蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展

?综　述?

蛋白药物聚乙二醇修饰技术研究进展

董惠钧,姜俊云,郑立军,庞俊星

(鲁南制药集团股份公司生物药物研究室,山东临沂276005)

摘　要:近年来,聚乙二醇修饰技术已经成为改良蛋白药物最有效的技术之一,得到越来越广泛的应用。目前已经有十余种聚乙二醇修饰的蛋白药物上市,在临床疗效和安全方面有优良表现。此文综述了蛋白药物聚乙二醇修饰技术的发展,特别是聚乙二醇定点修饰的新技术和新方法,并展望了聚乙二醇修饰技术的发展方向。关键词:蛋白药物;聚乙二醇;聚乙二醇修饰;定点修饰

中图分类号:R914.5;T Q464.7 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0320199205

R esearch advances of PEG ylation used in modi fying protein drugs

DONG Hui 2jun ,J I ANGJun 2yun ,ZHE NGLi 2jun ,PANGJun 2xing

(Institute o f Drug Research and Design ,Lunan Pharmaceutical Company ,Linyi 276005,China )

收稿日期:2008211221

作者简介:董惠钧(19772),男,山西黎城人,博士,研究方向:生物药物研制开发,T el :0539********,E 2mail :donghuijun -747@yahoo.

https://www.360docs.net/doc/b313255452.html, 。

聚乙二醇(polyethylene glycol ,PEG )是由乙二醇单体聚合而成的以羟基结尾的线性或分支状聚醚高分子化合物,具有高度的亲水性,在水溶液中有较大的水动力学体积,并且没有免疫原性,能改变药物在水溶液中的生物分配行为和溶解性,在其修饰的药物周围产生空间屏障,减少药物的酶解,避免在肾脏的代谢中很快被消除,并使药物能被免疫系统的细胞识别。PEG 是经美国食品药品管理局(FDA )批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。蛋白PEG 修饰技术由Davis 在20世纪70年代首先进行了开拓性研究

[1]

。

1991年,第1种用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG 2腺苷脱氨酶

获得FDA 批准上市,用于治疗儿童免疫缺陷症[2],目前已经有多种PEG 修饰蛋白药物上市

[3]

。我国有许多科研人员正

在开展PEG 修饰蛋白药物的研究工作,并取得了有应用价值的成果[425]。本文主要综述聚乙二醇修饰蛋白药物技术的最新研究进展,特别是基于定点修饰的新技术和新方法,并对

PEG 修饰技术存在的问题提出了思考和展望。1　PEG 修饰剂选择

对修饰剂的选择主要考虑以下5个方面:(1)PEG 的相对分子质量(M r )的选择要综合考虑生物活性和药代动力学两方面的因素。已有的研究证明,修饰的蛋白药物在体内的作用时间与藕联的PEG 数量和M r 成正比,在体外的生物活性与偶联的PEG 数量和M r 成反比,应用M r 过大的PEG 修饰蛋白药物会导致药物丧失绝大部分的生物活性[6]。以往采用低M r (<20000)的PEG 修饰蛋白药物,结果显示出修饰

后的蛋白药物较原型药物在生物活性和药代动力学性质上没有本质改变,现在普遍采用M r 大于20000的高M r PEG 作为修饰剂[7]。PEG M r 的选择要根据实验确定,一般选择M r 在40000～60000范围内的PEG 作为修饰剂;(2)修饰位点的选择要根据蛋白质构效关系分析,选择不与受体结合的蛋白质表面残基作为修饰位点,这样修饰后的蛋白质能够保留较高的生物活性。常用的修饰位点有氨基修饰(包括N 端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N 端氨基的烷基化修饰)、羧基修饰和巯基修饰;(3)PEG 修饰剂与氨基酸反应的特异性依赖于修饰剂的化学性质与修饰位点的选择。对于修饰反应的特异性,PEG 修饰剂的发展经历了第一代和第二代。在第一代小M r (<20000)PEG 修饰中,PEG 交联的基团是赖氨酸的α2氨基和ε2氨基,交联度不均一,没有特异性,PEG 修饰后的蛋白产物是混合物,使修饰蛋白的分离纯化和鉴定很困难,不利于工业化生产。如果称第一代PEG 修饰为非定点修饰,那么第二代高M r (>20000)PEG 修饰则向定点修饰(特异性修饰)方向发展。第二代PEG 修饰中,分为赖氨酸ε2氨基定点修饰、N 末端定点修饰、半胱氨酸定点修饰、糖类残基和N 末端Ser/Thr 氧化定点修饰等。这些定点修饰有赖于新型PEG 修饰剂的开发,常用的有单甲氧基聚乙二醇(m onomethoxy PEG,mPEG )2丙醛,mPEG 2马来酰亚胺和

