乳酸杆菌的研究进展

乳酸杆菌的研究进展

摘要

乳酸杆菌是一类近年来研究较多的益生素，大量试验结果表明, 乳酸杆菌中的一部分菌种对人和动物的保健和疾病治疗有效果。本文主要介绍了乳酸杆菌的分离与鉴定，菌种的保藏, 代谢产物，生理功能及应用研究，是一种前景广阔的微生态制剂。

乳酸杆菌

乳酸杆菌，是一类能使糖类发酵产生乳酸的细菌，是一群生活在机体内益于宿主健康的微生物。乳酸杆菌存在广泛，其生长温度在20~ 53℃ , 最适温度为30~ 40 ℃；嗜酸性，最适合pH5.5～6.0，在pH3.0～4.5中仍然能生存，在无芽胞杆菌中其耐酸力最强。

乳酸杆菌是一群杆状或球状的革兰氏阳性细菌，不形成芽孢, 触媒阴性,细胞色素缺失,其DNA中G+C含量少于55%。乳酸杆菌绝大多数是厌氧菌或者兼性厌氧的化能营养菌，生长繁殖于厌氧或微好氧、矿物质和有机营养物丰富的微酸性环境中。在污水、发酵生产（如青贮饲料、果酒啤酒、泡菜、酱油、酸奶、干酪）培养物、动物消化道等中乳酸杆菌含量较高。乳酸菌不仅已广泛应用于畜牧业、食品加工业, 随着研究的深入, 也在一些疾病治疗中得以应用, 用于增强患者的免疫、营养、生长刺激等。

乳酸杆菌的分离与鉴定

1 乳酸杆菌的分离

从不同的基质中分离乳酸杆菌时，根据乳酸杆菌所在生长环境的不同以及是否为优势菌可选择不同组分的培养基。主要有以下几种常用的培养基[1]：

（1）MRS 培养基

当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS 培养基对其进行分离。目前

MRS 培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基，常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。

（2）RSMA 培养基

RSMA 培养基是近几年发展起来用于乳酸杆菌分离的一种非选择性培养基，由于该培养基中加入0.05%的钌红染料,其最大优点是可以使不同菌种在其表面生长并形成颜色各异易于鉴别的菌落。通常情况下, 乳酸杆菌在RSMA 培养基上形成黄色菌落, 而嗜热链球菌为紫红色菌落, 肠球菌是白色菌落。因此, 简单培养后不用通过常规染色和镜检就可以将乳酸杆菌与其他细菌鉴别开来。ELLI 等应用RSMA 培养基成功的从人粪便样品中分离出了乳酸杆菌[2]。但由于此培养基的营养成分比较单一，所以不适于从菌群组成复杂的环境中分离乳酸杆菌。（3）番茄汁琼脂培养基

这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基。此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。

（4）其他培养基

某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。APT 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的RogosaSL 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离[3]。Briggs 琼脂培养基和SL 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌的分离[4]。

2 乳酸杆菌的鉴定

2.1 属水平的鉴定[1]

乳酸杆菌属水平的鉴定是乳酸杆菌整体鉴定过程中较为简单且最为基本的步骤，常用的方法是对分纯后的乳酸杆菌培养物进行革兰染色、镜检，选择无分叉的G+杆菌。如果这些无分叉G+杆菌经过培养后，在pH4.5 的条件下能够生长，并且过氧化氢试验、硝酸盐还原试验、联苯胺反应、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验均为阴性，即可鉴定其为乳酸杆菌属。

2.2 种水平的鉴定---生化鉴定

乳酸杆菌种水平的生化试验主要采用糖醇类发酵试验。不同乳酸杆菌对糖的利用

情况不一，以此可作为种水平鉴定的依据。传统的生化鉴定方法是配制各种特异性生化反应管，该方法虽然成本较低，但费时费力，不适于大批量样品的快速鉴定，并且反应管种类较少所以结果的判定受到限制。近年来，法国梅里埃公司研发的APl50CH/CHL 鉴定系统是目前国内外应用最广泛、结果准确可靠的快速生化鉴定系统。缺点是价格昂贵，不适于大规模菌种的鉴定。

2.3 株水平的鉴定[1]

