临界胶束浓度对于药物在生物体内增溶性的重要性研究

临界胶束浓度对生物相关的介质中增溶性预测的重要性研

究

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Mo P m u 2015 12 1171?1179

摘要：该研究评估了在禁食状态模拟的肠液(FaSSIF)等生物相关联的介质中通常观察到的化合物固有的表面性质是否与溶解度增强相关（SE）。测定了51种不同的化学化合物在禁食状态模拟的肠液(FaSSIF)和在磷酸盐缓冲液中的溶解度及其表面活性参数。研究表明，与磷酸盐缓冲液相比，能观察到在禁食状态模拟的肠液(FaSSIF)中化合物的临界胶束浓度（CMC）参数与溶解度增强（SE）密切相关。因此，分子形成胶束的内在能力也是每个化合物对生物相关表面活性剂胶束亲和力的决定因素。相比于CMC与亲油性(logD)之间的关系，尤其是在药物通常涵盖的亲油性logD范围内（2＜logD＜4），CMC和SE之间存在着更好的相关性。CMC可作为一项有应用价值的参考参数，用来指导药物开发者们更好地诊断、改进和预测药物在生物相关联介质中的溶解度，从而提高口服候选药物的生物利用度。

关键词：溶解度，FaSSIFM，FeSSIF，BCS, CMC，溶解，生理环境，表面活性剂，临界胶束浓度，亲油性，两亲性，模拟肠液

引言

为了实现药物的作用部位，口服给药必须首先克服由肠道障碍引起的生物障碍。通常来说，胃肠道药物的溶解度是一个限速步骤，它决定了药物在胃肠道的吸收程度。药物的低溶解度经常导致有限的口服生物药效率，且往往引起广泛的个体差异。在生物药剂学分类系统（BCS）中，水溶性介质历来是一种标准介质1，近年来，作为BCS子分类的一个部分2，生物相关胃肠道介质的出现，为药物在肠道环境中的溶解度提供了一种与生理更相关的预测。已有研究通过生理吸收模型证实了它们特别适合于预测和模拟BCS II类化合物的吸收曲线3。在最广泛使用的介质中，模拟肠液FaSSIF和FeSSIF分别是用于模仿禁食和喂食条件下的肠道环境的生物相关胃肠道介质4。一般而言，作为增强的润湿性和/或胶束增溶的结果，药物在生物相关介质中的溶解度通常比在缓冲水溶液中的溶解度增加5。

Nawroth等人研究了人类由进食到禁食状态下消化系统里胆盐?脂质溶液结构的发展过程6。研究显示，在模拟肠液FeSSIF中形成了小的混合胆盐?脂质胶束，在模拟肠液FaSSIF 中则主要形成了大的脂质体。鉴于这些生物相关联系统结构的复杂性，相对于水介质，要想弄清在模拟肠液介质中哪些参数负责参与选择性调节任一化合物的溶解度具有相当的挑战性。

虽然亲油性似乎是解释化合物对胆盐?脂质溶液亲和力的一个关键属性7，其它因素，如静电相互作用、pH值和分子形状等都是需要考虑的重要参数8。近年来，研究人员强调了由分子结构参数和能积极帮助预测的适度亲油能力来对药物在模拟肠液和脂类物质中的溶解度进行准确地预测具有挑战性9-10。

对有助于胶束增溶的化合物性质，还有必要提供一个更加清晰和全面的描述。深入了解结构因素对于驱动化合物在生理环境中增溶性的影响有利于药物的发现，尤其是处理水溶性差的一类化合物，而肠道吸收是一个关键的优化属性。在这种情况下，使用可靠的体外模型来辅助化合物设计的方法成为药物开发过程中的一种重要的技术手段。

表面张力是由一种行之有效的体外实验测定的，即通过测量化合物的临界胶束浓度和两亲性评估其表面活性的性质。两亲性是用来量化化合物对生物膜亲和力的一个重要特性，被广泛应用于制药行业预测药物引起的磷脂质病11,12、血脑屏障渗透13以及药物淋巴吸收14等。在本论文研究中，我们同样评估了化合物对包含在生物相关介质中胶束的亲和力是否可以通过化合物固有的表面活性性质来进行解释。因此，我们表征了不同化合物的表面活性性质，与化合物在水溶液中的溶解度相比，我们观察到化合物在FaSSIF中的增溶性程度与它们的表面活性性能存在关联。我们研究的五十一种分子具有广泛的溶解性，亲脂性和电离状态，包括上市药品和罗氏公司专有的化合物。

