WB实验基本步骤

实验基本步骤

提取细胞蛋白

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BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

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蛋白样品变性

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电泳

↓

转膜

↓

封闭

↓

一抗

↓

TBST洗涤

↓

二抗

↓TBST洗涤

↓

显影

↓

结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g

磷酸氢二钠 1.44g

氯化钠 8g

氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2

定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g

甘氨酸 7.2g

400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（1000ul，10ul），1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4℃预冷

1.于-20℃冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液

2.加入1ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃，8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗细胞两次以洗