酶学第五章酶催化动力学基础
第五章 酶催化动力学基础
5.1 引言
酶催化动力学主要是研究各种因素对酶促反应速度的影响、酶促反应的规律及反应历程。影响酶促反应速度的因素包括[S]、[E]、[P]、[I]、[A]、pH 和温度等。本章重点讨论[S]对酶促反应速度的影响，并且介绍一些基本概念，和简单体系的动力学方程的推导。 5.2 反应级数和速度常数 5.2.1 反应级数
化学反应的级数就是动力学方程中影响反应速度的各反应物浓度项上的指数之和。 5.2.1.1 零级反应
反应速度与底物的浓度无关，称为零级反应。当[S]大大高于[E]时，可认为是零级反应。
0]
[][k t
d P d t d S d V ==-
= （4.1）， t d k S d P d 0][][=-= （4.2）
。 积分（4.2）式得??
=-
t
t
S S t d k S d 0
0][0
][][，
t k S S t 00][][=- （4.3）
。 也即t k P 0][=，故[P]与t 成正比，k 0为该零级反应的速度常数，它表明单位时间底物的减少量或产物的生成量，因次为“C ·t －
1”。
零级反应的半寿期（即一半底物转化成产物所需的时间）2
1t 可以由0][2
1
][S S t =
代入式（4.3）求得
000][21][k S S =-21t ， 0
0][2
1k S =2
1t ，
2
1t 0
2][k S = （4.4）。 2
1t 与[S]0成正比，与k 0成反比。
5.2.1.2 一级反应
反应速度与底物浓度成正比（单底物反应），称为一级反应。当[E] 〉〉[S]时为一级反应。
][]
[1S k t
d S d V =-
= （4.5）
， t d k S S d 1][][=- （4.6）。 式中k 1为一级反应速度常数。将式（4.6）积分得
??=-t t
S S t d k S S d 0
1][0][][]
[， t k S S t 10)][ln ][ln (=--， t k S S t 10][ln ][ln =-。 即 t k
S S t 303
.2][][lg
10= （4.7）
。 将t 对t
S S ][][lg 0
作图可得一直线，斜率为303.21k ， k 1的因次
为“t －
1”。
将0][2
1
][S S t =
代入式（4.7）可以得出1t
303.2][][lg 10
210k
S S =2
1t ，
2
1t 1
1693
.02lg 303.2k k =
=
（4.8）。 在一级反应中，2
1t 与k 1成反比，而与底物浓度无关。 5.2.1.3 二级反应
反应速度与两个反应物的浓度成正比，称为二级反应，这种反应可以是两个相同的反应物反应生成产物（2S → P ），也可以是两个不同的反应物反应生成产物（A ＋B → P ）。
先看第一种情况（2S → P ）：
2
22][]][[]
[S k S S k t
d S d V ==-
= （ 4.9），
t d k S S d 22
][]
[=-
（4.10）
。 式中k2为二级反应速度常数。将（4.10）积分得
??=-t t
S S t d k S S d 0
2][0][2][]
[，
t k S S t 20
][1
][1=-，
2][1
][1S t k S t +
= （4.11）。
t 对
t
S ][1作图可得一直线，斜率k 2，截距0][1S 。K 2的因次为“C －1·t －
1”。
将0][2
1
][S S t =
代入（4.11）可求出21t
200
21][1][1k S S =-21t ， 20][1
k S =21t ， 2
1t 0
2][1
S k =
（4.12）。
2
1t 与k 2及[S]0都成反比。零级反应中[S]0越大，2
1t 也越大；二级反应中[S]0越大，2
1t 反而
越小；一级反应2
1t 与[S]0无关。
再看第二种情况（A ＋B → P ）：
]][[]
[][2B A k t
d B d t d A d V =-=-
=，
如果[A] = [B]，则与第一种情况的全部推导和结果相同。 如果两个反应物中，[S A ]比[S B ]大得多，即[S A ] 〉〉[S B ]，反应中[S A ]下降的相对值很小，可以认为保持恒定，此时反应速度只与[S B ]成正比，其动力学方程式与一级反应的相同，其反应的速度常数用k obs 表示，称为表观反应速度常数。
这种反应表面看起来是一级反应，但实际上是二级反应，故称为假一级反应，k obs 在这里也是假一级反应速度常数。
当[S A ] 〉〉[S B ]时，有
][]][[]
[][2B obs B A B A S k S S k t
d S d t d S d V ==-=-
=，式中][2A obs S k k = （4.13）
。 在恒定[S B ]和不同的[S A ]时测定反应速度，得出不同[S A ]时的k obs ，再按（4.13）作图，斜率即为k 2。
如果[S A ]和[S B ]相差不大，情况比较复杂，这里不作讨论。 5.3 酶催化反应动力学方程 5.3.1 反应初速度的测定
在研究酶反应动力学时，一是改变各种因素（如[S]、[I]、pH 等），二就是测酶反应速度。随着酶反应的进行，底物浓度逐渐下降，产物逐渐积累，酶反应速度也会逐渐变小。为了排除底
物和产物浓度变化对酶反应速度的影响，人们采用酶反应的初速度作为衡量的指标。
从理论上来说，作出反应时间对反应物变化量的曲线，从近0处作曲线的切线，则切线的斜率代表初速度。但实际上切线无法作准确。
实际使用的初速度测定方法有以下几种： 5.3.1.1 高底物浓度测定法
高底物浓度测定法即零级反应近似法。它采用[S]＞10Km 的条件，在]
[]
[S K S V V m m +=
中，Km
可以忽略不计，V ≈Vm ，即与零级反应近似，V 为一恒定值，此法必须在无高底物浓度抑制时才适用，为了避免产物抑制，应在反应的初期测定。 5.3.1.2 低底物浓度测定法
低底物浓度测定法即一级反应近似法。它采用[S]＜
101
Km 的条件，在]
[][S K S V V m m +=中，分母中的[S]可以忽略不计，][S K V V m
m
=
，在不同[S]时测定V ，以V 对[S]作图，直线部分的斜率为
m m K V 。在直线部分，[S]乘以m
m K V
得V 。
5.3.1.3 使用不同酶量的测定法
在加不同酶量的情况下测反应速度，作出产物生成量对反应时间的图，然后以酶量对反应速度作图，此反应速度为反应了不同时间的速度平均值，以不同
的反应时间分别作曲线，在直线范围的酶量和反应时间对应的反应速度可看作初速度。 5.3.2 [E]对反应速度的影响
在[S]过量的情况下，V 对[E]成正比；而在[E]一定时，[S]与V 成双曲线关系。
若酶催化单底物反应机理为E ＋S E ＋
P ，则V = k [E][S]，也就是V 与[E]及[S]都
成正比，但实际情况不是这样，这个结果符合以H +为催化剂的情况。
若假设底物和酶先形成ES 复合物，再由ES 转化成产物，其机理可写成 ES
E ＋P
E ＋S
并假设第一步可迅速平衡，第二步较慢，是限速步骤。根据这些假设可推导出动力学方程式：
]
[]
[][02S k S E k V s +=
，在此式中，V 与[E]0成正比，而与[S]成双曲线关系，符合实际情况，故假设
的机理正确。
5.3.3 单底物——单产物反应 5.3.3.1 酶——底物复合物的存在