实验部分

化合物：化合物主要是罗氏制药研发中心自身合成或者从市场上购买所得。浓度为0.05M 的pH为 6.5的磷酸缓冲溶液由以下步骤制备：将 4.86g的KH2PO4（Sigma 公司）和2.02gNa2HPO4（Sigma 公司）溶解在1L的蒸馏水中，随后，经过密理博过滤膜过滤。FaSSIF 缓冲液使用SIF粉末（克里登-英国）由已知的详细配置方法制备得到15。

水溶液和FaSSIF中的平衡溶解度：准确称量的1mg干燥粉末状的化合物加入到试管中，加入330微升缓冲溶液溶解。样品使用超声波超声1小时（布兰森1210，布兰森超声波仪，美国丹伯里），室温下摇晃2小时，放置过夜平衡。第二天，检测样品的PH并且使用密理博过滤仪（密理博，德国）过滤溶液。滤液用浓度为0.05M 的盐酸/20%的乙腈（v/v）溶液稀释制成三种不同的样品：分别是未稀释的样品，以1:10比例稀释以及1:100比例稀释的样品。化合物的校正曲线由为0.05M 的盐酸/20%的乙腈（v/v）溶液稀释的1毫克/ 毫升的DMSO标准溶液得到。校准标准和样品使用LC-UV-MS分析仪按下列描述的方法测试分

析。

增溶性SE通过样品在FASSIF中的溶解度除以在水溶液中的溶解度计算得到（方程一）

表面活性测定：化合物使用DMSO进行逐级稀释成12种不同的浓度，加入到pH为6.5的0.05 M的磷酸盐缓冲溶液中，至最后含10%的DMSO的样品。最终的化合物浓度范围是10 nM到10 mM之间。在达到极限溶解度的情况下或识别最佳参数必须要确定一个相关浓度范围时，二次实验中定义了备选浓度范围。样品放置十分钟使其在气液界面处达到平衡。表面张力的变化规律使用Kibron公司的高通量表面张力仪Delta-8(赫尔辛基，芬兰) 进行测试，用纯水（72.8mM/N）对之前测量的每份50微升的样品进行校准。表面活性参数根据吉布斯关于气-水界面经典的热力学理论计算和通过生成的等温线曲线拟合获得。主要的衍生参数如下所述。

（Ⅰ）Kaw 气-水分配系数，来自于方程2

π对应于表面张力，C代表的是化合物的浓度。（Ⅱ）CMC：临界胶束浓度指的是最高表面张力值的切线与拐点处曲线的外推斜率的交叉点（图3）（Ⅲ）△△G am两亲性，来自于方程3

其中，R指的是理想气体常数，T指的是开尔文温度。（Ⅳ）A s: 界面面积，来自于方程4

其中，N A指的是阿伏伽德罗常数。

离子化研究：电离常数（pKa）由SGA分析器通过分光光度法获得（天狼星分析仪器公司弗瑞斯特英国）。在室温下，测试样品的水溶液以恒定流量注入到流动的pH梯度仪。化合物紫外吸收的变化作为pH梯度的函数进行了监测，电离常数则由化合物紫外吸收相应的变化率为最大值处的紫外波长确定。pH梯度可以使用两种含有10%体积比的甲醇的缓冲溶液按比例混合得到。缓冲液是一种弱酸和弱碱的混合物，在波长大于240nm的区域不会有明显的吸收峰。对于不能由实验测定电离常数的化合物，其pK a是使用商用软件Moka通过建立现有公共的和罗氏公司专有的化合物的电子模型计算得到16。

表1. 51种化合物的物理化学性质以及溶解度数据，除非另有说明，否则数据都是通过实验所测。

a通过计算机模拟所得。b来自于参考文献23 . b来自于参考文献24. 从logD74中推测所得. e来自于计算机模拟ClogP. f来自于参考文献8. g来自于参考文献22 . h使用亨德生方程计算出水溶性PKa, iA, 酸；B，碱；N，中性；Z，两性离子16.

