狂犬病病毒的分子生物学及其保护性抗原的结构和功能

实验三伪狂犬病的诊断

实验三伪狂犬病的诊断一．实验目的： ⒈熟悉伪狂犬病的临诊特点。 ⒉熟悉伪狂犬病的诊断方法。二．实验原理：利用分离的伪狂犬病毒注射实验兔，病毒在动物机体繁殖一段时间后，会影响实验动物的神经系统，实验兔会出现强烈的痒觉，根据这些症状来判断是否含有伪狂犬病毒。三．内容及方法 1. 伪狂犬病的临床特点本病发生于牛、绵羊，犬、猫、鼠及猪。野生动物亦可发生。牛、绵羊、犬及猫感染本病后症状很特殊而明显。主要表现为某部皮肤的强烈痒觉。常使劲地于墙柱上摩擦，直到皮肤撕碎，仍不断摩擦，病畜像疯狂一样，用力制止亦无效果。体温可达40℃以上。常发病后48小时内死亡。成猪一般为隐性感染，怀孕母猪可发生流产、死胎、木乃伊胎儿。仔猪，尤于新生仔猪病情极严重，常可发生大批死亡。主要侵害神经系统，表现为神经症状。 2. 实验室诊断 2.1 病料的采集与处理分离病毒的材料于发热期最好采取中脑、桥脑及延脑，或采取病总部之水肿液、侵入部神经干及脊髓。病料用培养液制成1:10组织悬浮液。 2.2 兔体接种试验上述悬液经2000r/min离心1Omin，取上清液1~2ml经腹侧皮下或肌肉接种家兔，通常在36-48h后注射部位出现剧痒，病兔啃咬注射部位皮肤，皮肤脱毛、破皮和出血，继之四肢麻痹，体温下降，卧地不起，最后角弓反张，抽搐死亡。但这种症状只维持几小时，一般常于夜间死亡，可见死兔口内有接种部位咬下的被毛。亦可脑内接种小鼠，症状可维持12小时，但其敏感性不如兔。亦可用细胞培养来分离病毒。许多种哺乳动物细胞均能繁殖本病毒，但最常用的是猪肾传代细胞。 2.3 兔、猪及牛肾原代细胞培养。病料接种细胞后最早经18小时出现病变(病毒量大)，一般经48小时，病毒量很低时要到96小时。其典型的病变是出现巨细

狂犬病防治手册

狂犬病防治手册 1．为何要停止生产含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗？研究发现，含氢氧化铝佐剂的狂犬病疫苗较无佐剂狂犬病疫苗免疫人体后中和抗体的产生晚7天左右。狂犬病疫苗的暴露后免疫是一种应急使用，抗体的产生越早越好。因此，氢氧化铝佐剂对狂犬病的暴露后治疗十分不利。另据报道，使用了丹麦Statens血清研究所生产的氢氧化铝吸附的百白破疫苗，导致546例注射部位出现顽固性硬结性瘙痒的严重不良反应。其中77％的不良反应病例经皮肤试验确认为对氢氧化铝过敏。狂犬病疫苗中的的氢氧化铝佐剂同样可以导致不良反应增多。因此，2004年12月的人用狂犬病疫苗质量工作会议上，国家食品药品管理局已要求各生产企业在2005年6月30日前停止氢氧化铝佐剂人用狂犬病疫苗的生产。 2．为什么人用纯化狂犬病疫苗禁止臂部肌肉注射？因为臂部脂肪较多，疫苗注射后不易扩散，可能会影响免疫效果。因此，要求成人在上臂三角肌注射，儿童最好选择大腿前外侧区肌肉注射。 3．正在接种其它疫苗，是否可以注射狂犬病疫苗？正在接种其它疫苗，仍可注射狂犬病疫苗，但接种部位应远离前一种疫苗的接种部位。 4．使用疫苗的同时使用抗生素，会影响疫苗的效果？二者同时应用不会影响疫苗的效果。 5．年幼儿童注射疫苗为什么选择大腿前外侧？因为臂部肌肉脂肪较多，疫苗注射后不易扩散。上臂三角肌不发达，会影响疫苗的吸收。大腿前内侧因有大血管和神经经过，在此接种易发生危险。所以，年幼儿童应在大腿前外侧区肌肉注射，这里肌肉丰厚，易接种。

