AO EB染色的讨论

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色

AO / EB原理与流程

zhongyisheng:

1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。

2 AO/EB染色及观察结果：取20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。ym1051: 1.能否提供具体实验步骤?

2.您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng:

1 用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP管吹打即可。

2 消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。

ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗?

zhongyisheng:的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。

医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享：

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。

2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。

（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS 中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显微镜下观察。）

fffwu:请问:请评价AO/EB法观察细胞凋亡的方法! 哪里有相关图片!

jmtang:尤其第一篇文献！

1、Critical evaluation of techniques to detect and measure cell death –study in a model of UV

radiation of the leukaemic cell line HL60

Marina Leite A1, Margarida Quinta-Costa A1, Pedro Simas Leite A1, José Eduardo Guimar?es A1

A1 IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, Portugal

Abstract:

The reliability of eight distinct methods (Giemsa staining, trypan blue exclusion, acridine orange/ethidium bromide (AO/EB double staining for fluorescence microscopy and flow cytometry, propidium iodide (PI) staining, annexin V assay, TUNEL assay and DNA ladder) for detection and quantification of cell death (apoptosis and necrosis) was evaluated and compared. Each of these methods detects different morphological or biochemical features of these two processes. The comparative analysis of the 8 techniques revealed that AO/EB (read in fluorescence microscopy) provides a reliable method to measure cells in different compartments (or pathways) of cell death though it is very time consuming. PI staining and TUNEL assay were also sensitive in detecting very early signs of apoptosis, but do not allow precise quantification of apoptotic cells. These three methods were concordant in relation to induction of apoptosis and necrosis in HL60 cells with the various UV irradiation time periods tested. Both AO/EB (read by flow cytometry) and annexin V-FITC/PI failed to detect the same number of early apoptotic cells as the other three methods. Trypan blue is valueless for this purpose. Giemsa and DNA ladder might be useful as confirmatory tests in some situations.

2、Zhang JH, Yu J, Li WX, Cheng CP. Related Articles, Links

Evaluation of Mn2+ stimulated and Zn2+ inhibited apoptosis in rat corpus luteal cells by flow cytometry and fluorochromes staining.

Chin J Physiol. 1998 Jun 30;41(2):121-6.

3、中华血液学杂志1998年第1期No.1 JANUARY 1998

细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年来国际上研究的热点，目前细胞凋亡的检测方法有DNA凝胶电泳法、电子显微镜法、染料透过法、TUNEL法和流式细胞仪法等。我们用染料透过检测法［1］测定阿糖胞苷(Ara-C)诱导的HL-60细胞凋亡，取得了满意的结果，现报道如下。材料和方法

1 原理吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(EB仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。细胞凋亡率由以下公式计算：

2 材料细胞来源：HL-60细胞株，由南京铁道医学院血液科研究室提供。

AO/EB染料: 精确称取AO(Fluka产品)、EB(Fluka产品)各1mg，分别溶于10ml pH7.2 PBS 中使之配成100μg/ml的储备液，用前等量混合，备用。

3 方法

3.1 HL-60细胞培养：将1×106/ml HL-60细胞接种于含20％小牛血清的RPMI 1640培养液中，加Ara-C终浓度为10μg/ml，置37℃、5％CO2浓度及饱和湿度的恒温培养箱中悬浮培养，孵育后分别于3，6，12，24及48小时观察结果。

3.2 AO/EB染色及观察结果：取细胞悬液100μl，加入AO/EB染料4μl混匀，置1滴于载玻

片，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数200个细胞。

3.3 DNA抽提及电泳：用酚、氯仿、异戊醇抽提DNA，1.5％琼脂糖凝胶电泳(0.5×TBE缓冲液，电压30V，电泳7～8小时)，在紫外透射仪下观察结果并拍照。

结果

Ara-C诱导HL-60细胞凋亡，在0，3，6，12，24和48小时其凋亡率分别为1.5%，14%，57.5%，66%，70.5%和60.5%。实验显示于第6小时开始，随诱导时间延长，其凋亡率增高，但观察至48小时，凋亡率却减低，此时显微镜下可见许多细胞碎片(附表)。DNA电泳在Ara-C 诱导6小时后均见梯形条带。

