基于快速成型技术的可控结构多孔硅酸钙支架的制备及体外研究

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状，使其成为可以用来制备组织工程支架的理想方法。我们以往的研究表明：利用快速成型技术并结合凝胶铸模技术可成功制备可控结构的多孔Ｂ一磷酸三钙（ｐ—ｔｒｉｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐ—ＴＣＰ）支架∞］，该支架具备骨缺损修复过程中组织再生所需的微结构及相应的生物学行为［７，８３０

体外研究［９－１１３和体内研究［１２，１３］均证实，硅酸钙（ｃａｌｃｉｕｍｓｉｌｉｃａｔｅ，ＣＳ）陶瓷具有生物相容性、生物活性和生物可降解性，近年来逐渐成为骨组织工程支架领域的研究热点。以往制备的多孔ＣＳ支架使用无机添加物作为发泡剂制造多孔形态Ｈ４‘，或使用聚合海绵作为多孔结构的负型［１５。，这些方法的主要缺点是孔道结构如孔道尺寸、孔道连通率等不能控制。本研究旨在探索利用快速成型技术制备可控结构多孔ＣＳ（ＲＰ—ＣＳ）陶瓷支架的可行性，并与同法制备的多孔磷酸钙（ＲＰ—ＴＣＰ）陶瓷支架相对照，通过检测体外模拟体液浸置及骨髓细胞共培养后的相关指标来观察ＲＰ—ＣＳ支架的生物学特性。

材料与方法

一、ＲＰ—ＣＳ支架的制备和特征分析

（一）材料和试剂：Ｂ—ＣＳ粉体按照化学沉淀方法在８００℃烧结制得［１６］ｏ所得粉体过筛滤为３００目大小备用。Ｂ—ＴＣＰ粉体购自日本Ｔｏｍｉｔａ公司。所用主要原料和试剂见表１，其中，分散剂聚丙烯酸铵（ＰＡＡ—ＮＨ４）为西安泰瑞成新材料有限公司所赠，其余均为购买的分析纯试剂。

表１￥－ｃｓ支架主要原料及试剂

（二）支架设计：根据有利于细胞（组织）长入和新骨生成的原则，设计微管道为完全相互连通的圆柱形，直径２００—６００斗ｍ。使用设计软件（Ｕｎｉｇｒａｐｈ—ｉｃｓＮＸ２．０，ＵＧＳ，ＵＳＡ）设计如下结构模型：直径１０ｍｍ×６ｍｍ，在支架内部均匀分布的正交形微管道结构。分别在Ｘ、Ｙ和Ｚ方向进行阵列，得到一个三维空间网架结构体，设计一个圆柱体与所形成的网架

结构体进行布尔运算（相交），即可得支架内部微管道负型结构（图１ａ）。将支架的负型结构与同样圆柱体进行布尔相减，得到支架计算机辅助设计（ｔｏｍ．ｐｕｔｅｒａｉｄｅｄｄｅｓｉｇｎ，ＣＡＤ）三维实体模型（图１ｂ）。外形为圆柱体，外径１３ｍｍ，内径１０ｍｍ，高度７ｍｍ。内部微管道呈正交形：Ｘ—Ｙ平面５００Ｉｘｍｘ５００Ｉｘｍ矩形通道，孔道间距１．６６ｍｍ，层距２．３ｍｍ，Ｚ方向直径５００Ｉ．ｚｍ，Ｘ、Ｙ、Ｚ三方向管道相互连通。最后，对支架内部微管道负型结构添加外形轮廓，得到相应支架负型（即模具）ＣＡＤ模型。数据以ＳＴＬ格式存储，输入快速成型计算机系统进行分层切片处理，利用立体光固化技术设备一激光快速成型机（ＳＰＳ一６００型，西安交大）制造支架树脂负型（图１ｃ）。

图１设计多孔支架的微管道（ａ）、实体（ｂ）

和负型（ｃ）的ＣＡＤ模型图

（三）支架制造：取９ｍｌ去离子水、０．９ｇ丙烯酰铵、０．１ｇＮ，Ｎ一二甲基二丙烯酰铵、０．２ｇ聚丙烯酸铵放入５０ｍｌ烧杯，充分搅拌，使用超声波对其进行辅助分散，制成预混液；分别称取１０ｇ和１ｇ的Ｂ—ＣＳ生物陶瓷和玻璃基高温黏结剂粉末，添加到预混液中；搅拌均匀后，再用超声波对其分散，用浓氨水调节以维持浆体ｐＨ值在９左右。真空条件下排除浆料中的气泡，加入０．１ｇ过硫酸铵（引发剂），混合均匀，最后加入０．００５ｇ的催化剂。浆料加入催化剂后迅速灌注到树脂模具，室温２４ｈ后放入烘箱加热至６０℃，此温度下放置３－４ｄ，使水分基本蒸发。最后，置人高温箱式电阻炉进行烧结，升温速度为６０℃／１１至６００ｏＣ，再调整为３００℃／ｈ至１１００ｏＣ，烧结３ｈ，随炉冷却至室温取出，即可获得多孔ＲＰ—ＣＳ生物陶瓷支架。采用同样方法和工艺制备ＲＰ—ＴＣＰ支架。所有支架材料均以单个双层塑封分装，＾ｙ射线照射１８ｈ后备用［１７。。