6．狂犬病病毒从感染至发病有哪些步骤？狂犬病病毒从感染到发病的步骤为：①病毒感染；②病毒在肌肉内复制；③病毒在神经肌肉结合处，与乙酰胆碱受体结合；④病毒通过快速轴突传递方式在周围神经的轴突内传播；⑤在脊髓的神经元与局部的周围感觉（背根）神经节内复制并快速上行到脑；⑥脑部神经元感染伴发神经功能障碍；⑦沿神经离心扩散到唾液腺、皮肤、角膜以及其他器官。 7．狂犬病病毒是如何与神经细胞相互作用的？狂犬病病毒与神经细胞的相互作用分四个阶段：①吸附：狂犬病病毒吸附于健康的神经细胞；②侵入：病毒被细胞吸入，进入细胞内；③复制：在细胞内，病毒迅速繁殖；④出芽：新的狂犬病病毒离开宿主细胞，吸附于其他神经细胞。然后，病毒从脑通过神经扩散到身体的其他器官。 8．狂犬病病毒的特性有哪些？狂犬病病毒是嗜神经性病毒，对神经组织有特殊亲和力。病毒不能穿透健康皮肤，主要通过损伤皮肤和粘膜入侵，少数由呼吸道吸入感染。病毒侵入后，沿传入神经到达中枢神经，侵害中枢神经细胞，然后再由中枢沿传出神经侵入各脏器组织，如唾液腺、眼、舌、皮肤、心脏等。因唾液腺最适狂犬病病毒繁殖，故唾液中含病毒最多，早在症状出现前14天即有病毒出现。因此唾液为主要传染源，既可通过舔咬感染人和畜，又可通过流涎污染环境，引起吸入性感染。 9．狂犬病的病原体是什么？狂犬病的病原体是弹状病毒科狂犬病病毒属的狂犬病病毒。整个病毒由最外层的脂质双分子层外膜、结构蛋白外壳和负载遗传信息的RNA分子构成。 10．曾经注射过狂犬疫苗的人又被犬咬伤还用再打针吗？全程接种符合效价标准的疫苗后1年内再次被动物致伤者，应于0和3天各接种一剂疫苗；在1-3年内再次被动物致伤，且已进行过上述处置者，应于0、3、7天各接种一剂疫苗；超过3年者应接种全程疫苗。此外，对暴露前后所用的疫苗效价无法证实者及免疫回忆应答无法确认者仍应进行全程免疫。

伪狂犬病检测方法

十一、伪狂犬病检测方法伪狂犬病病毒分离鉴定 1 材料准备 DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青霉素、链霉素溶液、0.22ul 微孔滤膜、细胞培养瓶、CO2培养箱、倒置显微镜。溶液配制见附录A(标准的附录) 2 操作步骤 2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾及其脑组织，尤其是三叉神经节、嗅球，4℃送实验室检测。 2.2样品处理待检组织在灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃砂研磨，用灭菌生理盐水或DME培养基制成1：5乳剂，—70℃反复冻融后，经3000rpm离心30分钟后，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至最终浓度为100U/mL，—70℃保存作为接种材料。 2.3 病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，37℃恒温箱中吸附1小时后，加入含10%新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30分钟，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，置37℃温箱中培养。 2.4观察结果接种后24—48小时，BHK-21细胞应出现典型的细胞病变效应（Cyto pathogenic effect, CPE），表现为细胞变圆，脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无CPE，则判为伪狂犬病病毒阴性。 2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用聚合酶链式反应、荧光抗体试验等两种方法中任一方法作进一步鉴定。伪狂犬病聚合酶链式反应 1 材料准备:待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K，十二烷基磺酸钠（SDS），苯酚、氯仿，异戊醇（分析纯）、TEN缓冲液。溶液配制见附录C(标准的附录) 引物：扩增伪狂犬病病毒基因中434—651bp之间217bp基因片段，由上海生物工程公司合成。序列为，上游引物P1：5’-CAGGAGGACGAGCTGGGGCT-3’，下游引物P2：5’-GTCCACGCCC-CGCTTGAAGCT-3 仪器设备有：凝胶电泳紫外线检测仪，PCR扩增仪，电泳仪 2操作步骤： 2．1 样品的采集：对于病死或扑杀动物，取脑组织；对于待检活猪，用已灭菌的棉签，伸入猪鼻腔中，采取鼻粘液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测。2.2样品处理所采病料经组织研磨器充分研磨，按1:5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃反复冻融3次，7000r/min离心5min，如样品为鼻试子，则加入2ml TEN缓冲液，充分挤压，取出棉签，7000rpm，离心5分钟，取上清液。取上清液472.5μl,加入25μl 10％SDS和2.5μl的20mg/ml 蛋白酶K，50℃水浴摇床上放置2h后加入等量的饱和酚500μl，涡旋20s。离心取上清液，加等量的酚：氯仿：异戍醇（25:24:1）抽提一次，再用氯仿：异戍醇（24：1）抽提一次，最后用乙醇沉淀，真空抽干后加入20μl双蒸水溶解，-20℃贮存备用。

狂犬病病毒实验室检测方法

狂犬病病毒实验室检测方法摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量 RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎 100%。据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过 5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。 1、狂犬病病毒形态特征 RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因 1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白

猪伪狂犬病的预防与用药

猪伪狂犬病的预防与用药 -----本文由深圳安多福整理最近，河南的一养殖户，使用成都天邦的疫苗，却死了3000多头母猪。是成都天邦的伪狂犬疫苗有问题,还是母猪已经感染了强毒或是母猪在注射后被蓝耳病和其他病致死的？相信不久，真相就会揭晓。那么猪伪狂犬是怎么样的一种病，发病有哪些症状，怎么样去预防和治疗呢？（一）综述猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起家畜和野生动物的一种急性传染病。特征为成年猪呈隐性感染或有上呼吸道卡他性症状；妊娠母猪发生流产死胎；哺乳仔猪出现脑脊髓炎（神经症状）和败血症状（发热），最后死亡。没有明显的季节性，但以寒冷的冬季发病较多。本病主要通过与病猪和带毒猪接触，经呼吸道、消化道、损伤的皮肤感染，也可通过配种、哺乳感染，妊娠母猪感染后，可感染胎儿。（二）症状本病潜伏期3～11天。临床症状随猪年龄不同而有很大差异。妊娠母猪常发生流产，产出的弱胎通常在3～4天死亡，流产率可达50%；适龄母猪表现为不育症，返情率高，但屡配不孕。成年猪一般为隐性感染，即使有症状也是轻微的，只表现为一般性发热，精神沉郁，有的有呕吐、咳嗽、一般4～8天恢复；可引起新生仔猪大量死