讨论

Ara-C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物，临床上用于各种白血病的治疗，过去认为其作用机制是杀细胞性的，但近年来认为小剂量Ara-C有诱导分化作用。本实验显示Ara-C的作用机制是诱导细胞凋亡，且诱导作用在24小时内随诱导时间延长，其凋亡率逐渐增高，而经药物作用48小时后细胞凋亡率反而减低，并且在显微镜下可见较多的细胞碎片，考虑为细胞凋亡后继发性坏死所致，由于碎片无法计数，故导致计数时凋亡细胞相对减少，凋亡率相对下降。

附表Ara-C诱导的HL-60细胞凋亡

组别时间细胞计数(%) 凋亡率(%) 膜受损细胞率(%) VN NVN VA NVA 合计

1 0 196 1

2 1 200 1.5 1.0

2 3 169 3 26 2 200 14.0 2.5

3 6 81

4 112 3 200 57.

5 3.5

4 12 52 16 109 23 200 66.0 19.5

5 24 41 18 112 29 200 70.5 23.5

6 48 59 20 90 31 200 60.5 21.5

在人体内凋亡细胞常被邻近的吞噬细胞所吞噬清除，因此不会发生继发性坏死。本实验亦显示经Ara-C诱导的HL-60细胞于6小时后DNA电泳均显现梯形条带，此结果进一步证实了Ara-C 对HL-60细胞的诱导凋亡作用。

测定细胞凋亡的方法有多种，其特点各不相同。DNA电泳法仅可定性，但无定量作用，而AO/EB染色法则可以半定量，它不但可以检测细胞的凋亡率，而且还能了解膜受损细胞率。AO/EB 法所需设备少、简便、快捷、经济，便于推广。其主要缺陷是仍难避免操作者的主观因素，最好由两位操作者同时计数，每次实验重复3次，计算平均凋亡率。电镜检测法设备昂贵，操作复杂，且仅有定性作用；TUNEL法和流式细胞仪法虽也有定量作用，但TUNEL法也带有主观性，且TUNEL 法和流式细胞仪价格昂贵，难以普及。我们介绍的AO/EB染色法是研究细胞凋亡的重要检测方法，随着此法的应用和推广，对抗肿瘤药物作用机制的研究及临床用药的指导将起重要作用。

参考文献

Wang CY, Eshleman J,Lutterbaugh J,et al.Spontaneous apoptosis in human colon tumour cell lines and the relation of WT p53 to apoptosis.Chin Med J,1996，109:537-541.

（图片见https://www.360docs.net/doc/b97930877.html,/bbs/actions/archive/post/112323_1.html）

eeflying:这个方法挺好玩，也简单，谁都能做，啥都不用特殊注意，把十万分之一的AO/EB溶液按千分之一加到培养液中，有1-2分钟细胞就亮了，挺漂亮的。是凋亡还是活细胞还是死细胞一眼就认出来了，什么特征都不用背，

fffwu:贴壁细胞怎么处理? 要不要消化下来再染色?

uhouuhou:我一直在想，是不是贴壁细胞直接点上染了就行了。作了一下觉得没什么不妥。只是死细胞太多时，为了记数准确，就必须消化下来看了。

eeflying:死细胞吹下来就可以了，直接点在培养液中，虽然有的书强调酚红会影响结果，但我

没觉得。挺好做的，细胞不用消化也不用洗。

fffwu:请看看我的图片,帮我分析一下。

（图片见https://www.360docs.net/doc/b97930877.html,/bbs/actions/archive/post/112323_1.html）

eeflying:你做过对照吗？正常培养对数早期细胞作为活细胞对照。42C加热20min后30min为凋亡细胞，42C加热30min过夜后为死细胞。我没做过这个细胞系，仅就我的经验作一猜测。

大虫: eeflying的图很漂亮，佩服。我也早就想作AO/EB染色，但是就对贴壁时的细胞染色不懂，也没有找到相关治疗。你提到十万分之一和千分之一，什么单位，我不是很懂。能详细解释浓度吗。

eeflying:哦，国际标准单位用惯了？！0.1g AO溶于10ml水称为1%，百分之一稀释一千倍成为十万分之一。1ml培养液中加1ul ＡＯ即为千分之一喽。

fffwu:正常对照做好了，暂时发不上来（附件太大）。以前贴壁的这个细胞也染过，结果：正常对照很漂亮，但是凋亡细胞样子十分怪异，等我扫描后传上。现在做的都是消化下来染的。eeflying:贴壁细胞不应该消化下来染, 这就是你染的细胞中竟然没有一个有着火焰色胞质的原因。