脂溶性（log D）的测定在分配实验之前，将辛醇和浓度为25 mM的磷酸盐缓冲溶液（PH 为6.5）于室温下配置成相互饱和的溶液。将浓度为10 mM化合物的DMSO原液加入至辛醇饱和的磷酸盐缓冲溶液中，制备成浓度为100 μM的样品溶液。然后，1.2 mL的该溶液通过密理博96孔过滤器（密理博，德国）过滤至Nunc96孔板中（罗切斯特，纽约），用200 μL辛醇饱和的磷酸盐缓冲溶液稀释，得到溶液的最终体积为1.4 mL。将滤液转移到罗氏公司生产的特氟龙96孔板中，并使用DIFI管（拉伯斯维尔，瑞士）覆盖，该管通过自动化液体处理系统（Bio，贝克曼，加拿大）预涂了两种不同体积的辛醇（V oct=1和5μL；针对每份体积的n=3），或者在分析化合物水溶液的初始浓度时用不预涂辛醇的管作参照（每个化合物的n=2；C aq0）。密封试剂分析盒，在室温下摇晃过夜，直到达到分配平衡。从特氟龙板的顶部拆卸下DIFI管后，使用LC-UV-MS测定了平衡条件下水相中的化合物浓度（C aq eq）及初始条件下水相中的化合物浓度（C aq0），方法如下所述。

分配系数LogD由方程5计算得到

方程中V aq和V oct分别代表的是培养板中饱和水相的体积以及饱和正辛醇相的体积。

对于一些在pH值6.5时实验数据不可得的化合物，可使用由上述同样方法测量得到的pH值为7.4时的logD或者采用计算程序Kow_clogP17预测的logP值或是使用文献报道的数据。在这种情况下，基于参考文献18发展的模型，通过使用6.1版本的LogD vs pH模型ADMET预测器（Simulations Plus，股份有限公司，兰卡斯特，CA）提供的表2中列出

的logD、logP及pKa值为输入参数，由外推法获得其PH为6.5时的LogD值。

HPLC-NV-MS对化合物的浓度分析. 样品的分析使用了安捷伦高效液相1260（溶解度样品）或者是安捷伦1290（logD样品）高效液相分析仪。HPLC-MS系统（安捷伦科技，圣克拉拉，加利福尼亚）装备了DAD检测器和API四级杆质谱分析仪（安捷伦6140，圣克拉拉，加利福尼亚）。样品注入至直径2.1毫米，长50毫米、厚2.6微米（溶解度样品）或是直径2.1毫米，长30毫米、厚1.7微米（logD样品）的KinetexXB分析柱中，60 o C温度下测试。流动相由A相（水）和B相（乙腈）组成，二者皆包含0.1%体积的甲酸。用通用的快速梯度以1.5mL/min（溶解度样品）或1.0mL/min（logD样品）的流速进行梯度淋洗。当通过DAD检测器后，洗脱液到达电喷雾口并保持下列源设置：毛细管电压+3.5 KV，干燥气体（N2）流量13 L/min，雾化压力60 psig，干燥气温度为350 o C。由单反应监测模式获得伪分子离子[M+H]+强度的积分。对于LogD样品，MS数据的内部校准可通过注入1、3 及5 μL的参照溶液来完成。如果紫外光灵敏度很高的话，在适宜波长下的峰面积可以用于计算。

结果

在FaSSIF和缓冲液中溶解性的评价及理化性质。

源于不同的研究方案，我们选取了21种上市药品和30种罗氏化合物为研究对象，其原因在于它们在缓冲水溶液和FaSSIF介质之间具有不同的溶解程度，测试两类化合物的缓冲液pH值皆为6.5。作为标准的做法，所有的溶解度和表面压力分布测试均在室温下进行，而不是在37°C下进行。尽管温度会影响药品的溶解度、脂质聚集分配、以及增溶溶解，有报道称牛磺胆酸盐胶束的聚集数对于温度的变化相对不敏感19。化合物集包含不同的化学物质，具有广泛的亲脂性，涵盖不同类型、不同程度的电荷态，如包括中性，酸性，碱性和两性离子分子。它们主要的物理化学性质以及溶解度值列于表1。

增溶性（SE）程度从0.6到超过429倍不等，提供了一个广泛、动态范围的观察。如图1所示，和先前研究工作期望的一样8，在FASSIF中测得的药物溶解度接近或高于在缓冲水溶液中的溶解度，结果是SE值通常接近或高于表1中列出的值。此外，低水溶性的化合物在FaSSIF中的SE值普遍较高，在FaSSIF中SE值较低的一端则主要代表的是中性和亲脂性化合物。水溶性高于100 μg/mL的化合物在水和FaSSIF介质中具有相似的溶解度。