经过电子显微镜观察、x 光衍射和动力学方法研究，证实了确实有ES 复合物存在。 5.3.3.2 平衡学说（Henri, Michaelis 和Menten 方程）
1902年Henri 和Brown 提出了S ＋E ES —
→E ＋P 学说；1913年Michaelis 和
Menten 完善了这个理论，他们的第一步是快速可逆的平衡，第二步慢，为限速反应。
E ＋S
-
--←-→---1
1
k k ES E ＋P
在推导动力学方程时，有几点假设：①第一步迅速平衡，第二步慢，即k 2〈〈 k －1；②[S] 〉〉[E]，[S] 〉〉[ES]；③酶以E 和ES 两种状态存在。
设V f 为E 与S 结合的速度，V r 为ES 解离的速度，则
V f ＝k 1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )， V r ＝k －1 [ES]， ∵ 平衡时V f ＝V r ，
∴ k 1 ( [E]0－[ES] )( [S]－[ES] )＝k －1 [ES] ， 又∵ [S] 〉〉[ES]， [S]－[ES]≈[S]，
∴ k 1 ( [E]0－[ES] ) [S]＝k －1 [ES]，
]
[]
[)][][(011ES S ES E k k -=
-，解出 [ES] 得 ][]
[][][1
1
0S k k S E ES +=
- ，
令Ks ＝
1
1
k k -， 则 ][][][][0S K S E ES S += ，
由于V = k 2 [ES]，代入前式得]
[]
[][02S k S E k V S +=
。因为当所有的E 都成为ES 时，可达最大反
应速度，即V m = k 2 [E]0 ，所以 ]
[]
[S k S V V s m +=
，这就是米氏方程。
5.3.3.3 稳态学说（Briggs-Haldane 修正公式）
1925年，Briggs 和Haldane 提出稳态学说。他们认为，许多酶催化反应的k 2很高，k 2不仅不特小于k －1， 而且远比k －1大，即ES 分解成E 和P 的速度比解离成E 和S 的速度快。该学说认为，在反应进行了一段很短的时间后，[ES]由0增加到一定数值，然后保持不变，即达到稳
态水平，这时生成ES 的速度与ES 分解和解离的速度相等。
ES 生成的速度=
=t
d ES d ]
[k 1[E] ( [S]－[ES] )≈k 1[E][S]， ES 解离和分解的速度＝t
d ES d ]
[-
＝k －1[ES]＋k 2[ES] = (k －1+ k 2) [ES] ， 在稳态时，
=t d ES d ][t
d ES d ]
[-， 即k 1[E][S] = (k －1+ k 2) [ES] ， ∵ [E] = [E]0－[ES]， ∴ k 1([E]0－[ES])[S] = (k －1+ k 2) [ES] ， k 1[E]0[S]－k 1[ES][S] = (k －1+ k 2) [ES] ，
k 1[E]0[S] = k 1[ES][S] +(k －1+ k 2) [ES]， k 1[E]0[S] = (k 1[S] + k －1+ k 2)[ES] ， [ES] =
][][][][][][1
2
1021101S k k k S E k k S k S E k ++=
++-- ， 设Km = 12
1k k k +- ， [ES] =
]
[]
[][0S K S E m + ， 将V = k 2[ES] 代入得
][][][02S K S E k V m +=
， ]
[]
[S K S V V m m += 。
平衡法与稳态法所得的动力学方程形式完全一样，只是Ks 和Km 的区别，Ks =
1
1
k k -，Km =
1
2
1k k k +-；当k －1 〉〉k 2时，k 2可以忽略不计，Km 转变成Ks 。 5.3.3.4 Haldane 关系公式
1930年，Haldane 提出了一个关系公式。考虑到酶催化的反应有一些是可逆反应：
正反应速度V f ＝
][][][12102S k k k S E k ++- ， 正反应的米氏常数K mf = 1
2
1k k k +-，
逆反应速度Vr ＝
][][][2
2
101P k k k P E k ++---，逆反应的米氏常数K m r =
2
2
1--+k k k ， 当可逆反应达到平衡时，ES 的解离达到平衡，即k 1[E][S]＝k －1[ES]，
][][][1
1
S k k E ES ?=-， ES 的分解也达到平衡，即k 2[ES]＝k －2[E][P]，
][][][2
2
P k k E ES ?=-， ∴
][11S k k ?-＝][22P k k ?-， 2
121][]
[--=k k k k S P ＝Keq 。
Keq 为可逆反应平衡时的平衡常数，也是平衡时产物P 和底物S 的浓度比。
0102][][E k E k V V mr
mf -=
， 21-=k k K K mf mr ， 2
121--=k k k
k K V K V mf mr mr mf ＝Keq （Haldane 关系公式）
由此可见，正逆反应的V m 和K m 都不同，但最终的Keq 是相同的。 5.3.3.5 有两个中间复合物时的米氏方程 ①用稳态法推导
（推导略） V=]
[)
()(]
[][32213
232103
223
2S k k k k k k k k k S E k k k k k +++++++----
②King-Altman 对动力学方程的推导
King-Altman 根据矩阵原理，采用图像的方法简化了方程的推导过程。具体方法如下：
a ． 写出反应历程并安排成封闭的几何图形；
b ． 写出所有的n-1线图形，图形必须涉及全部的酶存在形式；
c ． 按照King-Altman 图形，写出每种酶形式的浓度和总酶浓度之比的代数式； ①对于E ：
箭头都指向E 。 含有[E]的各项常数和＝k －1k －2＋k －1k 3＋k 2 k 3 = a ；
②对于ES ：
箭头都指向ES 。含有[ES]的各项常数和＝k 1k －2[S]＋k 1k 3[S]＋k －2k －3[P]＝b ；
③对于EP ：
箭头都指向EP 。含有[EP]的各项常数和＝k 1k 2[S]＋k －1k －3[P]＋k 2k －3[P]＝c ； 则各种酶形式的浓度与总酶浓度之比为
c
b a a
E E ++=0][][， c b a b E ES ++=0][][， c b a c E EP ++=
0][][。 d ．写出速度方程，
]][[][]
[33P E k EP k t
d P d V --==
， 将[EP]和[E]代入上式得 c
b a P E a k
c b a E c k V ++-++=
-]
[][][0303，
5.3.3.6 米氏方程的积分形式 米氏方程是一个微分方程，t d P d V ][=
或 t
d S d V ]
[-=，根据米氏方程采用作图法求V m 和K m 时，要测不同[S]下的反应初速度，要求反应转化掉的S 不超过[S]0的5%，但有时P 太少不易检测。采用积分速度方程，就可以使用不同反应程度的数据，例如可以把10%～90%的[S]0转变成P 这个范围内的测定数据都用于作图，以求得V m 和K m 。但还有一些限制条件，如无产物抑制，Keq 很大等。
]
[][]
[S K S V t d S d V m m +=-
=， ][][][S d S S K t d V m m +-=，
???