亡，主要表现为刚生下的仔猪第一天无异常，常从第二天开始发病，3～5天内达到死亡高峰，表现明显的神经症状，病猪昏睡、鸣叫、呕吐、拉稀、流涎、发抖、痉挛，有时不自主地前冲、后退或转圈运动；随着病情的发展，发现四肢麻痹，倒地侧卧，头向后仰，四肢乱动或划水样运动，最后昏迷死亡；可引起断奶仔猪发病死亡，发病率在20%～40%，死亡率在40%～60%，主要症状表现为神经症状，拉稀，呕吐等。（三）病理变化剖检主要表现为脑膜充血，水肿、出血，脑脊液增多，淋巴结肿大，胃肠黏膜可见卡他性炎症，胃底部有明显出血区，上呼吸道黏膜及扁桃体出血，水肿，并有纤维素性坏死性伪膜覆盖。有的肾脏布满针尖样出血点，有的出现肺水肿。肝肾有特征性坏死灶，中央灰白色，外周有红色晕圈，具有诊断意义。流产胎儿的肝、脾及胎盘绒毛膜有凝固性坏死。（四）防治 1、种猪每6个月背颈皮下注射伪狂犬病基因缺失油佐剂苗3毫升，母猪在产前1个月左右加强免疫一次；种用仔猪28～35日龄注射一次1.5毫升，4～6周重复注射一次，育肥仔猪30日龄注射1.5毫升。 2、严格执行消毒措施。猪舍地面、墙壁、设施及用具等每周定期消毒1次，粪便放发酵地或沼气池处理。发生疫情时则2～3天消毒1次，消毒液可用安多福万金水按1：500稀释。

狂犬病毒的作用原理

狂犬病毒的作用原理？是对人的神经起作用还是？狂犬病（rabies）又称恐水症（hydrophobia），为狂犬病病毒引起的一种人畜共患的中枢神经系统急性传染病。多见于狗、狼、猫等食肉动物。人多因被病兽咬伤而感染。临床表现为特有的狂躁、恐惧不安、怕风恐水、流涎和咽肌痉挛，终至发生瘫痪而危及生命。 [病原学] 狂犬病病毒属核糖核酸型弹状病毒。狂犬病毒具有两种主要抗原。一种为病毒外膜上的糖蛋白抗原，能与乙酰胆碱受体结合使病毒具有神经毒性，并使体内产生中和抗体及血凝抑制抗体。中和抗体具有保护作用。另一种为内层的核蛋白抗原，可使体内产生补体结合抗体和沉淀素，无保护作用。从患者和病兽体内所分离的病毒，称自然病毒或街毒（stree virus），其特点是毒力强，但经多次通过兔脑后成为因定毒（fixed virus），毒力降低，可制做疫苗。狂犬病毒易被紫外线、甲醛、50～70%乙醇、升汞和季胺类化合物（新洁尔灭）等灭活。其悬液经56℃30～60分钟或100℃2分钟即失去活力，对酚有高度抵抗力。在冰冻干燥下可保存数年。 [流行病学] 狂犬病在世界很多国家均有发生。我国解放后由于采取各种预防措施，发病率明显下降。近年因养狗逐渐增多，故发病率有上升的趋势。（一）传染源发展中国家的狂犬病主要传染源是病犬，人狂犬病由病犬传播者约占80～90%，其次为猫和狼，发达国家由于狗狂犬病被控制，野生动物如狐猩、食血蝙蝠、臭鼬和浣熊等逐渐成为重要传染源。患病动物唾液中含有多量的病毒，于发病前数日即具有传染性。隐性感染的犬、猫等兽类亦有传染性。（二）传播途径主要通过被患病动物咬伤、抓伤，病毒自皮肤损伤处进入人体。粘膜也是病毒的重要侵入门户，如眼结合膜被病兽唾液沾污，肛门粘膜被狗触舔等，均可引起发病。此外，亦有经呼吸道及消化道感染的报道。（三）传播途径人对狂犬病普遍易感，兽医、动物饲养者与猎手尤易遭感染。一般男性多于女性。冬季发病率低于其他季节。 [发病机理与病理变化] 狂犬病病毒对神经组织有很强的亲和力。发病原理分为三个阶段：①局部组织内小量繁殖期。病毒自咬伤部位入侵后，在伤口附近横纹细胞内缓慢繁殖，约4～6日内侵入周围神经，此时病人无任何自觉症状。②从周围神经侵入中枢神经期。病毒沿周围传入神经迅速上行到达背根神经节后，大量繁殖，然后侵入脊髓和中枢神经系统，主要侵犯脑干及小脑等处的神经元。但亦可在扩散过程中终止于某部位，形成特殊的临床表现。③向各器官扩散期。病毒自中枢神经系统再沿传出神经侵入各组织与器官，如眼、舌、唾液腺、皮肤、心脏、肾上腺髓质等。由于迷走神经核、舌咽神经核和舌下神经核受损，可以发生呼吸肌、吞咽肌痉挛。临床上出现恐水、呼吸困难、吞咽困难等症状。交感神经受刺激，使唾液分泌和出汗增多。迷走神经节、交感神经节和心脏神经节受损时，可发生心血管系统功能紊乱或猝死。