细胞RNA合成不旺盛了－－状态不好了。

celia_xl:我现在也准备用这个方法在CONFOCAL上计数凋亡率，我养的是贴壁细胞，我有点不明白，如果我染毒了24h后，肯定会有细胞脱落下来，那么这些细胞是不是应该计数在内呢？如果应该算在内的话，用小盖片培养做就不行了，那只好消化下来再染色了，是吗？

eeflying:您这个试验消化是不影响的，消化就是会使RNA染色减弱，但是不会影凋亡/死亡的判别。

吖啶橙/溴化乙啶 ( AO / EB ) 双染dxyrwx

正常细胞(核染色质结构正常，胞膜完整，着均匀的绿色)；

早期凋亡细胞(核染亮绿色呈致密斑块或碎片状)；

晚期凋亡细胞(核染橘红色呈致密斑块或碎片状);坏死细胞(胞膜破损、核膜完整，染色质染均匀的红色)。

参考方法:取AO(100 μg/ml)和EB(100 μg/ml)等体积混匀制成AO-EB荧光染液。将培养细胞用PBS离心洗涤两次，稀释至106/ml，取1ml细胞悬液(106细胞)离心收集细胞，加入25 μl PBS重新悬浮细胞,与1 μl AO-EB荧光染液混合,取10 μl点片,荧光显微镜下观察、照像。（图片见https://www.360docs.net/doc/b97930877.html,/bbs/post/view?bid=66&id=2130822&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#2130822）

关于AO的溶解

engla0931:请问做过AO/EB染色的朋友，在溶AO时怎么象油脂一样，而且不溶颗粒很多，正常不正常？不知对不对？

sunandsuny:我溶解AO时也有类似的情况,在溶解后,我用滤器过滤了一下,发现滤纸上有很多黄色或褐色的不溶性颗粒,但是不会影响染色效果。我也咨询了下我们这边其他做过这类试验的老师们，都说没有影响

engla0931:我今天做了几个样，一个是正常37度培养的，一个是42度20分钟--凋亡为主，还有一个是42度30分钟---坏死为主，染色之后发现三个没什么差别，而且染色结果非红即绿，这是怎么回事？

sunandsuny:正常的细胞核的DNA应该呈现比较均匀的黄色或黄绿色的荧光,而RNA呈现黄色或橘红色,,在凋亡时,细胞核和细胞质内呈现致密浓染的黄绿色荧光,甚至是黄绿色碎片.而当细胞坏死时,核溶解,减少，上述黄绿色荧光减少或消失.

所以楼上所说的"非红即绿"可能就出现了凋亡现象,你最好上传一长照片看看.

还有,最好用活细胞染色较好,不要固定.

激发光

playboyzmj:看到大家用AO-EB的方法来检测细胞凋亡。但有几个问题一直搞不懂:

检测的时候用什么激发光来观察? 是紫外吗？还有就是晚期调亡和死亡如何来鉴别啊？wangzhua:应当用蓝色激发吧,我用的蓝色,死亡后应当都是橙色或红色,弥散的,大小与原细胞相当.凋亡的应当有染色体聚集

lhxqxj：AO用蓝光激发，显示绿色，EB用绿光激发，显示红色。

zhangql930611:我用的是绿激发，凋亡早期的细胞着橙色，晚期的着绿色，但是死亡细胞和晚期凋亡的细胞不能区分，用流式细胞检测仪可以区分

AO/EB染色检测贴壁细胞凋亡

jieyuan_gx:我们准备用细胞爬片的AO/EB染色检测贴壁细胞凋亡，请教高手应该把AO/EB染液加入培养基还是直接滴在载玻片上再将爬片反扣在染液上？

qjzhou2000:弃去培养液后，PBS洗，加染液即可！我一般是染好后将片子拿出来！这样不会污染环境！

eeflying:直接加在培养基中就可以了。

typhoon2001:我一般是把爬片用酸性PBS轻漂洗两遍，再用95%酒精固定1/2-1h（可放置数天，但最好一天之内染色），酸性PBS轻轻漂洗一遍，放于载玻片上，滴染液，加盖片，荧光显微镜下观察就行了。