?--=+-=][][][][]
[][0
000
][][][][]
[][S S S S m
S S m m S d S d S K S d S S K t d V t
)][][(][]
[ln
00
S S S S K t V m m ---= ])[][(]
[][ln
00
S S S S K t V m m -+= m m m K P t K V S S ]
[][][ln
0-=，
m
m
m K V t P K S S t +?-=][1][][ln 10 或
m
m
m K V t P K S S t +?-=][1][][lg 303.20。 这样测定几个不同时间（t ）的[P]或[S]，以
]
[][lg
303.20S S t 对t P ]
[作图，得到
按此法作图，从一个比K m 大几倍的[S]0（如 [S]≥10K m ）开始，并且使反应进行到[S]显著低于K m （如 [S]＜0.1K m ＝时，都能得到很好的分布点。 5.3.3.7 米氏方程所作图的特征
在较广范围[S]的变化中，V 随[S]的变化而变化，并表现出三个性质不同的动力学区域。 当[S]＜0.01K m 时，V 对[S]基本上是直线关系，反应速度与[S]成正比，这对底物来说为一级反应，对酶来说也是一级反应。
当[S]＞100K m 时，反应速度不依赖于[S]，V 与[S]无关，这对底物来说是零级反应，但对酶来说是一级反应。
当[S]＞0.01K m 和[S]＜100K m 时，为混合级动力学区域。
A ．一级反应动力学
当[S]＜0.01K m 时，米氏方程中的[S]可以忽略不计，所以 m
m K S V V ]
[=， 而一级反应速度是与[S]成正比的，即 ][S k V =， 反应速度又是单位时间底物S 的减少率，即 t
d S d V ]
[-= ， 从这3 个式子可以得出下列关系：
t
d K V
k S d m m ]
[-==。
一级反应速度常数k 的物理意义是：在任何时间t 时，现存底物在单位时间内的转化比值。 如果用][S k V =求k 值不方便时，可用下列方法求k 值：
a ．积分法求k 值：][][S k t d S d =-，t d k S S d =-][][，??=-][0][0][][S S t t d k S S d ，t k S S =-0
][]
[ln ，
0][lg 303.2][lg S t k S +-
= 。 以lg [S] 对t 作图可得一直线，其斜率为303
.2k
-。
b ．半寿期法求k 值：一半底物反应生成产物所需的时间为半寿期2
1t 。
当t ＝1t 时，
25
.01
][][0==S S ，
由0][lg 303.2][lg S t k
S +-
=得 k S S =]
[][[lg 303.2021t ， 2
1
693.0t k =，按上图求出21t ，
即可求出k 值。 B ．零级反应动力学
当[S] 〉〉K m 时， m m V S S V V ==]
[]
[， t V S S P m =-=][][][0 。 5.3.3.8 米氏方程的意义
我们讨论米氏方程的几个特点及应用。
A ．反应速度与底物浓度之间的关系 a ．V 和[S]的关系为一双曲线：
将米氏方程整理可得双曲线方程的标准形式。
][][)]([][][][][S K K
V V S K K V K S V S K K V K V S V S K S V V m m m m m m m m m m m m m m m m m +-=+-+=+-+=+=
m m m
m V S K K V V ++-
=]
[
当[S]为正值时，此式的图形是双曲线位于第四象限的一支。与标准双曲线（x
c y 2
-=）相
比，（虚线是原轴）米氏方程的纵轴右移了K m ，横轴下移了V m 。 b ．特定的V 和[S]值：
当[S] 〉〉K m 时，V = V m ，这是酶被底物全部饱和时所能达到的最大反应速度。
当[S]＝K m 时，V=2
1
V m ，Km 可定义为反应速度达到最大反应速度一半时的[S]。
当[S]〈〈 K m 时，m
m m K S E k K S V V ]
[][][02=
=
，此方程有两个含义。一是在[S]很低时，V 和[S]呈直线关系；二是
m
K k 2
为二级反应速度常数，这个常数可作为比较催化效率的一个特征常数。在同系列底物中，
m
K k 2
最大的是该酶的最适底物。 c ．任何两个V m 分数时的[S]之比为常数：
当V = 0.9V m 时，
][]
[19.0S K S m +=
，[S]＝9K m ； 当V = 0.7V m 时，
][]
[17.0S K S m +=
，[S]＝37K m ； 当V = 0.1V m 时，
]
[]
[11.0S K S m +=
，[S]＝91K m ； 819][][911.09.0==m
m
K K S S ，
2193][][11.07.07
==m
m K K S S 。 B ．K m 的意义
K m 是酶的特征性常数，但必须固定在某一反应条件下（pH 、温度、离子强度等）才能保持不变。若一个酶可以催化多种底物反应，则对不同底物有不同的K m 值。 a ．计算V 达到V m 的百分率：
]
[]
[S K S V V m m +=
，已知K m 和[S]，可知反应速度达到最大反应速度的百分率。 b ．要达到一定的
m
V V
，需要多大的[S]： c ．寻找天然底物：找K m 值最低或
m
m
K V 最大的底物为天然底物。如黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase ）既可催化黄嘌呤氧化，又可催化醛的氧化，因其K m 值分别为0.05mmol/L 和10mmol/L 数量级，故将此酶命名为黄嘌呤氧化酶。木糖异构酶（Xylose isomerase ）也能催化D-葡萄糖异构成D-果
糖，但因其催化D-木糖转变成D-木酮糖的K m 值较低，故称为木糖异构酶。 d ．判断在细胞内酶是否受[S]的调控：
了解酶的K m 和细胞内的[S]可以推测该酶
在细胞内是否受[[S]的调控。当[S] 〉〉K m 时，[S]的稍微变化不会使V 有多大变化；反之，如果[S]〈〈 Km ，则V 对[S]的变化十分敏感。
己糖激酶同工酶Ⅳ存在于肝中，对葡萄糖的K m
＝10mmol/L ，而己糖激酶同工酶Ⅰ～Ⅲ存在于多种组织中（尤其是肌肉中），它们对葡萄糖的K m ＝0.04mmol/L 。在禁食状态下，血糖浓度大约为3mmol/L ，这时同工酶Ⅰ～Ⅲ的反应速度已达到V m （98.7%V m ），而对同工酶Ⅳ只有23%V m 。当摄入食
物后血糖水平达到约9.5mmol/L ，这时同工酶Ⅰ～Ⅲ的反应速度仍然是V m （99.6%V m ），而同工酶Ⅳ的V 达到49%V m 。这说明同工酶Ⅳ受血糖浓度的调控，而同工酶Ⅰ～Ⅲ不受此因素调控。由此可见，肝中的己糖激酶同工酶Ⅳ能够在血糖浓度升高时，使糖原合成的速度加快。 e ．判断在细胞中酶催化反应的主要方向：
根据酶催化正反两个方向反应的K m 及体内两向的[S]，可以判断体内反应进行的方向。 f ．寻找限速步骤：
根据代谢途径中各步反应酶的K m 和相应的[S]，推测限速步骤。 g ．作为判断同工酶种类的依据：
同工酶对同一底物的K m 往往不同，而具有同工多形性的非同工酶（蛋白质修饰方式不同）对同一底物的K m 常常是相同的。据此可以判断不同来源催化相同反应的酶是否同工酶。 h ．判断酶和底物亲和力的大小：
当k －1 〉〉k 2时，K m ＝Ks =1
1k k ， K m 越小，表明酶与底物的亲和力越大。m K 1
为酶与底物
的亲和常数。 C ．V m 及k 2的意义
当[S] 〉〉K m 时，V m ＝k 2[E]0，可通过k 2＝
][E V m
来求k 2。这时的反应为假一级反应，k 2是表观一级反应速度常数。若[E]0用活性中心当量表示，则k 2表示每个活性中心在单位时间内催化的底物分子数，即转换数。k 2又称催化常数，用k cat 表示。 5.3.3.9 K
m 和V m 的求法
A ．Lineweaver-Burk 作图法（双倒数作图法）
]
[]
[S K S V V m m +=
， 两边取倒数得
m
m m V S V K V 1
][11+
=。 以
V 1对][1S 作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为m V 1，横轴截距为m
K 1-。
B ． Hanes-Woolf 作图法
给双倒数式两边同乘以[S]得
m
m m V K S V V S +=][1
][。 以
V
S ]
[对[S]作图，在一定范围内可得一直线。 直线的纵轴截距为
m
m
V K ，横轴截距为－K m 。 C ．Eadie-Hofstee 作图法
]
[][S K S V V m m +=
， K m V ＋[S]V = V m [S]， [S]V = －K m V ＋V m [S]，m m
V S V
K V +-=][。
以V 对
]
[S V
作图，在一定范围内可得一直线。直线的纵轴截距为V m ，横轴截距为
m
m
K V 。 5.3.3.10 偶联酶反应中的动力学问题
A ．用偶联酶的实验问题
若被测酶反应的产物不便于测定，可偶联一个酶，
。若E 1和E 2的反应
条件差别较大，可在E 1反应一段适当时间后，终止反应（加热等）。然后改成适合E 2反应的条件，加入E 2和必须的辅底物，反应适当时间使S 全部转化成P ，再测定P 的量。问题是第二阶段要反应多久，才能使最大限度的S 转化成P 。
从“5.3.3.6米氏方程的积分形式”中的积分方程可得
2
022]
[][][lg 303.2mE mE mE V P S S V K t +
=
，式中2mE V 和2mE K 分别为偶联酶的最大反应速度和偶联酶对S 的米氏常数，[S]0为第一步反应的产物浓度，也是第二步反应的初始底物浓度。