【CN110042087A】一种重组狂犬病病毒rHEP△GEGFP及其应用【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910206785.0 (22)申请日 2019.03.19 (71)申请人华南农业大学地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483号 (72)发明人罗永文　毕水莲　梁嘉琪　曾小玲　龙家慧　潘雨晴　郭霄峰　 (74)专利代理机构广东广信君达律师事务所 44329 代理人杨晓松 (51)Int.Cl. C12N 7/01(2006.01) C12N 15/65(2006.01) G01N 33/569(2006.01) (54)发明名称一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP及其应用(57)摘要本发明涉及抗体检测技术领域，尤其涉及一种重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP及其应用。所述重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性：a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白；b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白；c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。利用该重组狂犬病病毒rHEP -△G -EGFP建立的狂犬病病毒中和抗体水平检测方法具备以下优点：一、该病毒不能在细胞和活体中传代繁殖，因此更安全；二、该检测方法以直接荧光显微镜下观察，更加经济便捷；三、该检测方法的测定结果相对于利用弱毒株的方法更加可靠。权利要求书1页说明书8页序列表1页附图4页CN 110042087 A 2019.07.23 C N 110042087 A

权　利　要　求　书1/1页CN 110042087 A 1.一种重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP，其特征在于，所述重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP为糖蛋白基因缺失型重组毒株，所述糖蛋白基因缺失型重组毒株具有如下特性： a)含有细胞来源的标准强毒株糖蛋白； b)能够感染细胞且在细胞中表达绿色荧光蛋白； c)无法在细胞和动物体中自我复制和扩散。 2.一种制备重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP的方法，其特征在于，利用基因工程技术在稳定表达狂犬病病毒CVS-11毒株糖蛋白的BHK-21细胞上构建并拯救出一种将糖蛋白基因替换成绿色荧光蛋白基因的狂犬病病毒重组毒株。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：筛选稳定表达CVS-11糖蛋白的BHK-21细胞系； S2：构建重组质粒pHEP-△G-EGFP； S3：拯救及筛选重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2包括： S21：PCR扩增EGFP和载体pHEP-△G(缺失糖蛋白基因)片段； S22：将质粒进行无缝连接，将连接产物转化至感受态细胞后进行筛选得到阳性克隆菌； S23：提取阳性克隆菌的质粒后进行鉴定。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述S21包括： S211：以质粒pEGFP-N1为模板，利用引物EGFP-F和引物EGFP-R进行PCR扩增，所述引物EGFP-F和引物EGFP-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和SEQ NO：2所示； S212：以质粒pHEP-3.0为模板，利用引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R进行PCR扩增；所述引物pHEP-△G-F和引物pHEP-△G-R的核苷酸序列分别如SEQ NO：3和SEQ NO：4所示。 6.根据权利要求2-5所述的方法得到的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。 7.根据权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP在检测抗体水平中的应用。 8.一种利用权利要求1或者6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP检测血清中的中和抗体水平的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将待测血清进行灭活处理； S2：加入重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP进行孵育中和反应； S3：加入BHK-21细胞悬液，培养24-48小时后直接在荧光显微镜下观察统计。 9.根据权利要求8所述的方法在评价疫苗免疫效果中的应用。 10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或6所述的重组狂犬病病毒rHEP-△G-EGFP。 2

狂犬病题目及答案完整版

狂犬病题目及答案标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]

A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3.狂犬病标本采集叙述正确的是（） A.从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B.在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C.用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D.A＋B＋C E.B＋C. 4.狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5.暴露前的免疫程序是（） A. 0、7、21 天各 1 剂的程序 B. 0、3、7、14 和28天各接种 1 剂 C. 0天两剂，7、21 天各1剂的程序 D.直接注射免疫球蛋白 6.狂犬病临床表现有：（） A.有怕水、怕光、怕声的“三怕”症状

猪伪狂犬病净化方案

猪伪狂犬病净化方案（见农业部《伪狂犬病防治技术规范》）我国种猪场伪狂犬病净化方案内容由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。种猪场根据本场实际情况，分阶段逐步实施。一、材料准备疫苗：使用国家批准的基因缺失疫苗。抗体检测试剂盒：检测伪狂犬病全病毒抗体或gB抗体试剂盒、区分免疫猪和感染猪的抗体鉴别检测试剂盒。试剂盒必须获得国家相关批准文号。待净化猪群的确定：应选择健康、生产成绩稳定的种猪群开展伪狂犬病的净化。在初次开展本病净化的大型种猪场中，可先选定500-1000头母猪群开展净化，逐步推进。二、净化方案 1、调查阶段如果种猪群母猪大于500头，按照种母猪群数量的10%、种公猪全群采血。分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群（种母猪和种公猪）伪狂犬病野毒感染状态。如果母猪数量小于500头，可一次采集全部种猪的样品，检测gE抗体，根据检测结果，确定进入何种净化阶段。 1.1如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段； 1.2如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.3如果gE抗体阳性率在10%-20%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案； 1.4如果gE抗体阳性率大于30%，则实行“全群或部分清群”措施，暂不考