脉冲场凝胶电泳( Pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)法，目前该法被认为是乳酸杆菌分类鉴定的最好方法。有研究表明, 选用两种选择性较好的内切酶就可以完成PFGE对乳酸杆菌的鉴定, 还可以为判断乳酸杆菌基因组大小和基因图谱的建立提供依据[5]。目前各国学者正致力于乳酸杆菌PFGE 标准方法的建立, 并且在鼠李糖乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、植物乳酸杆菌等众多乳酸杆菌株水平的分型鉴定方面取得了良好的分型效果[6],[7]。乳酸杆菌PFGE 鉴定的难点在于内切酶的选择以及电泳条件的优化, 常用的内切酶主要包括ApaI 、NotI、SfiI、AscI、I-CeuI 和SmaI 等。缺点在于PFGE 技术费时费力，但相对于其它方法而言, PFGE 对乳酸杆菌菌株的鉴别比核糖分型技术、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳等更有为效。

由于乳酸杆菌对人体的作用存在菌株的差异，同一种内不同株间其功能和特性各异，因此对于乳酸杆菌种株水平鉴定技术的研究已成为国内外研究的焦点，也是确保含有乳酸杆菌动物食品安全性的重要保障。目前，基因芯片技术发展迅速，并越来越多地应用于微生物的分型和鉴定，在各种核酸分型鉴定技术成熟稳定后，建立乳酸杆菌的基因芯片技术将指日可待。

菌种的保藏

微生物菌种的保藏方法因微生物种类的不同而异, 其中液氮快速冷冻和冷冻干燥二种方法最佳。但对于乳酸杆菌来说, 它和其它的乳酸菌相比, 在进行冷冻和冷冻干燥处理时其存活力会比较低。王亚珍等人通过在培养基中加入不饱和脂肪酸特别是亚油酸的培养基做为保护剂[8]，增加乳酸杆菌对冷冻或冷冻干燥的耐性，经液氮冷冻或冷冻干燥处理后, 保存的菌种存活率提高了十几倍甚至几十倍。

乳酸杆菌主要代谢产物的种类[9]

乳酸杆菌通过发酵碳水化合物，蛋白质，氨基酸，脂类等，能够产生多种不同的代谢产物。主要代谢产物有乳酸，过氧化氢，双乙酰，细菌素，一些生命活性物质，比如胞外多糖、胞外多聚糖、血管紧张素转换酶抑制剂。

1 乳酸

乳酸是乳酸杆菌在糖代谢过程中产生的主要酸性末端产物，它有L、D两种构型，有较强的吸湿性，一般呈糖浆状液体，有腐蚀性，它的钙盐不溶于水。它使肠道的PH下降，促进肠道蠕动，防止病原菌的定植，因此，在治疗肠道功能紊乱，细菌性和霉菌性阴道炎，维持肠道菌群平衡等方面有重要的抑制作用。

2 过氧化氢

嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌等乳酸菌可产生过氧化氢，当乳酸杆菌产生过氧化氢时，超氧化阴离子形成破坏性氢氧游离基（?0H），这一过程引起细胞膜上脂类的氧化，从而增加细胞膜的通透性，这种超氧游离基对细菌的杀伤作用来自于对细胞壁的强氧化作用及对核酸及细胞内蛋白质的破坏作用，乳酸杆菌产生的H202对引起泌尿生殖道的感染的病原菌如加得纳菌、淋球菌、念珠菌等有重要的抵抗作用。

3 双乙酰

双乙酰又称为联乙醛或丁二酮，来a -乙酰乳酸(a-AL)的化学脱竣作用。乳酸杆菌中双乙酰的生成量与稳定性取决于生长培养基、生长温度、pH与是否存在氧气。在乳发酵制品的滋味与香味中，双乙酰被认为是起重要作用的化合物之一，也是奶油、酸奶油、酸奶、酸性稀奶油、乳酪、干酪及其它需要奶油味的非乳产品的一种必需风味物质，它赋予乳制品以独特的芳香和风味，此外，它还能激发对各种致病菌及腐生菌强烈的抗菌作用，对许多革兰氏阴性菌如假单胞菌、大肠杆菌、鼠沙门氏菌等，阳性菌如金黄色酿脓葡萄球菌、结核杆菌，酵母和霉菌都有抑制作用，但是对阴性菌、酵母和霉菌的作用比对阳性菌的作用强。

4 细菌素

细菌素是由某些乳酸杆菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，它是一种天然防腐剂，在体内可被蛋白酶消化,具有高效、无毒、耐酸、耐高温、无残留、无抗药性特点。大部分细菌素基因位于

质粒上，分子量小，含修饰氨基酸，结构复杂，因而被认为是分子遗传、基因工程、蛋白质工程和食品添加剂、化妆品、皮肤保健、抑制病原菌和调节肠道菌群的好材料，非常适用于食品工业。它具有抑制和杀死食品中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，少数细菌素对革兰氏阴性菌有效。目前细菌素作为一种“绿色防腐剂”正日益受到人们的重视。