mPEG 2酰肼等(表1);(4)PEG 修饰剂的水解稳定性和反应活

性取决于活化基团的稳定性和修饰反应的条件控制,特别是

pH 的控制。一般来说,PEG 修饰剂的反应活性高,则其稳定

性就差,容易水解;(5)PEG 修饰后的蛋白活性、毒性和抗原

性与PEG 的M r 大小和修饰类型有关。一般随着PEG M r 的增大,蛋白的活性损失也逐渐增加,另外不同的PEG 修饰剂对蛋白的生物活性影响不同,Na 等[8]用mPEG 2琥珀酰胺丙酸酯(SPA 2mPEG,M r 2000)和mPEG 2琥珀酰丁醛(A LD 2mPEG,M r

2000/5000)分别修饰奥曲肽(Octreotide)。检测生物活性后发现,A LD2mPEG定点修饰在奥曲肽的N末端,生物活性没有任何降低,而SPA2mPEG修饰的奥曲肽则显示生物活性显著降低。而且A LD2PEG25K能够明显改善蛋白药代动力学。

表1　常用的PEG修饰剂[9211]

T ab.1　The comm only used PEG chemical m odifiers[9211]

类型修饰位点修饰均一性

mPEG2苯并三唑碳酸酯(BT C2mPEG)Lys氨基较均一mPEG2琥珀酰胺碳酸酯(SC2mPEG)氨基不均一mPEG2琥珀酰胺琥珀酸酯(SS2mPEG)Lys氨基较均一mPEG2氢脲酰氯(CC2mPEG)氨基不均一mPEG2丙醛(mPEG2A LD)N末端氨基均一mPEG2异硫氰酸苯酯(PIT2mPEG)氨基不均一mPEG2琥珀酰亚胺(SH N2mPEG)N末端氨基较均一mPEG2琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA2mPEG)氨基不均一mPEG2琥珀酰丁醛(A LD2mPEG)N末端氨基均一mPEG2乙烯砜(VS2mPEG)巯基均一mPEG2碘代乙酰胺(I A2mPEG)巯基均一mPEG2正吡啶基二硫化物(OPSS2mPEG)巯基均一mPEG2马来酰亚胺正己酸酯

　(mal2sac2mPEG)

巯基均一mPEG2酰肼(HZ2mPEG)糖基/羧基均一

2　PEG修饰蛋白药物技术

目前PEG修饰技术还存在许多缺点,主要有以下几个方面:(1)现有的修饰剂一般都是修饰在Lys和N端氨基酸的

α2NH

位点上,由于大部分蛋白药物都存在数个Lys,修饰产物往往是不均一的;(2)通常这些Lys残基位于活性位点或者受体结合部位,经PEG修饰后会破坏或掩盖蛋白表面的活性位点,使蛋白的生物学活性下降,导致使用剂量增加。研究表明,N末端的PEG修饰会使活性下降40%左右[12];(3)PEG 是具有一定M r范围的混合物,其中还含有10%～15%的OH2PEG2OH,当活化mPEG时会形成双功能PEG,使两个蛋白之间发生连接或多个蛋白聚集,并且由于修饰产物的不均一性,增加了分离纯化的难度和成本;(4)以非静脉方式给药时,PEG修饰蛋白会使生物利用度降低。针对PEG修饰的问题和难点,近年来研究人员开发了许多新的PEG修饰技术,特别是定点修饰技术成为其中研究的热点之一。