虑实施净化； 1.5在全部种猪群gE抗体阴性时，可直接进入“监测与认证维持”阶段。 2.强化免疫控制阶段使用伪狂犬病gE基因缺失疫苗免疫该猪群，同时采取生物安全和灭鼠等综合措施，达到控制的目的。 2.1免疫程序的制定 2.1.1种母猪（种公猪）每年普免3-4次。或者母猪配种前和产前4周分别免疫一次。普免时，避免在分娩前7天内接种疫苗，以减少接种应激对分娩的影响，但可于母猪分娩后补免。公猪每年3次免疫，采用集中普免的方式。 2.1.2仔猪分别测定仔猪在50日龄、60日龄和70日龄时的伪狂犬病抗体（gB抗体或全病毒抗体），每个阶段抽样30份，样品来自10窝猪，每窝3头，确保采样的均衡性。根据抗体水平确定仔猪的免疫日龄。猪场可根据产房小猪和保育猪是否出现伪狂犬病(如腹泻、神经症状等)，使用出生猪滴鼻免疫的方式，克服母源抗体干扰，并以提高局部的黏膜免疫力。 2.2实验室评估仔猪免疫后3周，检测30份血清gB或全病毒抗体和gE抗体。当gE抗体阴性时，如果85%的样品为gB抗体或全病毒抗体阳性，即可认为群体免疫合格。 2.3 临床评估主要考察猪群的生长成绩。母猪无繁殖障碍，哺乳仔猪无尖叫、腹泻和转圈，最后死亡等现象；保育猪无神经症状，育肥猪无伪狂犬病病毒引起的呼吸道症状。 2.4配套的生物安全措施 2.4.1如需引种，只能引进伪狂犬病gE抗体阴性的后备种猪； 2.4.2对进出猪场的车辆和外来人员进行消毒； 2.4.3无害化处理病死猪和流产死胎等； 2.4.4定期灭鼠。 3、检测淘汰阶段

狂犬病毒生物信息学分析

课程论文题目：狂犬病毒ABLV编码核蛋白（N）的生物信息学分析课程名称：生物信息学姓名：秦鸽鸽学号：Y132140504 学院：生命科学与工程学院专业：基础兽医学

狂犬病毒ABLV编码核蛋白（N）的生物信息学分析摘要：狂犬病病毒（rabies virus，ＲＶ）是引起中枢神经系统感染的急性人畜共患传染病。狂犬病病毒基因组是由单股负链、不分节段的RNA组成。基因组编码病毒的核蛋白（N）、磷酸化蛋白（NS）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和依赖RNA 的RNA 多聚酶（L）5 个主要结构蛋白。N蛋白是组成病毒粒子的主要核蛋白，是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分，常用于狂犬病病毒的诊断、分类和流行病学研究。本文就核蛋白（N）的理化性质、蛋白质结构、系统进化关系等进行了预测和分析，预测结果表明核蛋白的一级结构稳定，为亲水性蛋白，有两个跨膜区，ABLV病毒与其它6个基因型的病毒亲缘关系较其他病毒近，但之间又有明显的距离。关键字狂犬病毒；核蛋白；理化性质；蛋白质结构预测；系统进化分析狂犬病病毒在野生动物（狼、狐狸、鼬鼠、蝙蝠等）及家养动物（狗、猫、牛等）与人之间构成狂犬病的传播环节。人主要被病兽或带毒动物咬伤后感染。一旦受染，如不及时采取有效防治措施，可导致严重的中枢神经系统急性传染病，病死率高。狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，ＲＶ）引起的中枢神经系统感染的急性人畜共患传染病。所有温血动物都可感染，狂犬病一旦发病，病死率几乎100％［1］，是人类病死率最高的急性传染病之一。该病流行于100 多个国家和地区, 中国的狂犬病发病率占世界第二位, 仅次于印度[2]。狂犬病病毒基因组是由11 928 或11 932 个核苷酸组成的单股负链、不分节段的RNA，分子量约4.6×106。基因组从3′端至5′端的排列依次为N、NS、M、G、L 5 个结构基因，各基因的序列长度分别为1 421、991/804/805、1