5 生命活性物质

乳酸杆菌在蛋白质代谢过程中会产生许多生命活件物质，如β-酪酚肽，血管紧张素转化酶抑制剂-ACE，VPP( V al - Pro - Pro) , IPP( Ile- Pro - Pro)和胞外多糖（EPS)等，因此乳酸杆菌具有明显的抗高血压的作用。此外还具有抗肿瘤、免疫调节、镇痛、增加发酵产品的黏度、改善其质构等，如对这些生命活性物质进行提取，加工成微生态制剂并应用于医疗中，与其它药物相比，它具有毒副作用小、安全性高、药效高等特点，因此它将成为医学领域的一项研究热点。

目前对这些有益的代谢产物的研究较少，致使对乳酸杆菌的开发利用有限，主要是对代谢产物的结构、性质、产生的机理、提取方法、影响因素、诱导物的开发、对其它微生物的作用及其机理、筛选生产代谢产物能力强的菌株及其菌株的特性等还有待研究，这些代谢产物还未很好的与食品、医疗和保健等相结合，虽然部分已得到了开发但尚未形成产业化。不过相信乳酸杆菌的代谢产物在国内是大有发展的，乳杆菌的代谢产物将会以其自身的特性和魅力，吸引人们对其进行研究和利用，使之为人类作出更大的贡献。

乳酸杆菌的生理功能

1提高机体免疫力

乳酸杆菌提高免疫力主要表现在两方面: 一是非特异性免疫, 具有早期抗感染作用。主要包括增强黏膜屏障功能、加强巨噬细胞的吞噬能力、刺激细胞产生各种细胞因子来控制炎症反应强度等。如乳酸杆菌能使正常人体内中性粒细胞表面受体CR1、CR3和FcRШ的FcR 表达增多, 提高吞噬能力, 但在过敏者体内乳酸杆菌LGG却能使这些受体减少, 通过降低吞噬能力, 减弱过敏反应[10]。二是刺激特异性免疫应答。如增加黏膜表面和血清中IgA 和IgM、IgG 水平以强化体液免疫, 促进T、B 淋巴细胞的增殖和成熟, 加强细胞免疫。乳酸杆菌能减少

特异性皮炎的发生, 减轻过敏反应程度、调节Th1 /Th2 平衡。此效应是通过菌群基因组DNA 刺激、外周血单核细胞( PB-MCs)诱导产生的, 且与乳酸杆菌进入机体的剂量有关[11] ; 在正常的体液免疫中, 能使机体针对外来抗原的抗体产生增多。但在过敏者体内, 却可抑制机体内针对过敏原的抗体产生, 还可提高B 细胞针对有丝分裂原的增殖能力[12]。

2 拮抗作用

乳酸杆菌对肠道黏膜表面的黏附能力, 是拮抗肠道病原微生物定植及集群生长的先决条件, 并且对免疫调节及促进受损黏膜的修复都很重要。乳酸杆菌主要通过两种方式拮抗微生物, 一是生长过程中分泌抗菌素物质, 来达到抑制致病类型的有害菌和外源病原菌的目的。通过分泌有机酸、过氧化氢、二氧化碳、丁二酮等抑制有害菌的入侵, 纠正肠道菌群失调, 重建健康的生态环境[13]。研究表明, 很多乳酸菌还能产生细菌素。二是与病原菌竞争生存空间[14]。乳酸杆菌一般是肠道菌群中的优势菌种, 数量占绝对优势, 其消耗掉流至肠道后段的有限的营养物质如氨基酸、维生素、矿物质等, 从而抑制病原菌的生长繁殖[15]。

3 提供营养物质

乳酸杆菌能促进重要维生素的生成, 如人体内主要的B族维生素叶酸, 能减少同型半胱氨酸的产生, 对抵抗慢性疾病有重要作用。而该叶酸就是由乳酸乳球菌和植物乳酸杆菌合成的, 同时又被加式乳酸杆菌所消耗, 如此形成一个网络循环[16]。此外, 乳酸杆菌还是重要的植酸酶, 能将不可溶性的营养成分水解为可溶性, 加速肠道对营养素的吸收[17]。

乳酸杆菌的应用

目前, 乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[18 ]。乳酸杆菌另一个在医学领域具有应用潜力的是作为免疫接种的疫苗载[19]。乳酸杆菌是健康妇女阴道正常菌群中优势菌[20]。有实验证明乳酸杆菌有免疫增强作用, 可提高机体巨噬细胞的吞噬功能,对妇女阴道炎的发病有非常重要的生物拮抗作用[ 21,22] 。