从理论上计算，当[S]下降到很低时，反应为一级反应，若要使100%的S 转变成P ，需要无限长的时间。假如我们确定要使98%的S 转变成P ，这个误差是可以接受的。
设K mE2 = 2×10－
4mol/L ，V mE2 = 5×10－
5mol/L/min （等于0.05国际单位/ml 的酶量），第一步
反应积累的[S]0＝1×10－
4mol/L ，则将98%的S 转变成P 所需的时间为：
5
444454%
9810
51098.01098.0101101lg 105102303.2-------??+?-?????=t ＝17.6 min ≈18 min 利用这个积分方程，我们也可以先确定反应时间，再计算需要加多少酶。 V mE2与酶量的换算关系：1mol/L ·min ＝1mmol/ml/min =1000μmol/min/ml =1000国际单位/ml
* 如果[S]0〈〈 K mE2，那么第二步反应是一级反应，这样只需测出第二步反应的初速度，即可根据下式计算出[S]0。
][][22S K S V V mE mE +=
≈2
2][mE mE K S V ， 22][mE mE K V V
S =
B ．偶联反应的动力学
若E 1和 E 2所需的反应条件相似，互相不干扰，就可以将这两个反应同时进行，在达到稳态后，[S]不变，记为[S]ss （steady state ），这时第二步反应的速度与第一步反应的速度相等，所以
])[][(]
[][ln
00
S S S S K t V m m -+=
只要测出E 2的反应速度即可知E 1的反应速度。
为了能够用上述方法测定，需要满足以下两个条件： a ．第一步反应必须是零级反应，并且不可逆。 b ．第二步反应必须是一级反应，并且不可逆。
当[A]0 〉〉K mE1时，第一步反应可以认为是零级反应；第二步反应连续地消耗S ，S 的浓度最大达到[S]ss ，当[S]ss 很小时，可以认为第一步反应不可逆。
用充分过量的E 2，可使[S]ss 〈〈 K mE2，这时第二步反应为一级反应；若E 2反应的平衡远远向右（Keq 很大）或E 2反应的辅产物被连续地移去（生成气体、沉淀等），或反应只进行很小的程度，E 2的反应可以认为不可逆。在这些条件下，经过一个短时的延迟期，体系将达到稳态。
E 1反应为零级反应，反应速度与A 的浓度无关，V 1 = k 1 ；E 2反应为一级反应，在稳态时反
应速度与[S]ss 成正比，V 2＝k 2[S]ss ；稳态时V 1=V 2，k 1＝k 2[S]ss ，所以[S]ss ＝
2
1
k k 。 如果E 1加倍，则第一步反应速度V 1加倍，根据稳态条件，V 2也加倍；而V 2＝k 2[S]ss ，所以 [S]ss 也加倍。另一方面，如果E 2加倍，由于V 1没变，根据稳态
条件，V 2也不会变；E 2加倍，k 2也会加倍，所以[S]ss 减半。因此一旦有充分过量的E 2存在，E 2的变化不影响V 2，V 总＝V 1=V 2。E 2的使用量可通过试验取得，也可用McClure 于1969年提出的方法计算而得。
酶促反应动力学实验
酶动力学综合实验 实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶： 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程： Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即： 错误！未找到引用源。(1) 式中：v表示酶促反应速度， 错误！未找到引用源。表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度， 错误！未找到引用源。表示米氏常数。 3、错误！未找到引用源。值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1，a） 根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测错误！未找到引用源。一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。不精确。此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 ②Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b） 实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：错误！未找到引用源。(2) 以错误！未找到引用源。对错误！未找到引用源。作图，即为y=ax+b形式。此时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距为错误！未找到引用源。。把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—错误！未找到引用源。。 ③Hofstee作图法（略） 把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。，得： 错误！未找到引用源。(3) 以v对错误！未找到引用源。作图，这时斜率为错误！未找到引用源。，纵截距
酶动力学
酶动力学 酶动力学是研究酶结合底物能力和催化反应速率的科学。研究者通过酶反应分析法（enzyme assay）来获得用于酶动力学分析的反应速率数据。 研究酶催化剂参与的生物反应过程中，酶反应速率及影响酶反应速率的各种因素。它能提出底物到产物之间可能历程与机理，获取反应速率和影响此速率的诸因素，例如温度、pH、反应物系的浓度以及有关抑制剂等的关系，以满足酶反应过程开发和生物反应器设计的需要。底物浓度的影响长期以来，人们已经知道许多化学反应的速率随着反应物浓度的增加而增加。对于一个单底物不可逆的酶反应，当底物浓度增加时，酶反应的速率不断增大并接近一 个最大值（见图）。 L.米歇利斯和L.M.门腾（1913）基于酶被底物饱和的现象，提出“中间产物”学说：即酶（E）与底物（S）结合形成一个不稳定的中间产物或络合物（ES），然后生成产物（P）和游离酶E，并推导出反应速率与底物浓度的关系式(2),即米氏方程式。它是研究影响反应速率各种因素的基本动力学的方程式，式中r为反应速率，亦即酶活力,以单位时间内底物被分解的量来表示，r=-dS/dt；S表示底物浓度;rmax为最大反应速率；Km为米氏常数，Km=（k2+k3）/k1,其数值等于当酶反应速率为最大反应速率一半时的底物浓度。Km是酶的一个特征性常数，当速率常数K2比K3大很多时,Km就接近络合物（ES）的解离常数。因此，Km是酶与底物亲和力的量度:Km值高表示E与S的亲和力弱;Km值低时表示亲和力强。 在米氏方程中，有两个基本常数Km和rmax，除从图中直接读出近似值外，一般常用双倒数法来求其精确值。此法是将式(2)的两边取倒数，以1/r与1/S来作图，可求出rmax和Km 值。 酶的抑制作用酶的抑制作用是由于某些物质与酶相互作用后导致酶反应速率的下降。引起抑制作用的物质称抑制剂。抑制作用有可逆与不可逆的。可逆抑制又有竞争性抑制、非竞争性抑制和不竞争性抑制之分。常用反应式(4)和式(5)来表示可能发生的相互作用。 E+IE=I(4) ES+I=ESI(5) 此外I为抑制剂；EI为酶-抑制剂络合物；ESI为酶-抑制剂-底物络合物。抑制剂可以按式(4)和式(5)所示的相互作用，降低式(1)的反应速率。 ①竞争性抑制作用抑制剂与底物结构相似，与底物对酶分子上相同的活性部位发生竞争性结合，生成络合物,如式(4)所示。竞争性抑制可用增加酶反应中底物浓度而逆转以解除抑制
物理化学中酶催化反应的实用性-模板
物理化学中酶催化反应的实用性 针对上述问题,作者在教学中试图通过以下几种方法循序渐进地诱发学生的学习兴趣并拓展视野,以强化这个知识点在学生脑中的印象,并使学生意识到这个知识点实际是生物化学,电化学,分析化学等学科的交叉和综合,具有重要的实际意义。酶催化反应理论的再学习与深化教材中介绍了酶催化反应的动力学方程,但实际上酶催化反应在生产中应用时绝非仅仅是一个单纯的化学反应,其与生物体内新陈代谢过程以及相关的生物电化学过程紧密相关。书中对此方面应用及相关的理论介绍较少,因此许多学生可能会认为这个知识点缺乏实际意义只是具有理论价值而已,而且由于其方程简明扼要,许多学生可能会产生这个知识点比较简单,对其延伸到相关领域后问题的复杂性缺乏必要的了解。作者在此仅以电子中介体中介漆酶催化氧还原为例,简单介绍酶催化反应延伸到酶基燃料电池领域后催化反应速率方程的复杂性。 教材中指出酶催化反应最突出的特点-高效性和专一性源自于酶分子本身具有的特殊空间构型,而酶分子的活性中心的组成和结构则决定了酶催化的选择性和速率。由于酶的这些特点使生物电化学家们对此产生了浓厚的兴趣并试图将酶作为催化剂应用在燃料电池当中。但是由于酶活性中心位于表面具有特定的空间结构之中,周围为不导电的蛋白质骨架所包覆,因此很难于实现酶活性中心与作为基底兼催化剂载体的电极表面或导电介质实现有效的电子接触。因此多数时候人们都是通过加入一种叫做电子中介体的化合物间接实现酶活性中心与电极的有效电子通讯[2-4]。这种电子中介体具有双重身份-既作为酶的反应底物发生氧化还原反应,反应的产物又可以在电极或导电介质表面发生得失电子的电化学反应而被复原。与此同时被氧化或还原的酶活性中心与底物发生纯粹的化学反应,同时也被复原并进行下一轮的催化循环,因此在这个复杂的生物化学-电化学过程中,实际被消耗的作为发动机或水泵使用的试剂是反应底物(对于漆酶在中介体存在条件下催化氧还原反应而言就是氧分子),它作为反应的驱动力而酶和中介体实际上都没有消耗(不考虑酶和中介体在使用过程中变性而丧失活力的条件下)。图1是游离漆酶/固定漆酶在扩散型电子中介体2,2#-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)存在下催化氧气还原为水的反应机制示意图:整个催化循环实际上可以分解为三个步骤:i)漆酶分子、ABTS2-/ABTS.-及氧分子在溶液中的扩散过程等传质步骤;ii)是漆酶催化ABTS2-氧化以及氧气还原等化