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白 Ξ 罗廷荣1　源宣之2　金城俊夫2(1　广西大学动物科技学院,南宁530005;2　日本岐阜大学农学部兽医公共卫生学研究室) 摘要　本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖(G )蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL 株G 蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9细胞中,分离出2个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA )从重组杆状病毒感染的Sf 9细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf 9细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL 株感染NA 细胞的G 蛋白的分子量一致。35个抗RC HL 株G 蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9细胞反应,表明表达的G 蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G 蛋白主要分布在Sf 9细胞的膜表面,形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL 株感染的NA 细胞的荧光相同。关键词　狂犬病病毒;糖蛋白;重组杆状病毒中图分类号　S 852165911;S 8521655 Expression of Glycoprote i n of Rab ies V irus Usi ng Baculov irus Vector L uo T ingrong 1　M inam o to N obuyuk i 2　K in jo To sh i o 2(1　Co llege of A n i m al Sciences and T echno logy ,Guangx i U n iv .,N ann ing 530005 2D ep artm en t of V eterinary Pub lic H ealth ,Facu lty of A gricu ltu re ,Gifu U n iversity ,Japan )Abstract In th is exp eri m en t w e have successfu lly exp ressed rab ies vivu s glycop ro tein (G p ro tein )u sing bacu loviru s vecto r .Tw o clones of recom b inan t bacu loviru s w ere iso lated from Sf 9cells ,in w h ich w as tran sfeted w ith DNA of w ild typ e bacu loviru s and bacu loviru s tran sfer vecto r in 2serted G p ro tein gene of RC HL strain u sed fo r p roducti on of an i m als rab ies vaccine in Japan .B y u s 2ing w estern b lo t and indirect i m m unofluo rescen t assay (IFA ),the G p ro tein of rab ies viru s w as detect 2ed from Sf 9cells w h ich w ere infected w ith recom b inan t bacu loviru s .T he G p ro tein in Sf 9cells ex 2p ressed by recom b inan t bacu loviru s show ed iden tical m o lecu lar w eigh t w ith that in NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies vru s .T h irty five m onoclonal an tibodies (M A b s )again st G p ro tein of RC HL strain reacted w ith G p ro tein on the Sf 9cells infected w ith recom b inan t bacu loviru s ,indi 2 cating that an tigen ic variati on of the exp ressed G p ro tein has no t been found .M ajo rity of the exp ressed G p ro tein ex ists on the su rface of Sf 9cells ,fluo rescence of the Sf 9cells fo r m ed a ring like w hen it infected w ith recom b inan t bacu loviru s and w as dyed by IFA .T h is k ind of fluo rescence on the Sf 9cells w as the sam e as that on NA cells infected w ith RC HL strain of rab ies viru s u sing IFA . Key works rab ies viru s ;G p ro tein ;recom b inan t bacu loviru s 狂犬病毒的糖(G )蛋白有多种功能:刺激中和抗体的产生而诱导免疫保护、细胞融合性、与细胞表面受体结合、血球凝集和免疫溶解。近年来,根据不同的目的,狂犬病毒的G 蛋白基因已在不同的载体系统被表达,其中包括大肠杆菌系统、酵母系统、禽痘病毒和牛痘病毒载体系统。引人注目的是,第18卷　第4期V o l 118N o 14广西农业生物科学Journal of Guangxi A gric .and B i o l .Science 1999年12月　D ec .1999　 Ξ第一作者:男,1962年生,博士,副教授。收稿日期:19990402

国内伪狂犬病的流行现状和危害

国内伪狂犬病的流行现状和危害核心提示：伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。伪狂犬病（Pseudorabies）是当前我国猪场一种非常重要的病毒性疾病，给感染猪场造成严重的经济损失，引起种猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状及高死亡率，同时也是猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的重要原发性病原，伪狂犬病与蓝耳病和猪瘟等病毒性感染在猪群的持续存在也是猪病复杂的重要原因，同时给我国养猪业造成严重的损失，对种猪场，除了经济损失外，伪狂犬野毒阳性对于品牌和贸易同样带来较大的负面影响，严重影响猪肉出口和种猪的销售。海博莱实验室近年来对我国规模猪场猪伪狂犬感染现状进行了系统的监测与分析。2006年监测中国部分省市规模化猪场伪狂犬野毒感染率的结果显示（本报告发表于《猪业科学》2007年第11期），约有超过一半的（52%）的规模猪场伪狂犬野毒阳性。样品阳性率为16.9%。全国种猪感染率为18.2%，阳性场种猪的感染率为33%。在2007年所检测的131个规模化猪场中，81个猪场为伪狂犬野毒阳性，猪场阳性率63.4%，在7445份血清中，总样品阳性率为14.8%。2007年所检测的所有猪场3620份种猪样品中，18.2%的种猪为野毒抗体阳性，伪狂犬阳性场中，阳性种猪比例为27.2%（本报告发表于《猪业科学》2008年第10期）。

狂犬病题目及答案

狂犬病暴露处置技术培训试题姓名：单位：分数：一.填空题（每题4分，共20分） 1. 狂犬病是由感染人体引起的一种传染病，发病后病死率达。 2. 狂犬病病毒是一种侵犯中枢神经系统,引起____ 和____ 狂犬病的病原体. 3. 人被犬、猫等宿主动物咬、抓伤后，凡不能确定伤人动物为健康动物的，应立即进行受伤部位的彻底清洗和消毒处理。用或彻底冲洗伤口至少分钟。彻底冲洗后用涂擦伤口。 4. 狂犬疫苗接种程序为：、、、、天各注射一支狂犬疫苗，成人、儿童用量。婴幼儿可在大腿前外侧肌肉内注射。禁止注射。对于Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露，接种疫苗的同时要在伤口周围浸润注射或。二．单选题（每题5分，共50分） 1. 关于狂犬病病毒不正确的描述是（） A. 狂犬病毒为弹状病毒科 B. 狂犬病毒是非嗜神经性病毒 C.不会引起化脓性脑炎 D. 在中枢神经细胞胞浆内形成内基小体(Negri Bodies) E.病毒对外界抵抗力不强,56℃30分钟即可杀灭 2. Ⅲ类暴露及免疫功能低下者Ⅱ类以上的暴露,最正确的处理措施是（） A.注射狂犬病毒免疫血清＋抗病毒药物 B.注射大剂量丙种球蛋白＋抗病毒药物 C.清创＋抗生素 D.清创＋注射狂犬病被动免疫制剂＋接种疫苗 E.清创＋注射狂犬病毒免疫血清 3. 狂犬病标本采集叙述正确的是（） A. 从事标本采集和运送的工作人员均要进行暴露前免疫 B. 在狂犬病病人入院后，尽可能早期采集标本 C. 用于病原学检测的标本，以脑组织阳性率最高 D. A＋B＋C E. B＋C. 4. 狂犬病病毒最不可能感染的动物是（） A.狗 B.猫 C.蝙蝠 D.家禽 5. 暴露前的免疫程序是（） A. 0、7、21 天各 1 剂的程序 B.0、3、7、14 和28天各接种 1 剂 C. 0天两剂，7、21 天各1剂的程序 D.直接注射免疫球蛋白 6. 狂犬病临床表现有：（）