1乳酸杆菌对人的影响

1. 1对癌症的治疗作用

人们对食品及药物抗突变、抗癌作用的研究已开展多年。近年, 关于肠道中菌

群的抗癌作用也引起广泛关注。乳酸杆菌能够抑制人体某些肿瘤的发生发展, 其能结合致癌物质随粪便排出, 减少其形成、活化及滞留机会。流行病学调查发现, 长期食用酸奶制品可降低乳腺癌、结直肠癌、胃癌及膀胱癌[23]的发生率。乳酪乳杆菌对乳腺癌MCF7细胞生长有抑制作用[24]; 从人粪便分离的2种乳酸杆菌(HN1和HA8)对骨髓瘤细胞有很强的抑制增殖作用[25]。临床应用中, 乳酸杆菌主要与其他治疗手段相结合,可增强疗效, 降低副作用。

1. 2治疗胃肠道感染

创伤、感染患者机体内大多存在胃肠道过度炎症反应, 严重者可引起脓毒血症和多器官功能衰竭。大量研究显示乳酸杆菌能减轻肠道炎症反应, 降低肠道内毒素血症。HENRIK等[26]对腹内感染大鼠应用添加乳酸杆菌的肠内营养与庆大霉素进行抗感染比较。结果显示: 乳酸杆菌组12 h内毒素血症消失, 庆大霉素组下降86% , 24 h时只有乳酸杆菌起作用, 内毒素血症水平下降47%。此外, 乳酸杆菌还提高了吞噬细胞的吞噬能力。

2 乳酸杆菌对动物的影响

2. 1促进动物生长

乳酸杆菌是猪肠道正常菌群中重要的优势菌之一, 对改善肠道内环境、维持猪体内正常的微生态平衡, 具有十分重要的意义。但韩春艳等[ 27]研究认为,乳酸杆菌对2周龄以上的仔猪没有表现出良好的促生长作用。添加乳酸杆菌可显著提高断奶仔猪胰脏和十二指肠食糜中淀粉酶和脂肪酶的活性, 提高平均日增重和饲粮粗脂肪表观消化率。据此认为, 日粮中添加乳酸杆菌后, 仔猪生长性能的提高与仔猪脂肪酶活性和粗脂肪表观消化率的提高有关。

2. 2预防并治疗腹泻

Redmend1968年报道, 乳酸杆菌经口饲喂仔猪可以减少下痢、改善发育。Muralidhara报道, 给刚出生的仔猪饲喂乳酸杆菌可以减少大肠杆菌数量, 粪便中乳酸杆菌与大肠杆菌的比例达到128：1, 而未饲喂乳酸杆菌组的比例为2：1, 此比例的提高可以保护动物抵抗肠致病性大肠杆菌的侵袭, 预防腹泻。

乳酸杆菌在胃肠道菌群平衡调节中发挥重要作用, 但其发挥作用的详尽作用机理及条件仍需要进一步研究。此外, 乳酸杆菌的代谢产物也具有很大的应用潜能, 目前针对这些有益的代谢产物相关研究较少, 但随着基因工程学的发展, 相信将

会有更多新菌种, 新的活菌制剂、保健产品被研究开发。因此, 乳酸杆菌微生态制剂作为一种优质的环保生态产品, 应用前景广阔。

参考文献

1 董银苹. 乳酸杆菌分离鉴定技术研究进展[ J ]. 卫生研究，2008,37(4) :508-510.

2 ELLIM, CALLEGARI ML, FERRARIS , etal. Survival of yogurt bacteria in the human gut [ J ] . Appl Environ Microbiol, 2006, 72(7) :5113-5117.

3 黄沧海, 谁仕彦, 李德发, 等. 仔猪专用益生乳酸杆菌菌种的分离[ J ] . 饲料工业, 2004, 25(10) : 25-27.

4 刘变芳, 樊明涛, 金丹. 西藏雪莲中乳酸菌的分离鉴定及发酵性能研究[ N ] .

西北农林科技大学学报: 自然科学版, 2004, 32(增刊) :83-86.

5 楼金, 陈洁. 分子生物学技术在肠道正常菌群研究中的应用[ J ] .国外医学: 儿科学分册, 2004, 31(1) : 1-4.

6 V ANCANNEYT M, HUYS G. Intraspecific genotypic characterization of lactobacillus rhamnosus strains int ended for probiot ic use and isolates of human origin [ J ] . Appl Environ Microbiol, 2006, 72( 8) : 5376-5383.

