条。长到3 cm左右时，将其切下后插在“生根培养基”上诱导生根，培养7～10天。

5．驯化试管苗

当小苗基部形成根原基时，即可进行驯化移栽。试管苗是在无菌、充分营养供给、适合的光照和温度以及100%相对湿度环境中生长的。刚出瓶的试管苗对外界环境不太适应，要逐步驯化适应，以提高成活率。

将试管苗培养瓶的瓶口敞开一半，在20～25 ℃的遮阴环境中，适应7～14天。若试管苗不萎蔫、有新生长趋势，便可将试管苗取出，小心洗净黏在根上的培养基，植入盛有培养土的花盆中，浇足水分，罩上带孔的塑料薄膜，将花盆放置在20～25 ℃的阴凉处3～5天。

6．移栽

待幼苗长出新叶时，揭去塑料薄膜，再过7～10天，幼苗即可移栽。

1．愈伤组织

愈伤组织是通过细胞分裂形成的，其细胞排列疏松而无规则，是高度液泡化呈无定形状态的薄壁细胞。它容易与根尖、茎尖的分生组织发生混淆。可以通过下表比较根尖分生组织

离体的植物组织和细胞，对营养、环境条件要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。植物的组织培养常用的一种培养基是MS培养基，其主要成分包括以下几个：（1）无机营养

①大量元素：除碳（C）、氢（H）、氧（O）外，还有氮（N）、磷（P）、硫（S）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）等元素。氮常用的是硝态氮（如硝酸钾等）和铵态氮（如硫酸铵等）。在含硝态氮的培养基上生长良好的植物材料，加铵态氮后生长效果更好。在胡萝卜胚状体的分化中，若培养基中仅含硝酸盐则不能分化，只有与铵盐同时存在时才会产生胚状体的分化。

②微量元素：包括铁（Fe）、铜（Cu）、钼（Mo）、锌（Zn）、锰（Mn）、钴（Co）、硼（B）和碘（I）等。在植物组织培养中需用量极微，多了就会引起植物细胞的酶系失活、代谢障碍、蛋白质变性以及组织死亡等毒害现象。培养基中添加10－7～10－5mmol·L－1就可满足需要。

（2）有机营养

①维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C、维生素B1（盐酸硫胺素）、维生素B6（盐酸吡哆素）、维生素H（生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mg·L－1。有的外植体、愈伤组织会合成维生素，可以不添加，但生长早期往往会缺乏。

②氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH）和水

解乳蛋白（LH）等，是重要的有机氮源。

③有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。

④琼脂：是一种从海藻中提取出来的凝胶性物质，作为凝固剂，一般使用浓度为0.6%～1% 。琼脂在植物组织培养中除固化作为培养材料的支持物外，还具有吸附能力，对组织培养是有利的，它能像活性炭一样除去细胞代谢废物。

⑤活性炭：加入活性炭的目的是除去琼脂中的毒物或培养物产生的芳香族的代谢废物。活性炭可防止组织变褐，并刺激胚的生长。

（3）植物生长调节物质

植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。

植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。

通常认为生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成；比值小时则促进芽的形成。低浓度2,4－D有利于胚状体的分化，但妨碍胚状体进一步发育。萘乙酸有利于单子叶植物的分化。吲哚丁酸诱导生根效果最好。故应根据植物的种类和培养部位，选择适宜的生长调节物质的种类和浓度，才能有效地控制器官的分化。常用的生长抑制剂有矮壮素（CCC,2－氯乙基三甲基氯化铵）、B9（N－二甲琥珀酰胺酸）、多效唑（PP333）等，用于种质保存和块茎的诱导。

（4）能源和渗透压

通常植物本身能进行光合作用，产生糖类，不需要从外部供给糖，但在植物组织培养进行异养的状况下，大多不能进行光合作用来合成糖类，因此必须在培养基中添加糖，作为碳素来源和能源物质，同时糖对保持培养基的渗透压（一般需在1.5×105～4.1×105 Pa）也有重要作用。

糖的使用浓度大多在2%～3%，花药培养和胚培养则采用3%～15%的高浓度。使用最普遍的是蔗糖，此外还有葡萄糖和果糖。

题型一细胞的全能性

【例题1】下列实例中能体现细胞全能性的是（）。

①用培养基培养的胡萝卜单个细胞培养成了可育的植株②植物用种子进行繁殖③用烟草组织培养的单个组织培育出了可育的完整植株

A．①② B．①③

C．②③ D．①②③

解析：①和③都属已分化的细胞经过培养形成可育的植株，体现了细胞的全能性。植物用种子繁殖后代，实际上是由一个受精卵，通过细胞的增殖和分化发育成新个体，是由未经分化的细胞（受精卵）发育成新个体的过程，因此不能体现细胞的全能性。

答案：B

题型二植物细胞表达全能性的条件

【例题2】植物细胞表现出全能性的必要条件是（）。

A．给予适宜的营养和外界条件

B．导入其他植物细胞的基因

C．脱离母体后，给予适宜的营养和外界条件

D．将成熟筛管的细胞核移植到去核卵细胞中

解析：在生物体内，细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官，这是基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果。当植物细胞脱离母体后，在一定的营养物质、激素和其他适宜的外界条件的作用下，植物细胞就可以表现出全能性。

答案：C

反思领悟：反思领悟：植物细胞表达全能性的条件：一是离体给予适宜的营养和外界条件；二是有完整的细胞核；三是植物激素。

题型三植物组织培养的过程及影响因素

【例题3】下列关于植物组织培养的说法，错误的是（）。

A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压