实验六 淀粉酶动力学分析
实验六淀粉酶动力学分析（Ⅰ） ——DNS法葡萄糖标准曲线的制作及不同pH和温度条件下的淀粉酶活力测定（4学时） 第一部分3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量 一、实验目的 学习3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的原理。 掌握3, 5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的方法。 二、实验原理 在NaOH和丙三醇存在下，3, 5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540 nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。 三、实验器材与试剂 实验器材 1. 722分光光度计 2. 电子天平 3. 恒温水浴锅 4. 1.5KW电炉 5. 18×180 mm试管 6. 40孔试管架 7. 100 mL容量瓶 8. 500 mL棕色试剂瓶；棕色及无色250 mL试剂瓶；无色200 mL试剂瓶； 50 mL棕色试剂瓶 9. 100 mL量筒 10. 200 mL烧杯、500 mL烧杯 11. 1 mL吸量管、2 mL吸量管、5 mL吸量管、10 mL吸量管
12. 纱手套 13. 玻璃棒 14. 滤纸 15. 称量纸 16. 橡皮筋 17. 化学试剂：3, 5-二硝基水杨酸、NaOH、丙三醇、葡萄糖均为分析纯 实验试剂 1. 3, 5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5 g DNS溶于少量蒸馏水中，移入1000 mL容量瓶中，加入2 mol/L NaOH溶液325 mL，再加入45 g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000 mL（老师准备）。 2. 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200 mg，加入少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100 mL，即含葡萄糖为2.0 mg/ mL（学生配制）。 3. 样品糖溶液：0.2-1.8 mg/ mL(老师准备)。 4. 250 mL蒸馏水装于250 mL无色试剂瓶中（学生准备）。 四、实验方法 1. 葡萄糖标准曲线的制作 取11支18×180 mm试管，按下表分别加入2.0mg/ mL葡萄糖标准溶液和蒸馏水，实验组做两组平行实验。 在上述试管中分别加入DNS试剂2.0 mL，试管用橡皮筋扎好，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值。以葡萄糖浓度（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线（采用excel 中的散点图法作图，注意坐标单位和作图格式）。
分光光度法测定蔗糖酶的米氏常数
实验报告解析 （目的要求、基本原理、仪器试剂和实验步骤四个部分可参阅实验预习或者实验内容部分，数据处理部分参见数据处理） 一、实验重点 1、掌握本实验的基本原理。 2、掌握实验中用到仪器的操作方法，并能熟练使用。 3、了解实验中的注意事项并能解释为什么。 二、实验难点 1、葡萄糖标准曲线的绘制 2、反应实验条件的控制 三、注意事项 1、分光光度计使用注意事项： (1)使用前，使用者应该首先了解本仪器的结构和原理，以及各个旋钮之功能。 (2)仪器接地要良好，否则显示数字不稳定。
(3)如果大幅度改变测试波长时，在调整“00.0”和“100”后稍等片刻（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“00.0”和“100”即可工作。 (4)仪器左侧下角有一只干燥剂筒，应保持其干燥，发现干燥剂变色应立即更新或烘干后再用。 (5)当仪器停止工作时，关掉电源，电源开关需同时切断，并罩好仪器 2、葡萄糖标准曲线的绘制要精确 3、反应条件要严格安要求控制 四、思考题回答 1、为什么说米氏常数是一个特征性常数，而且最大反应速度不是？ 米氏常数是酶的特征性常数，可用来表示酶和底物亲和力的大小。米氏常数与底物浓度和酶浓度无关，而受温度和pH值的影响，竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变；非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小。 Km：米氏常数，是研究酶促反应动力学最重要的常数。它的意义如下：它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕，图示以及公式推导。
它可以表示E与S之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越强，反之亦然。它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。 2、为什么测定酶的米氏常数要采用初始速度法？ 米氏方程式是根据中间产物理论推导出来的。即在酶催化反应中，酶（E）和底物（S）首先生成中间产物（ES），然后分解成产物（P）和游离酶（E）： （1） 、、代表反应各步的速率常数。当反应以恒态进行时，ES的生成速率等于分解速率，即 （2） 式中、和分别代表酶、底物和中间产物的浓度。令
第三章 酶催化反应动力学
第3章酶催化反应动力学 （2学时） 主要内容： 3.1 酶催化反应速度 3.2 底物浓度对酶促反应速度的影响 3.3 抑制剂对酶促反应速度的影响 3.4 其它因素对酶促反应速度的影响 ?酶催化反应动力学也称酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions），是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要酶促反应动力学提供相关的实验证据；为了找到最有利的反应条件从而提高酶催化反应的效率以及了解酶在代谢过程中的作用和某些药物的作用机制等，也需要我们掌握酶促反应动力学的相关规律。因此，对于酶促反应动力学的研究既有重要的理论意义又具有相当的实践价值。 酶的动力学研究包括哪些内容? ?酶促反应动力学以化学动力学为基础，通过对酶促反应速度的测定来讨论诸如底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等因素对酶促反应速度的影响。 ?温度、pH及激活剂都会对酶促反应速度产生十分重要的影响，酶促反应不但需要最适温度和最适pH，还要选择合适的激活剂。而且在研究酶促反应速度以及测定酶的活力时，都应选择相关酶的最适反应条件。 3.1酶催化反应速度 ?如果我们以产物生成量(或底物减少量)来对反应时间作图，便可以得到如图3-1所示的曲线图。 该曲线的斜率表示单位时间内产物生成量的变化，因此曲线上任何一点的斜率就是相应横坐标上时间点的反应速度。从图中的曲线可以看出在反应开始的一段时间内斜率几乎不变，然而随着反应时间的延长，曲线逐渐变平坦，相应的斜率也渐渐减小，反应速度逐渐降低，显然这时测得的反应速度不能代表真实的酶活力。 ?引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因很多，如底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆反应的进行、产物对酶的抑制或激活作用以及随着反应时间的延长引起酶本身部分分子失活等等。因此在测定酶活力时，应测定酶促反应的初速度，从而避免上述各种复杂因素对反应速度的影响。由于反应初速度与酶量呈线性关系，因此可以用测定反应初速度的方法来测
光度法酶活力测定计算方法
酶活力定义： 酶促反应在单位时间内释放出1μmol产物所需要的酶量，定义为1U (Unit)。 延伸理解： 对给定酶促反应，在单位时间内释放出n μmol底物，那么该反应体系中的酶活力即为n U。 注释：U为酶活力单位，并非酶活力指代符号，1U=1μmol/s 酶活力的测定： 根据定义，测定某种酶对某种底物的酶活，只需要测定反应时间t，以及经过t 时间后，体系内产物的物质的量变化量△n，该体系内的酶活力即为△n/t。 反应时间t：可以直接根据计时器得出 产物生成量△n：主要需要解决的测定指标 推论： 测定酶活力的核心目标为测定单位时间内产物的生成量 以下主要讨论用比色法进行产物生成量△n的测定： 1、直接比色法： 适用范围：产物/底物具有发色基团，可在特定波长的光照下产生吸收，且其摩尔吸光系数可查得 发色基团举例：芳环类基团如苯基、硝基苯基、苯酚基、萘基等 常用发色基底物：邻(o)/间(m)/对(p)硝基苯基(NP)修饰的酯/苷类物质 核心计算公式：Lambert-Beer定律—— △A：溶液吸光度变化量，无单位 ε：发色物质的摩尔吸光系数，单位L/(mol·cm) b ：光程，即光线穿过溶液的距离，通常为比色杯透光面 宽度，单位cm △c ：发色物质在溶液中的浓度变化量，单位mol/L 该公式可将发色物质的浓度与溶液吸光度建立联系，即： 因此产物/底物变化量， 故： 2、间接比色法： 适用范围：产物/底物不具有发色基团，需要与另一显色剂发生反应才可被检测，显色后的摩尔吸光系数可查得 反应举例：葡萄糖氧化酶-苯酚与葡萄糖反应生成红色的苯醌，用于定糖DNS试剂与还原糖加热反应生成褐色复合物，用于定还原糖 核心计算公式：Lambert-Beer定律——