狂犬病概述

1、什么是狂犬病？狂犬病（Rabies）又称恐水症，是由狂犬病病毒（Rabies virus）导致的人兽共患急性传染病。狂犬病主要影响中枢神经系统，人患病后的特征性临床表现为恐水、恐风、畏光、吞咽困难、狂躁等，最后死于呼吸、循环和全身衰竭。人一旦发病，目前尚没有有效的临床治疗方法，几乎100%死亡，病死率是所有传染病中最高的。狂犬病在我国属于乙类法定报告传染病。要强调的是，狂犬病是一种完全可以预防的致死性疾病。 2、什么动物可以传播狂犬病? 几乎所有的哺乳动物都对狂犬病病毒易感，但并非所有的哺乳动物对人都有相同的传播狂犬病的风险。目前认为，只有狂犬病病毒的储存宿主对人狂犬病的发生有意义。《狂犬病预防控制技术指南(2016版)》中指出狂犬病储存宿主动物主要为犬科、猫科及翼手目动物，禽类、鱼类、昆虫、蜥蜴、龟和蛇等不感染、不传播狂犬病病毒。 3、老鼠、兔子咬伤会传播狂犬病吗? 老鼠和兔子作为哺乳动物可以感染狂犬病，但其作为人狂犬病传染源的意义不大。《狂犬病预防控制技术指南(2016版)》中指出，对北美洲和欧洲狂犬病流行地区的野生和家栖啮齿类动物的大规模监测显示，此类动物并非狂犬病的储存宿主，也不参与该疾病的流行和传播；此外，兔形目(包括家兔和野兔)极少感染狂犬病，也未发现此类动物导致人间狂犬病的证据。因此对于几乎不与其它动物接触的宠物鼠或兔以及实验室动物，其感染狂犬病病毒的风险极低，若被其致伤可以不用进行狂犬病暴露后处置。 4、人与人接触能传播狂犬病吗? 通常情况下，人不携带狂犬病病毒，被非狂犬病病人咬伤不会感染狂犬病。狂犬病病人的体液和组织中能检出活病毒，因此理论上确实存在与病人接触而感染狂犬病的风险，因此建议高危人群在接触狂犬病病人分泌物或体液后仍建议进行暴露后免疫，包括医务人员、病人的家属和朋友等。 5、能检查是否感染了狂犬病病毒吗? 狂犬病病毒为噬神经性病毒，侵入人体后进入神经系统，目前潜伏期无有效的临床检测手段。出现临床症状后，可以通过唾液、血清、脑脊液等体液，或含毛囊的皮肤等标本进行实验室诊断。 6、什么是狂犬病暴露狂犬病暴露是指被狂犬、疑似狂犬或者不能确定是否患有狂犬病的宿主动物咬伤、抓伤、舔舐粘膜或者破损皮肤处，或者开放性伤口、粘膜接触可能含有狂犬病病毒的唾液或者组织。罕见情况下，器官移植和气溶胶吸入也可作为暴露途径而感染狂犬病病毒。 1、伤口冲洗用肥皂水(或其他弱碱性清洗剂) 和一定压力的流动清水交替清洗咬伤和抓伤的每处伤口至少15分钟。如条件允许，建议使用狂犬病专业清洗设备和专用清洗剂对伤口内部进行冲洗。最后用生理盐水冲洗伤口，以避免肥皂液或其他清洗剂残留。 2、消毒处理彻底冲洗后用稀碘伏(0．025％～0．05％)、苯扎氯铵(0．005％～0．01％)或其他具有病毒灭活效力的皮肤黏膜消毒剂消毒涂擦或消毒伤口内部。 3、外科处置：（1）在伤口清洗、消毒，使用狂犬病被动免疫制剂充分浸润后，根据情况进行后续外科处置。（2）外科处置要考虑致伤动物种类、部位、伤口类型、伤者基础健康状况等诸多因素。

猪伪狂犬野毒检测(PRV-gE)