eeflying:为什么用酸PBS漂洗？酒精也用酸酒精吗？

AO／EB染色最好是活细胞染色，因为该实验的原理就是AO可以被活细胞吸收。而EB不能透过或细胞完整的细胞膜。这样，对于活细胞而言AO和EB进入细胞的速度是不一样的，所以显出AO的绿色，对于死细胞，AO/EB是同时进入细胞的，但是EB的橙红色比AO的绿色耀眼，所以，显出的是EB的橙红色。凋亡细胞介于二者之间。

如果是死细胞（固定过的）细胞膜就不是完整的了。这样凋亡和死亡的假阳性率必然要增加。

其他

eeflying:那就来个最便宜的AO/EB法。不用花钱。

dancer786:为什么在首帖里没有提到这种方法呢？是不是它有什么缺点呢？因为有毒性吗？

eeflying:毒性。所有核酸染料都致癌，缺点：太古老了，不合追新求异的口味。

ripple:我的细胞带有绿色荧光，如果再进行AO/EB染色，会不会因为原来带的绿色荧光而掩盖了染色，影响了最后的效果？

midas:不知你细胞所带的绿色荧光是在胞浆还是胞核？如果在胞浆，就用染胞核的染料，如hoechst或DAPI

幽谷清荷：我最近要用Hoechst 33342对活细胞进行染色，不知哪位前辈能告诉我染色剂的使用浓度和染色时间？

lazyrabbit：不知道你到底是仅染色活细胞，进行活细胞计数，还是要做其他特殊染色？不管何种染色方法，进行细胞培养时的荧光染色，有一个非常方便而且易于操作的方法，是我在实验中总结出来的，非常实用：

根据你需要，选24孔板或者96孔板，待细胞生长至你需要的密度后，不需要消化收集细胞，可以直接在培养孔内进行染色：生理盐水洗一遍，滴加荧光标记物，避光染色，然后用生理盐水洗两遍，洗清未结合的标记物，再在培养孔内滴加90％的甘油，即可在荧光显微镜下观察拍照。培养板存放在4度冰箱，避光，荧光强度在一月内可以没有明显减弱。

此外，还要建议你。采用荧光染色的方法, 可以确证细胞存活与凋亡的状态。这种荧光染色法，根据细胞核结构、细胞膜完整性不同，可以被吖啶橙（AO）和溴乙啶（EB）混合荧光染料染成不同颜色，从而区别细胞是存活还是发生凋亡。AO能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA ，使细胞发出绿色荧光，而EB仅能通过胞膜受损的细胞，嵌入DNA使之发出橙红色荧光。将两种染料混合使用时，正常活细胞的核染色质着绿色，形态结构正常；早期凋亡细胞的膜结构完整，核染色质着绿色，但核已开始固缩或呈串珠状；晚期凋亡细胞，核染色质发橙红色荧光，呈固缩状或串珠状，有时核碎裂散布于胞浆中；有时还可见到细胞核结构正常，但细胞着红色，为非凋亡的死亡细胞。

AO、EB终浓度均为50μg/ml, 在细胞培养孔内加混合染液10μl, 染色1min即可观察。celia_xl：我这两次用Confocal观察细胞凋亡情况，用的就是AO/EB染色。一开始觉得不会有什么问题，但结果让人费解。首先，可能是我用的染料浓度比较低（我是先配成100μg/ml浓度，

用时在大约1ml培养液中加入大约1μl）当然这样染后不用洗背景都非常低，但是问题是有时细胞核几乎呈现负染，而且很容易淬灭。这是其一。其次，观察时，染毒细胞能看到细胞核呈现碎片、固缩化，而正常细胞也似乎有类似的表现，而我的细胞状态很好，正常细胞不应出现这种现象，会不会是胰酶消化引起的?要不是俺的细胞比较娇嫩,在外面容易凋亡?还有就是观察这种细胞是不是应该在油镜下？最后一个问题，我前天让细胞爬片后染色观察，结果看到细胞质中有小亮点，难道是支原体污染？但是背景很清楚，细胞外也没有，难道是线粒体？

lazyrabbit：对celia_xl 兄的问题，考虑再三，在下有一点不成熟的想法，供批评：

1）细胞在培养过程中，细胞的生长状态和时机很重要，一般情况下，如果细胞生长密度过大，时间过长，那么就会有一些细胞生长状态不良，甚至自然转向凋亡或死亡，所以老兄在正常细胞中观察到核固缩现象，并不奇怪。但比例应不会太高。

