AKTA蛋白纯化系统操作
AKＴA蛋白纯化系统操作
AKＴA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。AKTＡ系统依据不同的配置,可以分为AKTＡEＸPＬOＲER、?ＡKTA PILOT、AＫＴA ＰURIFIER等多种型号的设备。以下以AKＴA EXPLORER为例简单介绍?AKTA蛋白纯化系统的一般操作。
１、认识AKTA。
AKTA explorer是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。它们是：
FＩG 1、AKTA EＸＰLORER主机
? Pumｐ-900 为双通道高效梯度泵系列。在ＡKTAexｐloｒer１００,流速范围０．01－100mｌ/min，压力高达10 Mpa(泵名为P-90１）。在AＫＴA exｐｌｏｒｅ10,流速范围０.０01－10 mｌ/ｍｉn，压力高达25 Mpａ(泵名为P-903)。
?ＭonitoｒUV-900,同时监控190－700 nｍ范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见(UV－Vis）监测器。（针对部分AKTA PURIＦIER机型,尚有UＰＣ-９00监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。) ? MｏniｔoｒpＨ／C-900，在线电导和pＨ监测的组合监测器。
Fｉg ２、ＡKＴA EXPＬORER硬件模式图
AKTAＥXＰLOＲEＲ系统的主要组成部件可以用模式图表示(Fig2)。组成部件,如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。打开装阀的门可全部看到。柱被挂在装阀的门的外侧。
分离装置由UNICOＲN 软件控制。软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CＵ950进行控制。
2、一般操作
２.1 开机
按位于底部平台前左侧的ON/OFＦ按钮，打开色谱系统,然后打开电脑电源。待仪器自检完毕（CU９50上面的3个指示灯完全点亮并不闪烁）。双击桌面上ＵNＩCORＮ图标，进入操作界面。UNICORN的操作界面分为四个窗口(Fig 3）
Ｆｉg 3、Unicoｒn的操作界面
2.2准备工作溶液和样品
所有的工作溶液和样品必须经过０.45μm的滤膜过滤,样品也可高速离心后取上清备用。当缓冲液中含有有机溶剂(如乙腈、甲醇),需在使用前用低频超声脱气10ｍin。
2.3清洗及管道准备
首先将Ａ泵的进液管道（A１)放入缓冲液或平衡液中，将Ｂ泵的进液管道(Ｂ1)放入高盐溶液中,在systｅm controｌ窗口点击工具栏内的manual，选择pump→pumｐwash ｅxｐlorer，选中Ａ１，B1管道为ON，eｘｅcute。泵清洗将自动结束。(Fiｇ4)
Fｉg 4、AKTA Explｏｒer的泵清洗操作
2.4安装层析柱
在manuaｌ里选择ｐuｍp→floｗratｅ,输入一定的低流速(Ｆig 5）,insert；选择Al ａｒm＆mon→ａｌａrm pｒｅssure，设置higｈalarm（输入填料或层析柱的耐受压力,以较低者为设置值，具体可在填料说明书或层析柱说明书中查到)，insert，exｅｃute（Fig ６) 。待InjectｉｏｎValve的1号位管道流出水后接入柱子的柱头，稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道连上紫外流动池。
Fig5、AKTA Ｅｘplorer的流速设定操作
Fｉg 6、AKＴA Exploｒeｒ的限压设定操作
2.5开始纯化:
1）在柱子平衡好之后(电导，pＨ的数值和变化趋势稳定)即开始上样了。此时应将紫外调零(Fig 7），选择Aｌarm＆mon→autｏｚｅro,exｅctue。
Fig 7、AKTＡExpｌoｒer的紫外调零操作
２）具体上样方式：AKTA系统的上样方式比较灵活，可以根据具体样品的条件进行上样,包括用样品环上样、用系统泵上样、用样品泵上样等,这里以用系统泵上样为例简单介绍上样过程。点击pause，将A1放入样品中，点击countine,待样品上完后，再将A1放入到平衡液中继续清洗柱子。
3)洗脱：上样后用缓冲液尽量将穿透峰洗回基线。在manuaｌ里选择pump→grａ
dient,按照自己的工艺选择taｒgetB（100%）和ｌｅｎgth（10ＣV)(Fiｇ8)。
Fｉg 8、ＡKTA Exｐｌoreｒ的洗脱条件设定操作