猪伪狂犬病病毒gpI抗体检测自备材料 1. 50、100μl 精确微量移液器或连续移液器。 2. 一次性移液器吸头。 3. 配制洗涤液的500ml 量筒。 4. 96 孔板酶标仪。 5. 稀释样品的玻璃或塑料管。 6. 蒸馏水或去离子水。 7. 滴加和吸去洗涤液的装置。使用注意事项 1. 处理所有的PRV 材料以免PRV 的传播。抗原包被微孔板虽然经过化学处理，仍可能成为PRV 的传染源。 2. 勿用口移液。 3. 使用样品和试剂盒的场所不要吸烟、喝水和吃东西。 4. TMB 底物和终止液对皮肤有刺激性。 5. 试剂盒的某些成分含有防腐剂叠氮钠。处理时需要用大量的水冲洗以免形成叠氮化铜或叠氮化铅，它们在受压时可以爆炸。注意防止该成分对酶标抗PRV gpI 抗体的污染。 6. TMB 不要暴露于强光和任何氧化剂。使用洁净的玻璃或塑料容器盛装TMB 底物液。 7. 所有的试剂应在2－7℃储存。使用前恢复到室温，使用后放回2－7℃。 8. 所有的废弃液应在丢弃前合理处理以免污染环境。 9. 注意防止试剂盒成分的污染。 10.不要使用超过有效期限的试剂，不同批次试剂盒的成分不要混用。 11.严格遵守这些条款可以获得理想的结果。操作过程中的移液、时间和洗涤必须精确。样品的制备用样品稀释液将被检样品稀释2 倍 (1:2)。取每个样品后都要更换吸头，准确记录每个样品在板上的位置。每个样品应在滴加到PRV 包被板前应混匀。洗涤液的制备浓缩洗涤液应在使用前恢复至室温并使沉淀的盐溶解。使用前浓缩洗涤液应用蒸馏水或去离子水10 倍稀释（例如：每块板用30ml 浓缩液加上270ml水）。操作步骤使用前所有试剂应恢复至室温。试剂应轻轻旋转或震荡予以混合。 1.取出抗原包被板，在记录表上记录样品的位置。 2.在A1，A2 和A3 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阴性对照。 3.在A4，A5 孔内加入100μl 两倍稀释(1:2)的阳性对照。 4.在其余的孔内分别加入100μl 已稀释好的被检样品。 5.室温下孵育1 小时或2－8℃孵育过夜(可以将微量反应板用封条封闭)。 6.用大约300μl 洗涤液洗涤板孔，重复3－5 次。每次洗涤时洗涤液都应吸出丢弃。在洗板和加入标记物之间应避免包被板变干。在最后一次洗涤液吸出后，将板中残留洗涤液扣拍到吸水材料上。 7.每孔加入100μl 辣根过氧化物酶标记抗PRV gpI 抗体。 8.室温下孵育20 分钟。

狂犬病毒研究进展

狂犬病毒研究进展摘要：狂犬病病毒（RV）是一种能引起人和动物高度致死性疾病的嗜神经病毒，在分类学上属于单分子负链RNA病毒目、弹状病毒科、狂犬病毒属。本文主要对狂犬病毒的结构、传染途径、繁殖过程、狂犬病的发病机制、影响因素、疫苗研究进展进行简要阐述。关键词：狂犬病、狂犬病毒正文：狂犬病是由狂犬病毒(Rabiesvirus,RV)引起的,以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁等临床表现为特征的致死性中枢神经系统感染疾病,一旦发病,病死率几乎达100%,是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。随着分子生物学等相关学科的快速发展,RV的分子结构、基因分型、临床诊断、新型RV的发现、演变进化,以及病毒的毒力及其致病性等研究取得了很大成就。本文就近年来RV的研究进展作一综述。一、狂犬病毒的结构（1）、病毒的基因组结构： RV为单股不分节段的负链RNA病毒,病毒基因组由11928--11932个核昔酸组成,由3’端至5’端依次排列着N、P、M、G和L 5个RV的结构基因,其长度分别为1424、991、805、1675、6475个核昔酸,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(Por NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L)。（2）、病毒的蛋白质结构：完整的RV粒子由病毒核衣壳及包膜两部分构成,核衣壳由RNA与核蛋白（N）、磷蛋白(Por NS)和转录酶大蛋白（L）3种蛋白构成,而包膜由糖蛋白（G）和基质蛋白（M）构成。 ①核蛋白（N）全长450个氨基酸,是构成成熟病毒粒子核衣壳螺旋对称结构的主要成分。 ②磷蛋白(Por NS)含有292个氨基酸,它与转录酶大蛋白结合,构成完整的病毒RNA聚合酶复合体。磷蛋白还与核蛋白相互作用,实现对病毒的转录、复制的多功能调节。 ③转录酶大蛋白（L）是RV中最大的结构蛋白,全长2142个氨基酸,在RV的转录与复制中起催化作用。 ④糖蛋白（G）是一种跨膜蛋白,构成病毒表面的突起,是Rv与细胞受体结合的配体。成熟的糖蛋白有505个氨基酸残基,分为膜外区、跨膜区、膜内区三部分。不同毒株的糖蛋白糖基化位点数目和位置不全相同,但319位糖基化位点存在于已知的所有RV中。 ⑤基质蛋白（M）由202个氨基酸残基构成,该蛋白在病毒的装配及细胞表面的芽生过程中起作用,其PPxY(PPPY)基序是负责晚期出芽的结构域。此外,基质蛋白能抑制mRNA的转录,在抑制转录的过程中还伴随着复制产物的增加,基质蛋白对RNA转录与复制的平衡调节或许代表了不分节段单股负链RNA病毒的共性机制。二、狂犬病毒的传染途径狂犬病传染源主要是病犬（80%～90%），其次是猫和狼，野生动物也可作为狂犬病毒的贮主。野生啮齿动物如野鼠、松鼠、鼬鼠等对本病易感，在一定条件下它们