细胞计数及铺板
用于侵袭、迁移等试验的细胞计数及铺板
［实验步骤］
1、准备工作用75%的洒精擦拭双手，同时用洒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血活、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS?W洗一遍，四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿?内，拍血，上下左右铺匀，37°消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.
4、加入4ml的含5%血活的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬:液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.
5、弃上活。用PBS 3ml洗细胞，吹打或涡旋混匀，洗2次，离心1000rpm,3min.弃上活。
6、配细胞稀释液（BSA终浓度为0.1%）.每种细胞需3ml稀释液，共6个样品，所以配20ml稀释液（无血培20ml+10%BSA 200ul.）
7、细胞沉淀中加3ml细胞稀释液，吹打混匀，即得稀释过的细胞悬液。
8、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品计数2次，算均值。（8个大格总数/8=数值*104）
9、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补。
普通的细胞计数及铺板（免疫荧光，W舞不需定量）
［实验步骤］
1、准备工作用75%的洒精擦拭双手，同时用洒精棉球擦拭超净台。2）将培养液、实验所需材料也放入超净台进行灭菌（血活、培养基除外）3）倒置显微镜下，观察细胞的状态，是否已经长满培养瓶，需要进行分瓶。
2、弃去培养基，用枪尽量去培养基。贴壁加入5mlPBS!活洗一遍，四个方向晃动倒掉。
3、将0.25%胰酶600ul加入培养皿?内，拍血，上下左右铺匀，37°消化30 分钟左右，随时观察，见到细胞泥沙状留下时，即消化完全.
4、加入4ml的含血活的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，制成细胞悬液，然后装到15ml离心管中。1000rpm,3min.若细胞较多，贝U 需稀释。
5、取上述1ml细胞悬液，在加1ml含血活的新鲜培养基，混匀。
6、细胞计数板每孔加15ul悬液。每个样品对角线计数2次，算均值。
7、根据铺板密度，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用含血活的新鲜养基补。
注意：
1. 不健康的细胞质中有空泡，细胞内有颗粒样物质，细胞间空隙增大，变形, 不规则，失去原有的特点。
2. 是否污染：
传代或换液24-48 h注意观察细胞是否被污染，污染的细胞培养液变浑浊，镜下可见有大量菌丝。如果细胞生长缓慢，生长特性改变，胞质内颗粒性物质增多，尽管培养液不变浑浊，考虑可能有支原体污染。污染的细胞立即从培养箱中取走，以免污染其它细胞。
3. 也用20天左右，可更换。
4. 分活无血培、血培的用途。
2012-09-03实作如下:
、常规收集细胞、消化、洗涤后，加3ml细胞稀释液，悬匀后计数
细胞株计数
Shluc114*104 /ml10*105个/114*104 =0.877 ml=877ul
ShE138*104/ml725ul如此类推SHF140*104/ml
P112*104/ml
B4
178*10 /ml
将细胞密度调整为5*105个/ml,每个样品总体积为2ml.则所需细胞数为
2*5*10 5=10*105个。
从以上调整过密度的细胞悬:液中取适量进行及改验
二、Transwell检测肿瘤细胞迁移实验
1. 在板孔（下室）中加入600 ul/well含有10%血活培养基作为引诱剂，小室底部接触培养基。
2. 轻轻的在细胞小室的上层加入140ul /well细胞悬:液（若细胞密度为5 x 105 cell/ml,则上室中共加入5 x 105 cell/ml x140ul=7 x
104cell）。37 C 孵育24 小时（孵育时间根据实验调整，12-36小时）
3. 孵育结束，小心取出细胞小室，用棉签轻轻擦去上室液体。移到预先加入800 ul /well 4%多聚甲醛或70%甲醇的下室中，室温固定30分钟。
4. 小心取出细胞小室，用吸干上室固定液。（可4°保存，隔日再做。）800 ul/ well PBS加入下室洗3次。室温晾干。
5. 800 ul/ well 0. 1%结晶紫染色30min。
6. 迅速将小室浸没到ddH2。浸泡数次，去除多余的染料。吸去上室多余液体
完全干燥小室。
7. 显微镜下观察结果，随机选取3个不同的视野拍照。
8.
三、SRB
1.取24孔板，加入300ul 10%血培，再加入200ul调整密度为5*105个/ml细胞悬液，即每well内有1*105个细胞。摇匀，静置，镜检37。孵育过夜，明日观察是否贴壁.贴壁后，弃培养基，即可测SRB。