7 RODAS A, FERRER M S, Pardo I. Polyphasic study of wine lactobacillus strains: taxonomic implications [ J ] . Int J Syst Evol Microbiol, 2005, 55: 197-207.

8 王亚珍. 乳酸杆菌的保藏方法[ J ]. 生物技术, 1998, 8 (1) : 41-4 2

9 柴俊,郤翠仙,张以芳. 乳酸杆菌主要代谢产物种类及其特性[ J ].食品工业科技，2007, 28(8)：257-260

10 Pelto L, Isolaur i E, Lilius E M, et a .l Probiotic bacteria down regulate the

milk-induced inflammatory response in milk-hypersensitive subjects but have an immuno-stimulatory effect in healthy subjects[ J ] . C lin Exp Allergy, 1998,28( 12): 1474-1479.

11 Ghadim i D, Folster-Holst R, deVrese M, et a.l Effects of probiotic bacteria and the irgenomic DNA on TH 1 /TH 2-cy-tokine production by peripheral blood mononuclear cells( PBMCs) of healthy and allergic subjects[ J]. Immunobiology, 2008, 213( 8) : 677-692.

12 HoriT, Kiyoshim a J, ShidaK, et a.l Augmentation of cellular immunity and reduction of influenza virus titer in aged Mice-fed Lactobacillus caseistra in Shirota [ J ]. C lin Diagn Lab Immunol ,2002, 9( 1): 105-108.

13 Ne ish A S. M icrobes in gastrointestinal health and disease[ J] . Gastroenterology, 2009, 136( 1) : 65-80.

14 Macfarlane S, Dillon J F. Microbial b io film s in the hum an gastrointestinal

tract[ J]. J ApplM icrobiol 2007, 102( 5):1187-1196.

15 黄沧海. 仔猪复合益生乳酸杆菌制剂及其作用机理的研究[ D]. 北京: 中国农业大学, 2003.

16 Bengmark S. Synbiotics in Human Medcine [M ] // V ersalonicj,Wlsonnm. Therapeutic Microbiology: Probiotics and Related Strategies. Washington D C: ASM Press,2008: 307-321.

17 Famularo G, De Simone C, Pandey V, et a.l Probiotic lac-tobacilli an innovative tool to correct the malabsorption syndrome of vegetarians [ J]. M ed Hypotheses,2005, 65( 6): 1132-1135.

18金礼琴, 孙玲. 微生态制剂的临床合理应用[ J]. 微生物学杂志,2005, 25 ( 6):98 -100.

19 Pouwe ls P H, Lee rR J, Shaw M, e t a.l Lac tic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral-immunization purposes[ J]. Int J FoodMicrobiol ,1998, 41( 2) : 155 -167.

20 任力, 葛凤霞, 袁小林, 等. 乳酸杆菌对小鼠巨噬细胞受体介导内吞及抗肿瘤作用的研究[ J]. 吉林医学院学报, 1999, 19( 1): 19-21.

21马秀英. 阴道乳酸杆菌在细菌性阴道病诊断中的意义[ J]. 临床医药实践杂志, 2004, 13( 2) : 121.

22 徐灵龙, 王知非, 崔林, 等. 乳酸杆菌对大肠埃希菌拮抗作用的研究[ J]. 电子显微学报, 2005, 24( 4) : 401.

23 Ohashi Y, Nakai S, Tsukamo to T, et a.l Habitual in take of lactic acid bacteria and risk reduction of bladder cancer[ J]. U rolInt, 2002, 68( 4) : 273-280.

24 Biffi A, Coradini D, Larsen R, et a .l Anti-proliferative effect of fermented milk on the growth of a hum an breast cancer cell line[ J]. Nutr Cancer, 1997, 28( 1) : 93-99. 25 Zabala A, Martn M R, Haza A I, e t a .l Anti-proliferative effect of two lactic acid bacteria strains of hum an origin on the growth of amyloma cell line[ J]. Lett App lM icrobiol ,2001, 32( 4) : 287-292.

26 ThorlaciusH, NobaekS, Wang X D, et a.l Lactobacilli at tenuate bacteremia and endotoxemia associated with severe intra-abdominal infection [ J]. Surgery, 2003, 134 ( 3 ):467-473.

27 韩春艳, 侯雨文, 刘志伟, 等. 不同日龄添加乳酸杆菌对早期断奶仔猪生长性能的影响[ J]. 畜禽业, 2004( 7):12-13.