（四）支架特征分析：用光学显微镜（Ｋｅｙｅｎｅｅ，ＶＨ一８０００，Ｊａｐａｎ）观察制备支架的微结构；用阿基米德法（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＹＤＫ０１，Ｇｅｒｍａｎｙ）测量多孔陶瓷孔隙率；用生物力学机（ＳｈｉｍａｄｚａＡＧ—Ｉ５ｋＮ，Ｊａｐａｎ）以０．５ｍｍ／ｍｉｎ速度测量其压缩强度，每组测量５个样

品后取均值。

虫垡盐抖苤志２四２生§月筮２２卷筮』期ｇｂｉ！』Ｑｒｔｈｏｐ，Ｍａｙ２００９

（２８．０３±２．５６）ＭＰａ，ＲＰ—ＴＣＰ支架为（４．２２±０．８６）

ＭＰａ。

图２制备的可控结构多孔ＲＰ—ＣＳ支架外观和

光学显微镜下观察管道分布情况

二、体外研究

（一）ＳＢＦ浸置：置于ＳＢＦ中３ｄ后，ＲＰ－ＣＳ支架整体结构没有明显变化，但是表面出现一层小圆球颗粒。这些颗粒直径为１００－３００ｎｍ。借助Ｘ线能谱分析发现，此颗粒层含有大量Ｃａ、Ｐ成分，其Ｃａ／Ｐ约为１．６８，类似羟基磷灰石。

（二）体外细胞共培养：细胞一支架复合物共培养７ｄ后，所有支架表面的细胞形态均无异常。细胞与ＲＰ—ＣＳ支架（图３ａ）和ＲＰ—ＴＣＰ（图３ｂ）支架均贴附良好，有明显细胞突触向四周伸展，细胞边缘有丝状伪足固定于支架表面，说明这两种材料制备的支架均具有良好的细胞相容性。１４ｄ后，细胞在所有支架表面呈扁平层状连续分布。与ＲＰ—ＴＣＰ（图３ｄ）相比，ＲＰ—ＣＳ孔道周围出现融合的细胞层（图３ｃ）。

（三）ＣＭ—ＤｉＩ细胞标记：借助ＣＭ—ＤｉＩ标记，在荧光显微镜下可以观察到共培养后骨髓细胞的形态和在支架上的空间分布情况。共培养７ｄ后，细胞在所有支架表面均聚集成团状，特别是在环绕孔道处，

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表明细胞增殖良好（图４ａ）。１４ｄ后，细胞不仅正常贴附生长于两种支架上表面，还贴附于下表面，ＲＰ—ＣＳ下表面更明显（图４ｂ）。

（四）细胞增殖：ＭＴＩ＇检测表明，细胞在两种支架上正常增殖，说明两种支架与细胞相容性好。７

ｄ

时测定ＲＰ—ＣＳ和ＲＰ—ＴＣＰ的细胞增殖活力（ＯＤ／ｇ）分别是１．４６±０．２０和０．７６±０．１６；１４ｄ时分别是３．５８±

０．３２和１．２６±０．４０。７ｄ、１４ｄ时贴附于ＲＰ—ＣＳ支架上

的细胞数量明显高于ＲＰ—ＴＣＰ，两者差异有统计学意义（Ｆ＝１７８．７８，Ｐ＜０．０５；Ｆ＝３６６．１６，Ｐ＜０．０５）。与ＲＰ—ＴＣＰ支架相比，ＲＰ—ＣＳ支架检测后残余材料的颜色

更深。

（五）ＡＬＰ活性：７ｄ时ＲＰ—ＣＳ和ＲＰ—ＴＣＰ的

ＡＬＰ活性（ＯＤ／ｇ）分别是０．８４＋０．１８和０．５８±０．０８；１４ｄ时分别是１．１２±０．１２和１．０８±０．１０。７ｄ时，ＲＰ—ＣＳ支架上ＡＩＰ的活性明显高于ＲＰ—ＴＣＰ（Ｆ＝５９．３８，尸＜０．０５）。两种支架上ＡＬＰ活性在７～１４ｄ均出现明显的升高。但１４ｄ时，ＲＰ—ＣＳ支架上ＡＬＰ活性与ＲＰ—ＴＣＰ的差异无统计学意义（Ｆ＝Ｉ．２１，Ｐ＞０．０５）。

