核蛋白提取

核蛋白提取

实验准备：

1 4℃离心机

2 根据标本数计算所需I，II，I II，IV 总体积，取出液体，并加入蛋

白酶抑制剂，（III 由加蛋白酶抑制剂I 与加蛋白酶抑制剂II 混合物）实验操作：

1 收集细胞。10ml 对照细胞（1-2*105/ml ）培养48h 后，15ml 离心管收集，300g （1370 rpm ）* 5min 。弃上清，加1ml 1*PBS 轻轻涡旋混匀后转移至 1.5ml EP 管。

2 4℃，300g * 5min ，弃上清。

3重悬细胞于120 μl缓冲液I。

4重悬细胞于120 μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min 。

5 4℃ 2500 rpm * 1min 。

6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。

7 在沉淀中缓慢加120 μl 缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min 。

8 弃上清，加130 μl 缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h 。

9 离心4℃，13000g * 10 min 。

10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。

核提取缓冲液I（15ml ）

25mM HEPES 375 μl HEPES

5mM KCl 75 μl1M KCl

0.5mM MgCl2 7.5 μl1M MgCl2

DDH2O 14.54 ml

核提取缓冲液II（15ml ）

25mM HEPES 375 μl HEPES

5mM KCl 75 μl1M KCl

0.5mM MgCl2 7.5 μl1M MgCl2

1% NP-40 150 μl N P-40

DDH2O 14.39 ml

核提取缓冲液III（15ml ）

25mM HEPES 250 μl HEPES

10% Sucrose 1g Sucrose

350mM NaCl 700 μl5M NaCl

0.01% NP40 1 μl NP-40

DDH2O 9.1 ml

5M NaCl ：14.61g/50 ml H2O

注：

1 在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100 μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl 枪吸尽液体。再用III 液洗一遍，如前步骤吸尽液体，再加IV 液，这样的去除浆蛋白污染效果较好些。

2 胞浆蛋白混胞核蛋白原因：因为药物高浓度时，胞核会破裂，所以

会在高浓度处理组中胞浆蛋白混有胞核蛋白较严重；

3 胞核蛋白对照组有时会提不到原因：可能是因为没有药物处理，所

以其核不容易破开。如需要，可在步骤8 去掉胞浆蛋白后用枪头打匀，并振荡（我还没试过，这里只是建议）。

4 我们浆蛋白内参用GAPDH 或actin ，没差别。核蛋白用Histone H3 。