酶促反应动力学实验报告
酶促反应动力学实验报告 14301050154 杨恩原 实验目的： 1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响 2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响 3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值 实验原理： 一、底物浓度对酶促反应速度的影响 在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[S]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(Michaelis-Menten方程)即： 式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[S]为底物浓度 当v=Vmax/2时，则Km=[S]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-Burk方程)，则此方程为直角方程，即: 以1/V和1/[S]分别为横坐标和纵坐标。将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。 本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[S]的倒数作图，计算出其Km值。 二、抑制剂对酶促反映的影响
凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km 值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax 值无影响。非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[S]与酶的结合，故其Km 值不变，然而却能降低其最大速度Vmax 。本实验选取Na 2HPO 4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。 实验步骤： 实验一:底物浓度对酶促反应速度的影响 1. 取试管9支，将0.01mol/L 基质液稀释成下列不同浓度： 2. 另取9支试管编号，做酶促反应： 3. 混匀，37 ℃水浴保温5分钟左右。 4. 加入酶液后立即计时，各管混匀后在37 ℃准确保温15分钟。 5. 保温结束，立即加入0.5mol/L NaOH 1.0 ml 以中止反应。各管分别加入0.3% 4-氨基安替 比林1.0 ml 及0.5％ 铁氰化钾 2.0 ml 。 试剂 管号 试剂 管号
2酶促反应动力学共39页word资料
2 酶促反应动力学 教学基本内容： 酶促反应的特点；单底物酶促反应动力学方程（米氏方程）的推导；抑制剂对酶促反应的影响，竞争性抑制和非竞争性抑制酶促反应动力学方程的推导；产物抑制、底物抑制的概念，产物抑制和底物抑制酶促反应动力学方程的推导；多底物酶促反应的机制，双底物酶促反应动力学的推导；固定化酶的概念，常见的酶的固定化方法，固定化对酶性质的影响及固定化对酶促反应的影响，外扩散过程和内扩散过程分析；酶的失活动力学。 2.1 酶促反应动力学的特点 2.2 均相酶促反应动力学 2.2.1 酶促反应动力学基础 2.2.2 单底物酶促反应动力学 2.2.3抑制剂对酶促反应速率的影响 2.2.4多底物酶促反应动力学 2.3 固定化酶促反应动力学 2.4 酶的失活动力学 授课重点： 1. 酶的应用研究与经典酶学研究的联系与区别 2. 米氏方程。 3 竞争性抑制酶促反应动力学方程。 4. 非竞争性抑制酶促反应动力学方程。 5. 产物抑制酶促反应动力学方程。 6. 底物抑制酶促反应动力学方程。 7. 双底物酶促反应动力学方程。 8. 外扩散对固定化酶促反应动力学的影响，Da准数的概念。 9. 内扩散对固定化酶促反应动力学的影响，φ准数的概念。 10. 酶的失活动力学。 难点： 1. 采用稳态法和快速平衡法建立酶促反应动力学方程。 2. 固定化对酶促反应的影响，五大效应(分子构象的改变、位阻效应、微扰效应、分配效应及扩散效应)的区分。 3. 内扩散过程分析，涉及到对微元单位进行物料衡算和二阶微分方
程的求解、无因次变换、解析解与数值解等问题。 4.温度对酶促反应速率和酶的失活速率的双重影响，最适温度的概念。温度和时间对酶失活的影响。 本章主要教学要求： 1. 掌握稳态法和快速平衡法推导酶促反应动力学方程。 2. 了解酶的固定化方法。理解固定化对酶促反应速率的影响。掌握Da准数的概念及φ准数的概念，理解外扩散和内扩散对酶促反应速率的影响。 3. 了解酶的一步失活模型与多步失活模型，反应过程中底物对酶稳定性的影响。 2 酶促反应动力学 2.1 酶促反应动力学的特点 2.1.1 酶的基本概念 2.1.2 酶的稳定性及应用特点 酶是以活力、而不是以质量购销的。 酶有不同的质量等级：工业用酶、食品用酶、医药用酶。 酶的实际应用中应注意，没有必要使用比工艺条件所需纯度更高的酶。 2.1.3酶的应用研究与经典酶学研究的联系与区别 经典酶学研究中，酶活力的测定是在反应的初始短时间内进行的，并且酶浓度、底物浓度较低，且为水溶液，酶学研究的目的是探讨酶促反应的机制。工业上，为保证酶促反应高效率完成，常需要使用高浓度的酶制剂和底物，且反应要持续较长时间，反应体系多为非均相体系，有时反应是在有机溶剂中进行。 2.2 均相酶促反应动力学
催化分光光度法快速测定血清过氧化氢酶活性
第19 卷第4 期Vol . 19 No . 4 四川省卫生管理干部学院学报 J OU R NAL O F SICHUAN CON TINU IN G EDU C A TION COLL E G E O F MS 2000 年12 月 Dec . 2000 催化分光光度法快速测定血清过氧化氢酶活性Ξ 陈大义1 ,余蓉1 ,许沧1 ,汪勇2 ( 1.四川省卫生管理干部学院检验系,四川成都610041 ;2 .遂宁市卫生防疫站,四川遂宁629000) [ 摘要] 目的:建立一种简单快速的血清过氧化氢酶活性分光光度测定方法。方法: 利用过氧化氢酶催化分解底物过氧化氢,剩余的过氧化氢与钼酸铵、碘化钾反应生成单质碘,后者与淀粉反应生成蓝色,其蓝色深浅与酶的活性成反比。结果:底物过氧化氢浓度在0 . 025～100μmol/ ml 范围内线性关系良好γ,为0 . 9995 ,检测限为0 . 025μmol/ ml 。用本法测定316 例正常人血清,过氧化氢酶活性为50 . 78 ±17 . 46 KU/ L 。结论: 本方法灵敏度高,稳定性较好,简单快速,适用于血清过氧化氢酶活性的测定。 [ 关键词] 血清;过氧氢化酶;活性测定 [ 中图分类号] R44611 [ 文献标识码]A [ 文章编号]1003 - 403 X(2000) 04 - 0249 - 02 Active Determination of CAT in Serum by Spectrophotometry/ Chen D a yi , Yu Rong , Xu Ca ng , W a ng Yong ∥Sichu an Contin2 uing Education College of Medical Sciences ,610041 Abstract Objective : To establish a simple ,rapid determining met hod of CA T in serum. Method :CA T deco mposes a certain amount of H2 O2 . The surplus can act wit h ammo nium hep tamolybdate and potassium iodide. I odine ,o ne of t he p roduct s ,changes into blue colour when meeting starch mucilage. The intense of colour is inverse ratio wit h t he activit y of enzyme. R esults :There is a good linear relatio n ship in t he range of 0 . 025～100μmol/ ml H2 O2 ( r = 0 . 9995) . The detectio n limit is 0 . 025μmol/ ml . U s2 ing t he met hod ,we detected 316 serums of healt h people. The activit y of CA T in t hese people was 50 . 78 ±17 . 46 KU/ L (珔x ±s) . Conclusion :The met hod is sensitive ,stable and rapid. It is suitable to determine t he activity of CA T in serum. K ey w ords Serum ; C A T ;Activit y ;Determinatio n 过氧化氢酶( CA T) 亦称触酶,主要参与体内自由基的清除,催化H2 O2 分解为H2 O 和O2 。CA T 活性测定,多利用血清中触酶催化分解定量加入的H2 O2 ,经一定时间后,用钼酸铵中止上述反应,并与剩余H2 O2生成黄色的钼黄, 根据其颜色深浅可计算酶的活性[ 1 ] 。