图2是SE对logD的函数图，logD是pH为6.5时测得或外推法得到的药物在辛醇中的分配系数，可以观察到logD和增溶性对数之间存在积极趋势的相关性（r2= 0.50）。logD值在-3到2范围之间的化合物没有表现出增溶性，而高亲脂性（logD>4）的化合物总是表现出明显的增溶性增加（>10倍）。对于亲脂性值介于2～4之间的化合物，其亲脂性与logSE 之间的相关性很差（r2=0.24），表明仅仅logD并不能够充分的解释和预测在这个亲脂性范围内的化合物的SE值（图5B）。

图1. 51种化合物在PH为6.5的磷酸盐和FASSIF缓冲溶液中的平衡溶解度。化合物划分为酸(■)，碱(△)，两性离子(●)、中性(X)。直线代表的是拟合线。低于数据下限的值绘制了其检出限。

图2. 51种化合物的SE （SE=S_FASSIF/S_水溶液），代表的是化合物在pH为6.5的辛醇溶液中分配系数。化合物划分为酸(■)，碱(△)，两性离子(●)、中性(X)。直线代表的是拟合线。低于数据下限的值绘制了其检出限。

表面活性参数的测定

表面活性剂的主要参数从浓度表面压力剖面图获得。对这些代表化合物参数的描述如图3所示，其完整的数据集总结在表2中。

图4将表面性质同增溶性程度进行了对照。在测定或衍生得到的不同表面性能参数中，临界胶束浓度（CMC）表现出与SE明显的负相关性(r2 = 0.79)，这说明化合物形成胶束的倾向性越高，其在FASSIF中的增溶性程度越大。具有低的或测不出临界胶束浓度的化合物表现出接近表1的一致的SE值。其它表面参数，如界面面积，气?水分配系数，和两亲性对SE作图时均显示出某种趋势，虽然不如临界胶束浓度那么显著。

图3.表面压力典型剖面图. A指的是化合物29的表面压力典型剖面图，B指的的是尼群地平的表面压力典型剖面图。虚线表示的是描述表面张力参数

表2. 51种化合物表面张力性能参数

讨论

低溶解度常限制口服药物吸收。这种影响变得越来越严重，因为药物研究计划逐渐转移到关注分子量更大、更亲脂性的化合物，转变向低溶解度的实体20。肠道生物相关介质如FeSSIF和FaSSIF中溶解度数据与生理学建模方法的使用让我们可以更多的预测理解吸收程度3。众所周知，这些介质有助于化合物的增溶，然而，人们对这种增溶的分子驱动力仍然知之甚少。

考虑到肠道生物相关介质易于形成超分子自组装，比如形成脂质体和胶束6，这就引导我们可以假设化合物的表面活性与它们在肠道环境中被溶解的能力存在关联。生物相关介质的表面活性已有研究报道21，然而，人们很少关注溶解的化合物所固有的表面活性性能。事实上，介质中的化合物通过联合形成胶束，在胶束体系中就可以发生增溶作用。因此，化合物形成的胶束的倾向可能是决定增溶程度的一个相关属性。

图4. 增溶性值与表面张力参数之间的相关性：（A）logCMC 浓度为1μM; (B)界面面积（As）;

(C)气-液分散系数（Kaw）; (D) 两亲性（△△Gam）.化合物划分为酸■，碱△，中性×，两性●. 图中的点低于或高于图中标绘的直线，表面这些测试值超过了其本身的检测限。

按照这种工作假说，我们表征了一系列不同的市售和罗氏公司专有的药物的表面活性性能，旨在研究这样的表面活性参数与相比于水性介质的FaSSIF中增溶程度之间的相关性。依据关于气-液界面的经典的吉布斯热力学理论，我们测定了化合物主要的表面活性性能。由此产生的数据可以确定临界胶束浓度（CMC）作为最有影响的参数，与FaSSIF中观察到的溶解度增强（SE）之间存在着强烈的关联性。其它表面活性参数：如界面面积（A s）,气-液分配系数（K aw），和两亲性（△△G am），对SE做图时，也存在着一定的相关性，只是不如CMC 与SE之间的相关性明显。此外，因为As、Kaw和ΔΔG am部分依赖于CMC，在相关的研究中，观察到的它们与SE的相关性趋势可能和CMC的影响有关。