４）设定收集:选择Ｆｒac→fractionatｉon＿900，输入每管收集体积,execｔue(Fig 9）。结束固定体积收集选择Fｒａｃ→fｒａｃtｉonａtion_ｓｔop_９０0,exｅctue（Fig 10）。
Ｆig９、ＡKTA Explｏreｒ的组分收集设定操作
Ｆｉg 1０、ＡKTＡEｘplorｅr的组分收集停止设定操作
5)清洗泵及卸下层析柱:
将A１和B1入口放入纯水中,启动pｕmp wash pｕrifｉer功能冲洗A泵和B泵及整个管路。然后再将A1和B1入口放入2０％乙醇中，同样操作将乙醇冲满整个管路保存。再给柱子一个慢流速，设置系统保护压力,然后先拆柱子的下端,正在滴水的时候将堵头拧上，再拆柱子的上端，最后拧上上端的堵头。整个过程中应防止气泡进入。
６)关闭电源：
从软件控制系统的第一个窗口ｕnicｏrn ｍanagｅr点击退出，其他窗口不能单独关闭。然后关闭AＫTA主机电源，关闭电脑电源。
3、程序设定操作
在meｔhoｄｅditｏｒ窗口点击工具栏内的method wｉｚaｒd，弹出窗口界面如Fｉg 11所示，可以分别在main sｅlｅctioｎ、column以及coluｍn ｐｏsition三个下拉菜单中选择所要用到的层析方法、所用到的层析柱的参数以及所安装的层析柱在柱位选择阀的位置，选好之后，点击neｘt按钮进入下一步波长和溶液进口的设定（Ｆig１2),在此可以设定检测的波长，针对AKTAＥXＰＬORＥＲ可以一次选择三个波长共同进行监控，并在此设定A 泵和B泵的溶液进口,设定好之后，点击next，出现如Fig １3所示窗口，可以在此设定对层析柱进行平衡的条件。
Fｉｇ1１Fｉg 12
Fｉg 13Fig１４完成之后，点击neｘt出现Fig14的窗口,在此可以设定上样的条件，可选择的条件包括上样的方式，如上样环上样以及样品泵上样,对上样的体积也要进行设定。如果利用系统泵上样，在此无法进行设置，不过可以利用A泵和Ｂ泵的两个进口在后面的步骤中进行设置。
在上步设置完成之后，点击NＥXT出现如Fｉg １5所示窗口,这里是针对流穿组分收集所进行一些设置，针对安装的不同的收集器,具体内容可能有些差异,这里显示的界面是在安装了Ｆraｃ-950收集器之后所出现的界面，设置完成点击ＮEXT出现如Fig 1６所示的窗口,设置目标组分收集的一些参数，点击ＮEXT,出现如Fig １7所示的窗口,针对具体的洗脱条件可以进行设置。
当全部设置完成之后,点击ｆiniｓh，弹出Ｆｉg １8所示的窗口，可以再一次对所进行的设置进行进一步的修改,完成之后点击按钮，完成程序存盘操作。至此完成洗脱程序的
设定工作，在应用自动洗脱程序时,可在SYＳTEＭCONTRＯL窗口点击文件菜单栏中的FＩLE→Run，在弹出的对话框中选择目标洗脱程序所在的位置并执行,之后会依次弹出一些对话框，主要是再次确认程序的设置条件,并选择洗脱结果文件的保存位置，全部设置完之后，洗脱将自动进行，结果将自动的保存在设定的文件夹中。
Ｆig １５Ｆｉg 16
Ｆｉg 17 Ｆiｇ1８
4、结果的浏览与简单处理
在纯化完成后，Ｕnicorn软件会自动的按照预先的设置保存结果文件，如果没有指定，那么结果文件会保存于一个文件名以manｕaｌN开头的文件中,N为系统依次生成的一个1－１0之间的数字。
对于结果的浏览应在eｖaluaｔion窗口（Fig １9)中进行,打开文件及对文件进行普通编辑的菜单如Ｆig 2０所示。
Fig 19 Evaｌuation窗口
Fig ２０纯化结果普通编辑菜单
这里已经选择了一个纯化文件，打开后，在结果浏览窗口点击鼠标右键，选择proper ｔieｓ，可以弹出如Fｉg ２1所示的操作菜单，可以分别对结果进行编辑，如改变曲线的颜色,设定横轴或纵轴的显示区间，进行文本文件的编辑等等。
Fig 2１
4、AKTA蛋白纯化系统的日常维护
4.1 每天，当实验完成系统使用结束后，应尽可能避免保存于缓冲液中过夜，尤以高盐
浓度洗脱缓冲液为甚！假如,不能避免,则紧记次日尽早用Sｙstem WａshＭetｈod完成以蒸馏水将系统彻底清洗,再予以保存或再更新使用其它缓冲液,再次投入使用进行实验操作。用蒸馏水将余下的缓冲液彻底冲洗出系统，这步骤至关重要。此举不但可以避免缓冲液对系统造成腐蚀机会，甚或因使用高盐浓度缓冲液保存过久造成盐结晶等的堵塞，对系统构成不必要的损害和损耗。
4.2每周更换润洗缓冲液(２0%乙醇）。若发现储液瓶液体增多,就说明泵内部有漏液，需
要更换泵密封圈。若发现液体减少，需要检查润洗管接头，如果没有漏液,则泵膜或密封圈需要更换。
４．3一定要保持实验环境的清洁，以免灰尘造或泄漏的液体等造成仪器光学及电子元件的损坏。
４.4 在长时间不应用系统进行试验的时候,应将系统管路充满２0％的乙醇,并关闭紫外检测器,清洗PH探头，并保存于适当的缓冲液中。