HEK293细胞传代操作

HEK293细胞传代基本操作

细胞的生长过程是有一定的规律的，即潜伏期→指数增生期→停滞期。细胞接种后，细胞数量在潜伏期之后呈对数增长模式，在生长3-4天后，细胞数量达到饱和密度，如不及时进行传代，细胞就会停止增殖，进入停滞期。因此，对细胞进行传代是细胞培养实验中最常规的操作。

1. 在从培养箱中取出细胞之前，需要对生物安全柜进行清洁并设置好参数，紫外杀菌30min，风机工作10min后方可使用。

2. 将所需要的所有实验用具准备好，用70%酒精对双手以及操作台上的物品进行表面消毒。

3. 对于HEK293这类悬浮细胞的传代，需先从细胞培养瓶中取出一个小样本

（500-1000ml）进行取样，用细胞计数仪计数。可采用人工或仪器测定细胞数、细胞密度以及细胞活率。常使用台盼蓝、血细胞计数器或自动细胞计数器。

以自动细胞计数器为例，在细胞计数时，使用台盼蓝指示活细胞与死细胞的比例。染色剂使死细胞变蓝，但具有完整膜的健康细胞将不变色。计数细胞的总数和死（蓝色）细胞的数量。

取样过程中，仔细检查培养的细胞是否存在污染或恶化的迹象，即细胞培养液很黄，或浑浊，或有明显的霉菌团。

4. 根据实验需要计算传代所需的细胞用量，建议细胞以0.2-0.4×106 cells/ml的起始密度接种到在37℃水浴预热30min以上的新鲜培养基中。

如果您使用的是复苏的细胞，建议您至少培养两代后再用于其他用途。

5. 加入所需的培养基，轻轻混合细胞，并将溶液移到新鲜的培养瓶中，可根据需要分成多个培养瓶。

需要注意的是传代培养使用的M 293-TI培养基体积大致为容器体积的20%，即100 mL 的培养瓶的用量是15-20 mL 或250 mL 的培养瓶的用量是50-60 mL，这对于保持最佳的气体交换是十分重要的。

6. 吹气操作（如果用的是可以通5% CO2的培养摇床，不用充气操作），用一根管子在生物安全柜中往培养瓶中吹气30s，然后盖上瓶盖。

7. 放置于摇床培养，37℃，5% CO2，转速为110-175 rpm的恒温摇床中进行培养。如果是50ml试管培养，需将摇床转速调到250 rpm左右。

如果细胞培养瓶是带通气塞的瓶子，则直接放在5% CO2的培养箱中培养，如果是不带通气塞的瓶子，则需要适当旋松瓶口，以利于气体交换，保持培养系统中溶氧和二氧化碳需求，3-5天传代一次。

具体的操作可以去搜索“HEK293细胞传代培养”相关的视频。