2.1　定点修饰

蛋白药物PEG修饰技术中最大的问题就是无法实现定点修饰,修饰产物不均一,给分离纯化带来很大难度,阻碍了临床应用。根据蛋白质的氨基酸性质和PEG衍生物的特点,科研人员开发了多种定点修饰的策略和方法。

2.1.1　pH控制的氨基定点修饰　在构成蛋白质的20种常见氨基酸中,只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰。这些极性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸,N2端氨基和C2端羧基。这些氨基酸残基上的反应性基团多呈亲核性,其亲核活性通常按下列顺序依次递减:巯基>α2氨基ε2氨基>羧基(羧酸盐)>羟基。因此,蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的氨基(α2氨基或ε2氨基)和N末端氨基。但是游离氨基在蛋白质分子中含量较高,亲电性活化PEG和氨基酸的游离氨基反应时,多为随机修饰,常有几个氨基被修饰,导致多态混合物的产生,即使只结合1个PEG,也可能结合在不同的氨基位点上,产生位点异构体。因此控制反应条件,降低多位点修饰是实现蛋白定点修饰的简便有效的途径。在蛋白的PEG修饰技术中,pH是非常重要的控制条件,因为在不同pH下,蛋白的电荷性质不同,导致亲核反应的能力有差别,使得PEG修饰的特异性发生变化,Park等[13]通过控制pH 实现SC2mPEG选择性修饰蛋白质中的组氨酸侧链的咪唑基团。在第二代PEG修饰衍生物中,mPEG2醛类修饰剂在酸性条件下(pH5.0)与α2氨基发生高度选择性偶合反应。这是由于当反应pH值接近于或略高于蛋白质的pK a值时,亲核性更强的赖氨酸α2氨基更容易与亲电性的PEG衍生物发生偶和反应。尽管这种选择性反应仍未达到100%,但PEG修饰剂与赖氨酸反应的不均一性显著降低。

2.1.2　巯基定点修饰　与赖氨酸相比,半胱氨酸在蛋白质中出现几率和数量很少,利用具有巯基反应活性PEG衍生物就可以实现蛋白定点修饰,但缺点是半胱氨酸的巯基通常处于蛋白的活性中心,修饰后会使蛋白活性损失较大。对于没有半胱氨酸的蛋白则可以通过基因工程手段引入巯基反应位点。这一方法不但能够实现高度选择性修饰,而且能够减少蛋白生物活性的丧失,并降低免疫原性[14215]。除了采用基因工程手段,还可用T raut′s试剂(22亚氨氢氯化硫醇,22 Iminothiolane hydrochloride)处理蛋白引入巯基。P omroy等[16]将mPEG与二硫基二硝基苯甲酸经酯化反应生成能够修饰半胱氨酸的修饰剂,修饰剂与蛋白之间形成二硫键,用温和的还原剂就可将PEG去除。具有巯基反应活性的PEG衍生物还有有mPEG2马来酰亚胺(M A L2mPEG)、mPEG2乙烯砜(VS2 mPEG)、mPEG2碘代乙酰胺(I A2mPEG)和mPEG2正吡啶基二硫化物(OPSS2mPEG)等。

2.1.3　糖蛋白中糖基定点修饰　此类PEG定点修饰的原理是:首先用葡萄糖氧化酶或高磺酸钠氧化糖类残基产生具有反应活性的醛基,这些醛基可与mPEG2肼衍生物反应生成腙或与mPEG2胺衍生物反应生成可逆的Schiff碱。用硼氢甲腈钠可将腙还原为更稳定的烷基肼化物,而Schiff碱可以还原为仲胺[17]。相对于mPEG2胺衍生物修饰,PEG2肼衍生物修饰不会形成交联聚合体,更适合于糖基的修饰,最有代表性的mPEG2肼衍生物是mPEG2酰肼(hydrazide2mPEG)。酰肼基团极低的pK a值使得酰肼基团在酸性环境下(pH4.5～5.0)中仍可以和羧基结合,而蛋白质中的氨基在该条件下由于发生质子化而不能与羧基反应,从而可实现选择性定位修饰。

