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转基因材料的检测
—转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测
摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号
转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产，经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]，为保护消费者的知情权和选择权，多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识，如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%[2]，韩国为3.0%[3], 日本是5%[4]等，而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度。我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识[5]，为了适应对转基因产品的标识要求，已经建立了一系列的检测方法，
以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[6]。
转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。
早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化[7]。
本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出几个适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜“华农1号”以及待测样品DNA为模板进行PCR扩增，鉴别待测样品是否为转基因材料。
1 材料与方法
1.1 材料
华农1号
野生型木瓜
待检测样品
1.2 方法
1.2.1 DNA提取
1.2.1.1 称取0.5 g的植物叶片，搁置于研钵中，加入液氮，捣碎叶片。
1.2.1.2 加入650 μl预热的DNA提取缓冲液，用力振荡1-2分钟，放入65℃水浴锅保温45分钟以上，其间，每隔15分钟用手轻微振荡3-4次。
1.2.1.3 从水浴锅中取出样品管，加入650 μl预冷的24:1的氯仿:异戊醇，盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5-10分钟。
1.2.1.4 10,000 rpm下离心10分钟。
1.2.1.5 用移液枪缓慢吸取上清液约500-700 μl至一个新的1.5 ml离心管中。
1.2.1.6 上清液中加入2/3体积的预冷异丙醇，约330-470 μl。轻轻上下摇动离心管，注意观察DNA将从溶液中析出。
1.2.1.7 在8000 rpm条件下离心5分钟。
1.2.1.8 倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底。
1.2.1.9 加入70%乙醇600 μl洗涤沉淀，5000 rpm条件下离心去上清液。再重复洗涤沉淀一次。
1.2.1.10 室温下干燥DNA沉淀，在见到无色胶状物附在管壁时，加入80-100μl无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。
1.2.1.11 用分光光度计检测所提取DNA的质量和浓度。
1.2.2 PCR反应
1.2.2.1 按表1加入PCR各反应成分于0.2ml的PCR反应管中。
表1：PCR反应MASTER MIX成分
试剂 1 Mix 4 Mix
体积（μl）
体积（μl）
10×PCR buffer 1 4
25 mM MgCl2 _ _
5 mM dNTPs mixture 0.4 1.6
10 nmol Primer 1 1 4
10 nmol Primer 2 1 4
20-100 ng/ul Template DNA 2 _
Taq DNA polymerase 0.1 0.4
ddH2O 4.5 18
Total 10 32
1.2.2.2 混匀表1的反应液后，然后分装到3个标记转基因、非转基因、待测的PCR管，每管10 μl，分别再加入对应的DNA 2 μl，然后稍作离心，进行PCR。
1.2.2.3 将反应管置于PCR仪中，按表2的反应程序进行PCR扩增
表2 PCR反应的变温程序
阶段循环次数温度持续时间
1194℃5min
23594℃45s 54℃45s 72℃1min
3172℃7min
44℃保温
1.2.2.4 制备1.5%的琼脂糖凝胶
1.2.2.5 反应结束后，在反应产物加入2ul 6×Loading Buffer，用微量移液枪小心加入样品槽中，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
1.2.2.6 加完样后，合上电泳槽盖立即接通电源，进行电泳，100 V，20 min。电泳结束后，紫外观察并拍照。
1.3 PCR定性分析的引物
表3 PCR定性分析的引物
（本实验使用的是1,3,4,6,7,8号引物进行PCR扩增[8-9]）
基因名称编号引物名称引物序列5’-3’产物大小
CaMV35s启动子1
35S-F GCTCCTACAAATGCCATCA
195 bp，邵碧英等,2002;阮小蕾等,2010 35S-R GATAGTGGGATTGTGCGTCA
Nos启动子/终止子2
Nos1-F ATCGTTCAAACATTTGGCA
165 bp Nos1-R ATTGCGGGACTCTAATCATA
3
Nos2-F GAATCCTGTTGCCGGTCTTG
阮小蕾等,2010 Nos2-R TTATCCTAGTTTGCGCGCTA
NPT II基因4
NPT1-F AGGCTATTCGGCTATGACTGG