这些结果表明，具有高倾向自形成胶束体系的化合物（低CMC）可结合FaSSIF胶体组装而表现出良好的可溶解的能力。相反，当化合物具有高的或无可观察的临界胶束浓度(CMC)时(即不形成胶束)，它们的SE值几乎可以忽略不计。这表明化合物融入到FaSSIF胶束结构中是增溶的前提条件，仅用logD表示的药物与非极性胶束/囊泡的疏水相互作用并不能解释它们的增溶性。后者的例子如化合物22（logD 2.9; SE0.6; CMC>10000μM）或者甲酚那酸（logD 3.0; SE2.4；CMC>10000）；这些化合物尽管都具有高亲脂性，却表现出没有或者是有限的SE 值，可能与它们不具备形成胶束的能力有关。

图5. 增溶性与LogCMC（μM，A）的线性相关以及在PH为6.5下的辛醇分布参数（logD6.5）.LogD6.5的数据范围限制在2-4之间。图B中的空心圆相当于logD值，来自于文献、预测或者从logD中推测获得. 图中数据值低于或高于数据下限的点表示的是其检测极限。

先前已有研究对一组参考化合物进行了观察，结果显示，在一般情况下，

离子化的酸性化合物比离子化的碱表现出更低的SE。这说明，由于离子化的酸同荷净负电的FaSSIF介质组分存在着静电斥力，因而它在FaSSIF中的溶解度没有增加8。在当前的研究中，对于几个涵盖化学空间更广的专有化合物，我们没有发现离子化的酸和碱之间有关增溶方面存在的显著的溶解度差异，这说明静电相互作用可能已被其它因素屏蔽或掩盖，如化合物的构象或亲脂性。

图6. Log CMC(μM)与辛醇分配系数（logD6.5）之间的相关性，(A)完整的化合物划分为酸，碱，中性，两性。化合物的logD值在2到4之间。(B)图中的空心圆代表的是在PH为7.4的环境下来自于文献、预测或者从logD中推测获得logD值。图中数据值低于或高于数据下限的点表示的是其检测极限。

前人的研究证明增溶程度与化合物的亲脂性有一定的关联性7,22。尤其是，Mithani7的研究表明，在胆汁盐的存在下，增溶率直接取决于亲油性。虽然Mithani 用的增溶率一词与本项研究工作中使用的术语SE不完全对应，但是二者都是直接相关的，预计都将依赖于亲脂性。有趣的是，据Mithani的研究报道，在禁食

条件下，溶解度的增加非常有限，胆汁盐浓度低于CMC，随后，在进食条件下，溶解度显著增加，特别是对脂溶性化合物来说，更是如此。同样地，Fagerberg 等人22的研究表明，化合物的增溶率随化合物的亲脂性增加而增加。在我们的工作中，涵盖的化合物范围显著更广，logD与溶解性增强呈正相关。然而，我们的研究表明，与logD相比，CMC同SE的相关性更好(图5和图6)。尤其是，当考察药物中经常遇到的处于亲脂性范围内（logD在2～4之间）的化合物时，有一种现象变得很明显，logD不能正确预测SE，因此，它不能被用来作为用于SE 优化目的的一个强有力的预测参数，而在这个亲脂性范围内，CMC却可以很好地描述SE（图5）。值得注意的是，CMC和logD之间似乎是正相关（图6），这表明，观察到的SE和logD之间的相互依赖关系可能反映了logD是如何影响化合物的CMC的。

在药物开发筛选化合物的过程中，为了使化合物分子有最多的机会提供最好的临床PK/PD和最佳的安全性，可以调节不同化合物的属性。还有，溶解度是常规监测和优化的参数之一。通常来说，增加溶解度的选择方案要受到生物活性所需的结构和性能要求的限制。在这种情况下，化合物的水溶性明显受到限制，分子应该具备怎样的特征才能提高其在模拟肠液中的溶解度，这一早期的认识对设计具有较好溶解性的分子可能是有益的。尽管提高SE最直接的方法是测试包括生物相关介质在内的化合物的溶解性的试验，但测定或预测临界胶束浓度（CMC）对验证一个假设和指导药物化学的合成却非常有用。此外，CMC（测定的或预测的）对于建立新的计算机模型预测化合物在生物相关介质中的增溶性来说，是一个很有价值的信息模块。

结论

据我们所知，本论文第一次综合性地研究了类药性化合物固有的表面性质对其在与水介质相比的生物相关介质中溶解度增强的影响。该项研究证明，临界胶束浓度能够描述化合物固有的在胶束中自聚集的能力，比已为大家接受的亲油性能更好地预测化合物在FASSIF中的增溶性。我们的研究认为，如果考虑化合物在胶束中富集的倾向作为增加肠道对药物吸收的一种方式，那么药物优化策略可能会从中受益。