2.1.4　羰基定点修饰　对于N末端含有丝氨酸或者苏氨酸的蛋白质,可采用类似于糖基的修饰方法,经高碘酸盐氧化作用生成活性醛基,与PEG2胺修饰剂发生特异性反应。对于末端没有丝氨酸或苏氨酸的蛋白质,可先经金属催化转氨反应生成酮,然后再与PEG2胺修饰剂反应。G aertner等[18]利用

此法定点修饰I L28,均一性达到80%,同时对末端没有丝氨酸或苏氨酸的G2CSF和I L21受体拮抗剂蛋白进行了定点修饰。

2.1.5　酶催化的定点修饰　酶反应温和,催化效率高,利用谷氨酰胺转氨酶(TG ase)作为催化剂,可以催化mPEG2烷胺(mPEG2alkylamine)修饰蛋白中含有酰胺结构的氨基酸残基,由于这类氨基酸在蛋白中数量少,可以实现定点修饰。如果蛋白中缺少酶催化所需的氨基酸残基,可以通过基因工程或其他方法在蛋白质的N端或C端引入。Sato等[19]采用PEG 酰胺衍生物修饰剂定点修饰完整蛋白或嵌合蛋白上谷氨酰胺残基,但不会降低蛋白的生物活性。

2.1.6　基于氨基保护的定点修饰　对于蛋白中含有多个修饰位点,可以利用氨基保护试剂对修饰后会导致蛋白失活严重的位点实施保护,对活性高的修饰位点进行定点修饰后,再将保护试剂去除。Y oun等[20]研究发现生长激素释放因子(G RF)由于蛋白水解和肾小球过滤作用,其在体内的半衰期非常短,无法有效发挥药效,因此选择PEG修饰技术解决这些问题。但是在该蛋白序列上,有3个修饰位点(T ry1,Lys12和Lys21),其中修饰第21位赖氨酸的氨基可以使蛋白保持最高的生物活性,因此,将1位T ry和12位Lys的氨基进行92芴甲氧羰基(F M OC)修饰保护后,用活化mPEG修饰21位Lys获得定点修饰蛋白,然后再将F M OC去除。这样既能保持生物活性,又能获得半衰期长,稳定的蛋白药物。除了利用F M OC 和DM M An(Dimethylmaleic anhydide,二甲基马来酸酐)等氨基保护剂外,在反应体系中添加S DS(十二烷基磺酸钠)等表面活性剂以及调整修饰反应条件,如溶剂类型、反应pH、反应温度等,也可以减少蛋白活性损失。

2.1.7　二硫键定点修饰　对蛋白中含有的二硫键进行PEG 定点修饰分为2个步骤:首先利用温和的还原剂使二硫键还原释放两个硫氢基;第二步通过PEG修饰剂的双烷基化反应重建二硫键,从而完成PEG的定点修饰。在修饰蛋白过程中不会出现蛋白的不可逆变性,而且二硫键还原后蛋白仍维持其三级结构,PEG选择性的修饰两个硫氢基,PEG的立体屏障作用确保1个二硫键只结合1分子PEG。但是二硫键PEG 修饰可能会由于PEG的屏蔽作用,降低蛋白的生物活性[21]。Balan等[22]在研究中引入三碳桥连接技术可以消除PEG的屏蔽作用,使修饰蛋白活性不受PEG分子长度的影响。这种方法仅适用于修饰二硫键对结构与功能没有关键作用的蛋白。如果对于含有多个二硫键的蛋白进行定点修饰,那么如何避免蛋白由于还原作用发生不可逆变性,又能保证准确进行PEG定点修饰,则需严格控制和优化还原条件[23]。同样是PEG修饰蛋白的二硫键,可以采用不同于上述方法的修饰策略。Veronese等[24]利用变性剂盐酸胍(3m ol/L)使蛋白部分变性,高级结构打开,但不使用还原剂以保护二硫键,在非折叠状态下完成PEG修饰后,通过透析或凝胶过滤色谱的方法去除变性剂,使蛋白重新正确折叠恢复生物活性。