但这些方法都存在样品加入试剂后易使蛋白质沉淀,使溶液浑浊、空白值增高,形成的黄色化合物的最大吸收波长在近紫外区,使分析灵敏度较低、测定值不稳定。我们在实验中发现H2 O2 、钼酸铵和碘化钾在一定条件下反应析出单质碘,后者与淀粉形成蓝色溶液,从而建立过氧化氢酶分析与测定的方法,现将结果报告如下。 1 材料与方法钼酸铵溶液。1 %碘化钾溶液。1 %淀粉溶液。样本采集:采空腹静脉血,立即测定或4 ℃冰箱保存,48 小时内测定。 试剂配制及实验用水均为亚沸蒸馏水。 112 方法 静脉血经过自然分离后, 取血清100μl 与1 . 0ml 的基质液一起置37 ℃水浴箱中准确孵育3 分钟,取出立即加32 . 4mmol/ L 钼酸铵1 . 0ml , 混合后置室温5 分钟,加1 %碘化钾溶液0 . 6ml ,摇匀后,加1 %淀粉溶液0 . 2m 摇匀放置10 分钟,以1cm 比色皿,于586nm 波长下,用空白3 调零,测定样本、空白1 、空白2 的吸光度值。酶活性单位的定义及计算按文献[ 1 ] 进行。计算公式如下: A1 - A样271 111 材料 U V2260 型分光光度计( 日本岛津) 。722 型分光光度计( 上海第三分析仪器厂)。水浴箱。p H7 .4 , 60mmol/ L 钠- 钾磷酸盐缓冲液。基质液: 在p H7 . 4 磷酸盐缓冲液中含100μmol/ ml 的H2 O2 。使用时以上述缓冲液稀释为含H2 O2 0. 1μmol/ ml 。32 . 4mmol/ L 血清过氧化氢酶活性KU / L = 2 3 × 3注:过氧化氢酶的活性单位定义为: 每1min 分解1μmol 的H2 O2 即为1 个CA T 活性单位。271 为一常数,3 为孵育时间(3 分钟) 。A1 、A2 、A3 分别为空白1 、2 、3 的吸光度值。空白1 包括1 . 0ml 基质液、1 . 0ml 钼酸铵溶液、100μl 血清、0 . 6ml 碘化钾溶液和0 . 2ml 淀 Ξ [ 作者简介]陈大义( 1965 - ) ,男,硕士,副教授 ·249 ·
第八章 酶催化
第八章酶催化 章节分配 一、酶的结构和分类 二、酶的分离与纯化 三、酶活力测定 四、酶作用动力学 五、酶的抑制作用 六、pH值和温度对酶作用的影响 七、酶的作用机制 八、应用酶学 九、酶法制备L-氨基酸 十、生物催化反应器 十一、生物有机化学与生物催化 生物催化的定义：是利用生物催化剂(主要是酶或微生物)来改变(通常是加快)化学反应速度的作用。 生物催化转化的分类： (1)发酵：用活细胞将原材料(如糖、淀粉或甲醇)转化成更复杂的目标产物。 (2)前体发酵：发酵过程中添加前体物质，并由活细胞将其转化成目标产物。 (3)生物转化：用酶或静息细胞经过一系列步骤，将前体转化成目标产物。 (4)酶催化：提取粗酶或部分纯化的酶，将底物转化成目标产物。 生物催化的产生与发展： 远古时代—— 酒的酿造：酵母发酵的产物，是细胞内酶作用的结果； 饴糖的制作：用麦曲含有的淀粉酶将淀粉讲解为麦芽糖； 豆类做酱：在霉菌蛋白酶作用下，豆类蛋白质水解得豆酱和豆鼓，压榨后制得酱
油。 1878年，Kuhne第一次提出“酶”(Enzyme)的概念,意为“在酵母中”(in yeast)；1894年，Emil Fischer发现了酶对底物(酶作用的物质)的专一性现象,提出了“锁和钥匙”模型；酶晶体的获得，才认识到酶是蛋白质，是由酰胺键连接的氨基酸组成；1926年，Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，催化尿素水解,产生CO2和NH3；1967年，丝氨酸蛋白酶的发现，它专门用于洗涤剂；1992年，用于生产酶的克隆技术的诞生；最近发现除了“经典”酶以外，某些生物分子也具有催化活性。1982年Cech小组发现，四膜虫的rRNA(核糖体核糖核酸)前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，催化得到成熟的rRNA产物。这就是说，RNA本身就是生物催化剂。20世纪80年代以来，基因工程技术用于酶学研究得到高度重视。应用DNA重组技术可以生产出高效能、高质量的酶产品，用定点突变法在指定位点突变，可以改变酶的催化活性与专一性。 生物催化研究的重要意义： (1)生物催化与生物转化是与生命活动及人类发展关系最为密切的自然规律之一； (2)基于生物催化与生物转化的物质加工新模式是人类发展的必然趋势； (3)生物催化的独特优势可以促进传统产业的升级改造； (4)生物催化对于我国的经济发展和安全具有战略意义。 生物催化的主要方式： 生物催化几乎能应用于所有化学反应，例如氧化反应、羟基化反应、脱氢反应、还原反应、水解反应、酰基化反应等。 生物催化材料有酶、微生物菌体、动植物的组织及细胞。在手性合成中应用较多的是水解酶、氧化-还原酶以及面包酵母等微生物。 生物催化的方式有添加前体发酵法、游离酶法、静息细胞法、固定化酶法、固定化细胞法。可在水相、有机相和水-有机溶剂双相等系统中进行。 生物催化反应的特点： (1)高催化效率 (2)高专一性 (3)酶活性受一些化合物调控
最新酶促反应动力学实验资料
酶动力学综合实验 实验（一）一一碱性磷酸酶Km直的测定 【目的要求】 i. 了解底物浓度对酶促反应速度的影响 2?了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶： 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程： Michaelis-Menten在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反 应动力学的基本公式，即： 式中：v表示酶促反应速度， 車表示酶促反应最大速度, ［S］表示底物浓 度，表示米氏常 数。 3、?值的测定主要采用图解法，有以下四种： ①双曲线作图法（图1-1, a） 根据公式（1），以v对［s］作图，此时1/2%肚时的底物浓度［s］值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测—个近似值，因而1/2 一不精确。此外由于v对［S］的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。 ②Lin eweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b） 实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lin eweaver- Burk方程式：
以対…作图，即为y=ax+b 形式。此时斜率为丄，纵截距为 丄。把直线外推与 u [jj % 横轴相交，其截距相交，其截距即为一 ③ Hofstee 作图法（略） Vmax 卩址1丄1 〒-心冏+1 以V 对 作图，这时斜率为 ，纵截距为二，横截距为 ④ Han as 作图法（略） 把（2）式等号两边乘以[S],得: 本实验主要以双倒数法，即 Li neweaver- Burk 作图法来测定碱性磷酸酶 Km 值。 具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯 二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（PH10.0,和60C ）,准确反应13分钟。在 碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长 620nm 比色。在一定条件下 色泽深浅与光密度成正比。反应式如下： max 把（2）式等号两边乘以 ，得: ，纵截距为 --------------
过氧化物酶(Peroxidase,POD)试剂盒(分光光度法)使用说明
过氧化物酶(Peroxidase，POD)试剂盒（分光光度法）使用说明货号：BC0090 规格：50管/48样 试剂的组成： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL试剂一；用不完的试剂4℃保存一周； 试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。 测定意义： POD（EC1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD在有过氧化氢存在的情况下，能使愈创木酚发生氧化，生成茶褐色物质，该物质在470nm有最大光吸收。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤和加样表： 试剂名称（μL）测定孔 试剂一520 试剂二130 试剂三135 蒸馏水270 样本15 测定前将试剂一、二和三37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min。在1mL玻璃比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2。计算ΔA＝A2-A1。 三、POD活性计算： 1、血清（浆）POD活性 单位定义：每mL血清（浆）在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。 计算公式：POD（U/mL）=ΔA×V反总÷V样÷0.01÷T=7133×ΔA 2、组织、细菌或细胞POD活性 (1)按样本蛋白浓度计算 单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。 POD（U/mg prot）＝ΔA×V反总÷（V样×Cpr）÷0.01÷T=7133×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算 单位定义：每g组织在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活力单位。 POD（U/g鲜重）＝ΔA×V反总÷(W×V样÷V样总)÷0.01÷T=7133×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算