（六）扫描电镜和能谱分析：彻底去除支架表面细胞后，使用扫描电镜观察支架材料表面形态变化情况。共培养７ｄ后，ＲＰ—ＣＳ支架表面出现直径

１００～３００

Ｉｘｍ的小圆球结构（图５ａ）。Ｘ线能谱分析

表明，这些小圆球含有大量Ｃａ、Ｐ成分，其Ｃａ／Ｐ约为１．７３，类似羟基磷灰石。１４ｄ后，ＲＰ—ＣＳ支架表面的小圆球融合成薄层（图５ｃ）。７

ｄ、１４

ｄ的ＲＰ—ＴＣＰ支

架表面形态均呈现相类似的球体结构（图５ｂ，ｄ），Ｘ线能谱未能检测到羟基磷灰石层出现。

（七）组织学观察：支架中段５０／ｘｍ硬组织包埋切片经ＨＥ染色后，可以清晰观察到支架内部孔道中细胞生长情况。培养７ｄ后，两种支架孑Ｌ道中均未

图３共培养７、１４ｄ后，扫描电镜观察ＲＰ—ＣＳ（ａ，ｃ）和ＲＰ—ＴＣＰ（ｂ，ｄ）支架上的骨髓细胞形态。１４ｄ后，与ＲＰ—ＴＣＰ相比，ＲＰ—ｃｓ孔道周围有融

合的细胞层出现（Ｃ）×１０００

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图４共培养７ｄ（ａ，ｂ）、１４ｄ（ｃ，ｄ）ＣＭ－ＤｉＩ标记细胞在支架上的空间分布。共培养７ｄ后，细胞在所有支架表面均聚集成团状，特别是在环绕孔道处，表明细胞增殖良好。１４ｄ后，细胞不仅正常贴附生长于两种支架上表面，还贴附于下表面，ＲＰ—ＣＳ（ｃ）下表面更明显上图ｘ５０，下图Ｘ

１００

观察到大量细胞贴壁生长现象，偶见单层成纤维细胞样细胞散在分布于孔道内壁上，各孔道间细胞不均匀，说明细胞未大量长入支架内部。培养１４ｄ后，两种孔道中均出现大量成纤维细胞样细胞生长于孔道内壁上，多层叠加呈现半月状，各孑Ｌ道间均出现此现象，说明细胞已在两种孔道内部正常贴壁、增殖分化情况良好（图６）。

讨

论

骨组织再生支架材料应具有相互连通的多孔结构及在新骨形成过程中可以承受一定载荷的良好力学性能。支架孑Ｌ隙率和内孔结构的精确控制，可以最大程度地促进营养成分分布、细胞间液流动、血液输送、细胞生长、组织分化及优化支架力学性能［２１。。计算机辅助下的快速成型技术具有传统制备方法不可比拟的优势，可以精确控制宏观结构（如空间形状）和微观结构（如孔尺寸、孔分布、孔连通性）特性［２２］ｏ本研究利用快速成型技术结合凝胶铸模技术成功制备了ＲＰ—ＣＳ支架。此种支架的大孔道可以作为培养

基灌注和营养输送的通道，而微孔为组织生长提供潜在空间。

以往研究表明，孔直径＞３００ｌｘｍ有利于毛细血管长入和新骨组织形成∞］。目前，公认的支架结构的宽泛原则是，总孔隙率＞５０％－６０％，连通径＞５０—１００Ｉｘｍ，可吸收材料的孔壁孔隙率＜２０％阱］。本研究制备的ＲＰ—ＣＳ支架的总孔隙率是７０．５６％＋３．６０％，支架表面和孔道内壁上分布着很多微孔（直径５～１０Ｉｘｍ）。ＲＰ—ＣＳ和ＲＰ—ＴＣＰ支架的孔道直径分别为

（５５５．８２＋２９．７７）斗ｍ和（５３３．８０＿＋２４．３７）Ｉｘｍ，与设计参数５００¨ｍ相类似，之间的误差可能是因为烧结过程中致密效应引起的材料收缩，特别是对于超细

ＣＳ粉体”６。。此外，制备材料浆体时的水分含量和填

充密度也会有所影响。

孔隙率和力学性能之间的平衡依赖于修复部位、改建速度和支架材料的降解速率。本研究制备的ＲＰ—ＣＳ支架的轴向压缩载荷为（２８．０３＋２．５６）ＭＰａ，类似正常人松质骨［２５１。以往研究表明，１１００℃烧结