2.1.8　非极性氨基酸定点修饰　通常只有具有极性的氨基酸残基的侧链基团才能够进行PEG化学修饰,修饰反应主要分为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等类型,但是非极性氨基酸也并非不能PEG修饰。Deiters 等[25]开发了一种定点修饰非极性氨基酸苯丙氨酸的方法,首先用叠氮化物通过亲核取代反应修饰蛋白质中的苯丙氨酸生成对位叠氮化苯丙氨酸,再用炔烃衍生的PEG2酰胺修饰剂修饰苯丙氨酸,发生环化加成反应形成稳定的连接体,从而完成对蛋白的定点修饰。另外,通过基因重组在蛋白质中引入含叠氮基团的氨基酸残基,再与特定PEG修饰剂偶联形成稳定的定点单修饰产物。Cazalis等[26]通过基因工程方法在血栓调节蛋白(Thrombom odulin)的C端引入叠氮蛋氨酸,与mPEG2三芳基膦(mPEG2triarylphosphine)修饰剂生成稳定的单修饰物,与随机修饰得到低活性产物相比,更好地保留了蛋白原有活性。尽管该方法比较复杂,并不适合于大规模应用,但给我们提供了一个新的PEG修饰蛋白的思路。

2.2　PEG羧基修饰

有一些蛋白的N端对其生物活性起着重要作用,如果在N端实施PEG修饰则会使蛋白的生物活性丧失,因此将PEG修饰的位点转移至C端则是一种有效的修饰策略。一般选用mPEG2酰肼或mPEG2胺对蛋白质进行修饰,羧基的修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。两者相比较, mPEG2酰肼在酸性条件下(pH5.0)能够选择性地与羧基进行偶联反应,而不会象mPEG2胺那样容易形成交联多聚体[27],因此mPEG2酰肼更适合于羧基修饰。

2.3　PEG可逆缓释修饰

尽管PEG修饰能够增加蛋白药物的半衰期,延长在体内的作用时间,但是大多数蛋白经PEG修饰后,生物活性会有或多或少的损失,因此如果能够使PEG在体内与被修饰蛋白缓慢解离,而不影响蛋白发挥正常的生物活性,那么将会使PEG修饰技术得到更广泛的应用。基于上述设想,现在已有许多成功的PEG可逆修饰的例子。

Zhao等[28]将mPEG与线性N,N2二羟乙基甘氨酸(BICI N3)酯化连接并修饰蛋白形成前药,体内注射后BICI N3在生理条件下缓慢水解并释放蛋白药物,持续时间可达数日。Choi等[29]则将寡聚乳酸(O LA)作为可解离基团结合于mPEG的羟基末端,然后再经硝基苯氯甲酸酯活化生成mPEG2O LA2PC(硝基苯碳酸酯),最后修饰目的蛋白G2CSF,在pH7.4,37℃的生理条件下,mPEG2O LA2G2CSF缓慢分解并释放G2CSF,持续时间达2d之久。除了利用上述这些可自发解离的生物类分子作为连接媒介,研究人员还合成了具有双功能基团(M A L2F M OC2NHS)并能够缓慢自发水解的mPEG2 F M OC修饰剂[30]以及能够经半胱氨酸介导硫解的mPEG2DT B (二硫苯尿烷)修饰剂[31]。从上面的例子可以看出,缓释修饰主要修饰蛋白药物的氨基和巯基,通过生理条件下(pH 7.4)水解和体内还原物质(半胱氨酸)的还原作用达到解离释放的目的。事实上,PEG除了对蛋白等生物大分子可以可逆修饰外,对化学小分子也可以可逆修饰,例如抗生素修饰,改善其药代动力学[32]。可逆缓释修饰所控制的蛋白药物释放速度取决于修饰剂键合类型、PEG链数目及M r、pH和温度

等因素。

2.4　PEG固相修饰

PEG固相修饰主要应用于合成多肽的定点修饰。通常是先制备经mPEG修饰的氨基酸衍生物或者在mPEG末端引入羧基、氨基或其他活性基团,利用固相多肽合成的方法将其偶联到肽序列中去,实现对多肽的氨基端、羧基端以及某些氨基酸侧链的PEG修饰。与多肽相比,蛋白质的固相PEG 修饰要复杂,但有许多液相修饰无法比拟的优点。例如固相修饰中修饰反应和分离纯化可以在同一色谱柱中完成,并且能够重复多次。Lee等[33]用固相载体阳离子交换树脂吸附IFNα22a,分别用不同M r的mPEG2醛类修饰剂通过还原烷基化反应修饰蛋白N末端,然后用不同盐浓度溶液洗脱纯化单修饰蛋白。这一过程将PEG修饰与分离纯化两个操作单元整合在一起,PEG修饰的蛋白产率能够达到50%～65%。严格的讲,这种修饰方式应称为“固定相修饰”则更为恰当。