2）上面我已说过，可以在培养板中直接染色，不必消化回收细胞，这样可以保持细胞在正常的生长状态，便于比较。

3）你的染色液浓度会不会太低？AO／EB终浓度应在50μg/ml,这样的浓度也可以不必洗背景。4）高倍镜下已经足够，不必由镜。

5）细胞质中的亮点，没有看见，不敢妄加推断，但我可以肯定它不是线粒体，普通的显微镜不足以看见细胞器。

XTYang：其实AO/EB染凋亡细胞的特征性不好，不如用ANNEXIN V-FITC/PI。

icepiao：你说的对，但是好像ANNEXIN V-FITC好像很贵，不知道你从哪买的，多少钱wyk：我想用荧光把细胞膜标记出来该用什么荧光燃料？

XTYang：（To wyk）通常可用针对膜上特异性受体的荧光标记抗体来染膜．

icepiao：（To wyk）抗体是最有效的方法。另外好像Fluorescamine，Merocyanine 540也可以同膜表面蛋白结合

midas：（To wyk）Dil染料

wnwnwang :我正在做hoechst33258染色，是直接在24板做的，染色，洗涤，400×的就拍的看不清楚，我根本就看不清楚细胞结构，不知道什么原因，是不是塑料的折光性不行。请教icepiao 如何做的这么漂亮，要看清细胞内结构必需要600×的吗？

icepiao：（To wnwnwang）400X应该够了，我做的是载片，不知道和孔板有没有关系，如果你觉得有可能的话，你可以试着用玻片培养染色试试

midas：（To wnwnwang）肯定是塑料的折光性造成的！所以应该作细胞爬片！

midas：icepiao您的AO/EB染色有一些意思！按道理，AO/EB都是DNA的染料，AO能透过正常细胞的胞膜（和hoechst类似），嵌入细胞核DNA，在红光激发下使之发出明亮的绿色荧光。EB只能仅能透过胞膜受损的细胞（和PI类似），嵌入核DNA，在绿光发出橘红色荧光。

凋亡时，胞核呈固缩状、团块状结构，因此细胞AO染色呈现为增强的、明亮的绿色荧光，甚至呈现出“黄”色。

坏死或晚期凋亡，核为较大的园形结构着橘红色，或橘红色并呈固缩状或圆珠状。

而icepiao您的染色，竟然有胞质着色，我有些想不通！

另外按以上标准，您的图中典型的调亡细胞好像不多，坏死细胞反而较多（第3张图）！icepiao：你说得很有道理，这个正是我有些想不通的问题，我做的是不同药物影响细胞的实验，不同药物作用后结果有比较大的差异，第四张显示的结果是个很特殊的情况，我推测是扩散到细胞质中的DNA或RNA作色所导致。你觉得呢？

icepiao：这张同样也是这样的问题。不过在补充一句，照这张照片的时候，细胞中存在许多微小的颗粒（就是很多人都讨论过的培养液中存在的小黑点问题），在荧光染色下为红色，如图中箭头所示，同样胞质也是红色

midas：我感觉那些看似像是在胞浆，以及在细胞周围的红色着色，不应该是扩散到细胞质中的DNA或RNA，因为胞浆内有许多DNA或RNA裂解酶，它们可以在瞬间把DNA或RNA裂解成极小的片断，这样就不能为染料着色。所以我认为这些红色的着色，最有可能是细胞周围的一些脏东西，它们可以吸附染料。

icepiao：第五张照片个人认为是一次比较失败的结果，那一批细胞后来都死亡了，确实容易给人以细胞周围脏东西的感觉。但是其他实验中只有一种药物会产生这样的结果，所以我觉得不一定是这样的，但是又解释不了，另外，荧光染色只能用于分析凋亡么？我们还能得到什么信息？再在看这张，同样的药物处理，同样的结果