酶促反应动力学实验
酶促反应动力学实验
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酶动力学综合实验 实验（一)——碱性磷酸酶Km值的测定 【目的要求】 1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响 ２.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。 【实验原理】 1、碱性磷酸酶: 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中,其中以肝脏为最多。其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。 2、米氏方程: Michaeliｓ－Menｔｅｎ在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式,即： (１） 式中：v表示酶促反应速度, 表示酶促反应最大速度， [S]表示底物浓度， 表示米氏常数。 ３、值的测定主要采用图解法,有以下四种： ①双曲线作图法（图１-1，ａ） 根据公式（１)，以ｖ对[s］作图，此时1/2时的底物浓度[s］值即为Km值,以克分子浓度(M）表示。这种方法实际上很少采用,因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。实测一个近似值，因而１/２不精确。此外由于v对[S］的关系呈双曲线,实验数据要求较多,且不易绘制。 ②Lineweaveｒ- Burk作图法双倒数作图法(图1-１,b) 实际工作中，常将米氏方程(式（1))作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。其中之一即取(1)式的倒数,变换为Ｌineweaveｒ- Burk方程式： (2)
以对作图,即为y＝ax＋b形式。此时斜率为，纵截距为。把直线外推与横轴相交，其截距相交,其截距即为—。 ③Hｏfsｔｅe作图法（略） 把(２)式等号两边乘以,得: (3) 以ｖ对作图，这时斜率为,纵截距为,横截距为。 ④Hａnａｓ作图法(略） 把(２）式等号两边乘以[S],得: (4) 以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。 (a)(b) 本实验主要以双倒数法,即Liｎｅweaver-Ｂurk作图法来测定碱性磷酸酶Kｍ值。具体原理如下： 本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下（PH1０．0，和60℃），准确反应13分钟。在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长6２0nm比色。在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。反应式如下:
酶促反应动力学实验
实验 酶促反应动力学 ————蔗糖酶米氏常数的测 【目的要求】 1．了解酶促动力学研究的范围。 2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数(Km) 【实验原理】 在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度(v)则随底物 浓度[S]的增加而加速，最后达到极限，称为最大反应速度(v)。Michaelis 和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程： ] [] [S k S V v m += 此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。方法有： 1．以v[S]作图 由米氏方程可知，v=V ／2时，Km ＝[S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。因此，可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。 2．以1／v 对1／[S]作图 取米氏方程的倒数式： V S V k v m 1][11+?= 以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V 。若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km 。 本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖)的量来计算蔗糖酶的Km 值。葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应，生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之。 【试验材料】 1．试剂 (1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液%)，再转移到100ml
容量瓶中，用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg／m1的标准葡萄糖溶液。冰箱贮藏可长期保存； (2)的L醋酸缓冲液：取lmol/L醋酸钠溶液43m1及lmol／L醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得； (3)的10％蔗糖溶液：准确取l0g蔗糖溶于少量的／L醋酸缓冲液，转移到100ml容量瓶中，用同样缓冲液稀释到刻度备用； (4)3，5—二硝基水杨酸试剂：溶液I：％NaOH溶液300m1，1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠(KNaC4O6·4H20)255g三者一起混合均匀。 溶液Ⅱ：取结晶酚10g及lo％NaOH溶液22m1，加蒸馏水稀释成100ml，混匀。 溶液Ⅲ：取溶于64ml溶液n中。 将溶液皿和溶液I混合，激烈振摇混匀，即得3，5—二硝基水杨酸溶液，放置一周后备用。 (5)酵母蔗糖酶溶液：称取鲜酵母l0g于研钵中，加少量细砂及10一15ml蒸馏水研磨。磨细后置冰箱中，过滤，滤液加2—3倍体积冷丙酮，搅拌均匀后离心，沉淀用丙酮洗两次，真空干燥得固体粉末状酶，再溶于100ml蒸馏水，即得酶溶液。若有不溶物可用离心法除去。该酶液活力以6—12单位为佳。蔗糖酶活力单位的定义为：在一定条件下反应5min，每产生lmg葡萄糖所需要的酶量。备用。 2．器材 (1)100m1三角烧瓶2只； (2)研钵1只； (3)50m1及100m1容量瓶各1只； (4)离心机1台(4000rpm)； (5)糖管8支； (6)恒温水浴1台； (7)吸量管：×2支； (8)秒表1只； (9)72l型分光光度计1台。 【实验方法】 1．标准曲线的绘制 取干净糖管6支，如下表所示添加试剂。 调零点，于520nm处测定吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度为纵坐标作图。2．根据活力选择酶浓度 将10％蔗糖溶液稀释成的％的溶液，取此溶液5m1于试管中，共加两管。 将两管同时置于25℃水浴中保温5min，然后向管中加入蔗糖酶溶液，立即混匀， 同时用秒表计时，准确反应5min后，立即加入LNaOH溶液终止酶反应。另 一管先加入溶液，再加入蔗糖酶溶液(此为对照管)。 取干净糖管3支，第l、2管分别加入上述反应液各及水各，第3管加蒸馏水，然后各
酶抑制分光光度法
酶抑制分光光度法 蔬菜农药残留速测检测方法--酶抑制分光光度法，其原理是：有机磷和氨基甲酸酯类农药具有抑制昆虫中枢和周围神经系统中的乙酰胆碱酯酶活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死的原理来检测此类农药在食品中的综合残留量。此种方法主要是从家蝇或其他动物组织中提取乙酰胆碱酯酶（AChE），将乙酰胆碱酯酶与蔬菜样本提取液混合，以碘化乙酰硫代胆碱（ATChI）为底物，二硫双硝基苯甲酸（DTNB）为显色剂，经一段时间比色后，根据吸光值，计算乙酰胆碱酯酶受抑制程度。 造成蔬菜和水果农药残留问题主要是有机磷和氨基甲酸酯类农药。如果蔬菜的提取液中不含农药或残留量很低，酶的活性就不被抑制，试验中加入的基质就被水解，水解产物与加入的显色剂反应产生颜色或水解产物本身有颜色。如果蔬菜提取液中含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，基质就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。在分光光度计测定吸光度的变化，计算出抑制率就可以判断农药（有机磷和氨基甲酸酯类）的残留情况。抑制率与农药浓度呈正相关。残留农药对乙酰胆碱酯酶活性有抑制，浓度越高，抑制率越高。仪器通过测定酶与底物、显色剂显色反应变色速率，并与空白对照比较求得酶抑制率，从而判定农药残留量是否超标。农药残留速测检测结果判断标准（国标）中明确，酶抑制率≥50%时，蔬菜中某种有机磷或氨基甲酸酯类农药残毒超标。 酶抑制率法对部分农药的检出限 农药名称 检出限／（㎎／㎏） 农药名称 检出限／（㎎／㎏） 敌敌畏 0.1 氧化乐果
0.8 对硫磷 1.0 甲基异柳磷5.0 辛硫磷 0.3 灭多威 0.1 甲胺磷 2.0 丁硫克百威