2.5　体积排阻PEG修饰反应色谱

PEG修饰技术中修饰产物的分离纯化是一个瓶颈问题,通常要通过多种色谱技术结合才能达到纯化单一修饰物的目的,因此如何减少纯化步骤和损失成为该领域重要的研究。Fee[34]开发了一种将PEG修饰反应和分子筛色谱分离整合在一个操作单元中的PEG修饰新策略2体积排阻反应色谱(size2exclusion reaction chromatography,SERC)。将PEG修饰反应混合物注入体积排阻色谱柱中形成一个移动的反应区带,反应物和修饰产物在移动相中因分子大小差别被不断分离,形成不同的线性流速,修饰产物由于M r增大从反应区带中被选择性的分离,使得修饰产物的保留时间最小而首先达到色谱柱的下游部分,并实现异构分子的分离纯化。

2.6　计算机辅助的PEG修饰

由于蛋白种类多样和结构复杂,往往会使得PEG修饰反应特异性不强,反应条件要通过大量试验优化。如果能够利用计算机技术对蛋白质晶体结构表面性质进行理论计算和分析,确定可能的反应位点和基团,并根据被修饰基团与修饰剂的结构特点设计合适的连接物,这样不但可以减少PEG 修饰的盲目性,而且能够提高研究效率。胡远东等[35]利用InsightⅡ分子模拟软件包(Biosym Inc.,San Dieg o,C A)对牛血红蛋白晶体(bHb)进行了结构分析和分子模拟,计算了蛋白表面24个可进行PEG修饰的Lys残基及其主要原子的溶剂可及表面积,确定了其中可以进行修饰的13个Lys残基(溶剂可及表面积>0.4nm2),并进一步设计了具有双功能基团的小分子化合物环氧乙烷基活化PEG作为连接体。结果表明,PEG修饰的bHb的携氧能力和免疫原性等生物学指标均达到预期结果。

3　结　语

对于改善蛋白药物的临床作用时间和疗效,PEG修饰技术已被公认为最为有效的方法之一。自从20世纪70年代PEG修饰蛋白技术诞生以来,已有十余种PEG修饰的蛋白药物上市,表现出优良的临床效果。但仍有许多蛋白药物由于常规的多点修饰不能得到理想的效果,因此随着PEG修饰蛋白技术研究的不断深入,已从原来的多点随机修饰向定点单修饰发展,由复杂的多单元操作向便捷高效的集成操作发展,提高了修饰蛋白的生物活性,降低了PEG修饰的成本,扩大了PEG修饰技术的应用范围。正是由于蛋白药物类型众多,大小和性质各异,才出现了不同的PEG修饰技术,所以只有根据蛋白的不同性质综合考虑选择合适的PEG修饰技术才能起到良好的效果。PEG修饰技术是化学工程和生物工程的交叉技术,随着学科间的不断交融和促进,必将产生更多更有效的PEG修饰技术。

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蟾酥的应用研究

周　莹1,吉爱国1,2,宋淑亮2

(1.山东大学药学院,山东济南250012;2.山大威海国际生物技术研发中心,山东威海264209)

摘　要:蟾酥为我国传统中药,具有强心、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、抗炎等多种作用,临床应用广泛。此文对蟾酥的药理活性,剂型的发展状况和主要成分的测定方法进行综述。

关键词:蟾酥;药理;剂型;含量测定

中图分类号:R282.74;R285 文献标识码:A 文章编号:100521678(2009)0320203204

收稿日期:2008211205

作者简介:周莹(19832),女,辽宁凌源人,在读硕士研究生,从事

生化药物的研究;吉爱国(19562),男,通信作者,教授,博导,E2mail:

jiaiguo@https://www.360docs.net/doc/b313255452.html,。