toad：我打算用双色标记贴壁内皮细胞细胞，分别是FITC（绿光）和DIL（红光）标记的。请问双标的具体操作如何，和单标相比需要注意什么呢？

michael_66：（TO toad）你说的两种荧光素是标在二抗上的吗？如果是的话，就要用免疫荧光双标法。

XTYang：FITC可标一抗的。（TO icepiao）我以前用Trevigen的Annexin V-FITV,照推荐用量的1/2用，成本约20多元/sample。现在因为买不到这家公司的，正找性价比最好的产品。Annexin V kit有些公司有20test包装的，价格在1000元以内。

你的照片照得真不错，用的什么牌什么型号的显微镜？是用CCD照的吗？还有你是用双色滤色片照的还是用两个单色滤色片照完后叠加合成的？

icepiao：我用的是奥林帕斯的，BX51，CCD照相，用的是两个滤光片照完后叠加的。这张本来是3t3细胞，加药后明显有些不同，不知道为什么核很亮很圆，而细胞质不着色。

jeantan:如何染的？这么漂亮。可以共享一些方法吗？

icepiao：我是先配染液，是AO(100mg/ml),EB(100mg/ml)1：1混合液。染色前作细胞爬片，我是在六孔板中作的，一个孔正好放一片玻片，弃营养液，PBS洗两遍，加入2mlPBS同时加入80ul 的染液，避光染色20ml,然后再用PBS洗两遍以去掉多余的染料，取出玻片倒扣在载波片上置荧光显微镜下观察。

sunchunyan66：我有一个挺傻的问题：我以前也做过贴壁细胞的染色，但我是消化细胞后甩片。因为我觉得药物作用后，有些细胞不贴壁了（呈悬浮状，可能是死亡了），所以我觉得如果用爬片的话，是不是结果不是很准确，因为人为的排除了一部分死亡或凋亡的细胞。不知我的想法对不对，请指教。

hongluoque :我们这以前没人作过这方面的东西，有荧光显微镜，但是没人会用，我照着说明书做，但是怎么也找不到紫外光，就是看不见细胞核的荧光。

ze_quan：首先要打开紫外光源，不是普通光源，一般是高压汞灯光源；其次要选择好模块，不同的染料需要不同的激发波长和阻断波长，使用紫外光源时要将可见光源暂时关闭。

（注：图片见https://www.360docs.net/doc/b97930877.html,/bbs/post/view?bid=66&id=774208&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#774208）请教可与AO/EB染色法达到同样效果的方法

sxh:因为EB毒性太强，所以想请教各位有没有其它毒性较小的染料，同样可以区分凋亡与坏死的细胞，或者单用AO可不可以区分，有没有用AO/PI双染的?

maokai123:有一种hochest染料可以替代。单独用ao可以区分凋亡和不凋亡的，aoeb的优点是利用凋亡不同阶段个细胞器对染料通透性差异可以区分每个细胞凋亡的程度是早期还是晚期染的凋亡小体十分漂亮。细胞已经死了，无所谓毒性了，你不会把染过的细胞再养起来吧。sxh:因为没有专门的显微镜用于EB的，我怕会污染到别人，所以才想用其它的方法。hochest好像也有几种吧，不知道33258可不可以不先固定细胞而直接染，就像AO一样。maokai123:对,就是33258. 固定不固定我印象不清了，因为我没做过，我就是用aoeb。你可以用爬片细胞做，染色后立刻用指甲油封片，可以避免污染。

爬片就是细胞长在盖玻片上，只要是贴壁细胞都能爬片。把染色液滴在细胞上，吸掉多余液体，轻轻把有细胞的一面扣在载玻片上。用指甲油涂在盖玻片四周，指甲油一凝固，染色液就不会流出来了。

XTYang: hochest/PI

Ally1978:甘油明胶不行吗？非要用指甲油吗？

maokai123:要留染色液多一点，免得压坏细胞，所以我用疏水快干的指甲油。

sxh: AO要不要先孵育再洗掉，要的话应该孵育多久，它的荧光淬灭得快吗，是不是加了就要观察，不能放呀，

maokai123:不用孵育，加了就看，不要洗，立刻封片，荧光寿命很长。