３

ｈ的ＣＳ陶瓷具有（６５．８９－＋２．３８）ＭＰａ的压缩强度，

图５细胞培养７、１４ｄ后ＲＰ－ＣＳ（ａ，ｅ）和ＲＰ－ＴＣＰ（ｂ，ｄ）支架的材料表面形态。共培养７ｄ后，ＲＰ－ＣＳ支架表面出现直径１００，．一３００¨ｍ的小圆球

结构，１４ｄ后小圆球融合成薄层。７、１４ｄ的ＲＰ—ＴＥＰ支架表面形态均呈现相类似的球体结构扫描电镜ｘ２０００

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图６共培养１４ｄ后ＲＰ—ＣＳ（ａ）和ＲＰ—ＴＣＰ（ｂ）支架中间部分７Ｌ道中细胞贴壁生长情况，细胞在两种｝Ｌ道内部正常贴壁，增殖分化情况良好ＨＥ染色ｘ２００

类似于正常人皮质骨，为同样方法制备４５Ｓ５生物玻璃的２．３倍［１４１。因此，本研究制备的ＲＰ—ＣＳ支架具有良好的力学性能，可以满足骨再生过程的需要。

陶瓷材料体外置于ＳＢＦ后表面有骨样磷灰石层形成，此被认为具有生物活性［９，１８，２６，２７］。１９９６年，ＤｅＡｚａ等Ｅ９，２７］通过体外研究首次报告了０【一ＣＳ陶瓷置于ＳＢＦ中会形成羟基磷灰石层，可以作为具有生物活性的生物材料。本研究的ＳＢＦ浸置结果表明，ＲＰ—ＣＳ支架可以体外沉积羟基磷灰石，说明其具有体外生物活性，可以用作生物活性支架材料。

本研究制备的ＲＰ—ＣＳ支架与骨髓细胞共培养后，ＡＬＰ活性升高，说明ＲＰ—ＣＳ可能具有促进骨髓细胞成骨性分化的特性。有研究指出，骨髓细胞与１３一ＴＣＰ共培养后也可以检测到ＡＬＰ活性的升高，说明Ｂ—ＴＣＰ陶瓷同样具有促进骨髓细胞成骨性分化的特性［２８，２９］。与本研究结果类似，共培养７ｄ后，接种于仅一ＣＳ支架上成骨细胞的ＡＬＰ活性明显高于１３一ＴＣＰ支架ｎ５Ｉ。此外，含硅的生物玻璃溶解液可以提高人成骨细胞的分化５０％，并引起基因水平表达的变化［３０１。同样，与本研究显示的ＲＰ—ＣＳ促进细胞增殖的结果相类似，ＣＳ陶瓷可以促进小牛骨髓细胞的增殖［１４１。还有报道指出，含硅的玻璃复合物与人骨髓细胞共培养３５ｄ后，出现成骨细胞样细胞的现象［３１。。有学者认为，生物玻璃促进骨髓细胞成骨性分化和成骨细胞分泌矿化基质的原因，可能是可溶性硅快速释放入培养液中，形成细胞周围碱性环境［３２１０这一假设的依据是，碱中毒可以促进成骨细胞活性和胶原合成∞３１。但是，也有报道指出，与Ｏｔ—ＣＳ相接触的大鼠颅骨成骨细胞的ＡＬＰ活性并没有明显升高畔］。

这些研究结果之间的差异，可能是由细胞特性差异和生物活性材料释放离子的差异所造成。据认为，生物活性材料向周围环境释放的离子（如Ｃａ和Ｐ），及材料表面特性可能会参与调节细胞的成骨性作用‘艄７１。有证据表明，硅在正常骨代谢中起重要作用，可以引起人成骨细胞活性的升高（３５，３６１。此外，基因水平的变化也可能是引起与ＣＳ共培养的细胞发生形态变化的原因之一。生物玻璃引起基因表达的变化可能基于以下四个机制：表面化学、拓扑学、溶解离子释放类型和速度、界面剪切力（力学性能）口７１。但是，细胞间信号通路的变化还不清楚。这需要今后进一步研究。

总之，本研究利用快速成型技术和凝胶铸模工艺，首次成功制备了ＲＰ—ＣＳ支架。体外ＳＢＦ浸置表明，ＲＰ—ＣＳ可以体外沉积羟基磷灰石层，具有生物活性。与兔骨髓细胞共培养发现，ＲＰ—ＣＳ具有良好细胞相容性，可以促进骨髓细胞增殖并向成骨细胞分化。此为今后ＲＰ—ＣＳ支架的制备及相关应用研究提供了可能。

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