600 bp，邵碧英等,2002 NPT1-R GCGGTCCGCCACACCCAGCCG
5
NPT2-F ATGATTGAACAAGATGGATTG
—
NPT2-R TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG
RP基因6
HN1F GCTGAGTGGCTCCTTCAACGT
753 bp
HN1R CGACAAGTTGAGTTCGTGGGA
7
HN2F TGACTCCCTTAATTCTCCGCT
298 bp，姜大刚等,2009 HN2R TGACGAGTACAAGGAGACGCC
8
HN3F GTGGTTCATGTCACATCGAG
150 bp,阮小蕾等,2010 HN3R AATACACCAGTAGCTCAGGC
9
HN4F ATTGACGAGTACAAGGAGACGC
285 bp
HN4R CTCCGCTCATGATCAGATTGT
2 结果与分析
2.1结果
由图1可看出，使用引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R、Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R（即引物对1,4,6,7,3,8）这六对引物组合进行华农1号转基因木瓜、野生型木瓜及待测样品DNA的PCR扩增，作为阳性对照的转基因木瓜都扩增出条带，作为阴性对照的野生型木瓜都没有扩增出条带，而待测样品在只有4号引物没有扩增出条带。而我小组华农1号转基因木瓜与待测样品DNA都扩增出条带，野生型木瓜没有扩增出条带，且华农1号转基因木瓜扩增的条带较待测样品亮，而不同的引物之间扩增的片段碱基对数有所不同。
图1 PCR扩增电泳图
（从右往左，每对引物对应的三个DNA样分别是华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品）
2.2分析
实验结果显示，作为阴性对照的野生型木瓜都没扩增出条带，作为阳性对照的华农1号转基因木瓜都扩增出条带，这与理论相符，野生型木瓜不含这些CaMV35s启动子，Nos启动子/终止子等基因片段故不能扩增出相应的任何片段，而转基因木瓜含这些基因。且待测样品扩增出的条带与华农1号转基因木瓜相对应的条带片段大小基本一致，说明本实验的待测样品为转基因产品。就待测样品而言，4号引物能特异性扩增待测样片段，而实验结果显示没有条带，可能实验操作的失误。我小组的实验结果表示实验成功，而华农1号转基因木瓜扩增的条带较待测样品亮，说明8引物扩增出的华农1号转基因木瓜的量比较多。而不同的引物之间扩增的片段碱基对数有所不同，这是特异性引物之间的片段长短不同，故扩增的片段大小不一。
3.讨论
本实验对转基因产品的检测是采用的通用元件筛选PCR检测，而通用元件筛选PCR检测主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如CaMV35S 启动子、 FMV35S 启动子、 NOS 终止子、 7S 3’终止子等通用元件以及 NptII 、 Hpt 、 Pat 、 GUS 、 aad 等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR 检测的特异性，只能用于转基因产品检测的初步筛选。因此可以通过基因特异性PCR(Gene-specific PCR) 检测、构建特异性 PCR(Construct-specific PCR)检
测、品系特异性 PCR(Event-specific PCR)检测等方式来提高筛选PCR检测的特异性。另外，也可以通过基于蛋白质的转基因产品来对转基因产品进行检测，例如酶联免疫吸附法、侧向流动免疫测定法等。
通过本实验，我学会了比较简单的转基因产品的检测，同时也对转基因产品进行深入了解。而且通过近三周的分子实验掌握了比较基本的分子实验。尽管实验有失败（逆转录PCR四只管只有一只扩增出条带),但是我认识到对待科学实验要持严谨的态度，不能草率了事。最后，感谢老师在实验过程给予我的指导及同学的帮助。
参考文献
[1]James C. Global status of commercialized biotech/GM crops 2007. ISAAA breif
No 37. Executive summany[M]. New York International Service for the equisition of A gribiotech Applications (ISAAA). 2007.
[2]European Commission Regulation(EC)No.1829, 2003 and1830, 2003[J]. Off Eur
Commun L,2003,18(268):1-28.
[3]Notification No. 2000-31 Ministry of Agriculture and Forestry of Korea, Seoul,
Korea.2000,22[Z].
[4]Notification No.1775 Food and Marketing Bureau,Ministryof Agriculture,Forestry
and Fisheries of Japan,Tokyo,Japan,2000[Z].
[5]中华人民共和国农业部农业转基因生物标识管理办法[Z].(2002).
[6]Ahmed F E. Detection of genetically modified organisms in foods[J]. Trends
Biotechnology, 2002, 20:215-223.
[7]魏祥东. 转番木瓜环斑病毒（PRSV）复制酶突变体（RP）基因番木瓜的选育、
抗病机理及安全性分析 [D]. 2006.
[8]姜大刚, 周峰, 姚涓, 穆虹, 梅曼彤. 转基因番木瓜“华农一号”事件特异性
定:PCR检测方法的建立[J]. 华南农业大学学报, 2009, 01.
[9]阮小蕾，马丽娟，李华平等. 转番木瓜环斑病毒复制酶基因番木瓜的多重定
性检测[J]. 湖南农业大学学报（自然科学版）, 2010, 36 (6) ：626—629