蛋白浓度测定(完成)
蛋白浓度测定
蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。
蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法
染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法
其他性质：荧光法
蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。
常用的测定蛋白质含量方法的比较
由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。
试验一：BCA法
BCA法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。在组织细胞裂解实验中，常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果，但受螯合剂(EDTA，EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类的影响。
基本原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
主要特点
1. 准确灵敏, 线性范围广：BCA试剂的蛋白质测定范围是10－2000ug/ml；
2. 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便。
3. 经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
4. 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响。
5. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。
试剂要求
BCA试剂A, B液室温保存，蛋白标准(5mg/ml) -20℃保存
仪器准备
96孔板，酶标仪，37℃恒温箱
使用说明
1. 配制工作液: 根据标准品和样品数量，按体积比A ：B （50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
2. 稀释标准品：取10微升标准品用PBS稀释至100ul（标准品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20ul加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足到20ul。或者依照下面的表格中设置的浓度做标准曲线。
3. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，补加PBS到20ul。一般蛋白样品可以几个不同的稀释比例检测，常用的是每孔中加入1ul，2ul，4ul样品，补加PBS到20ul。
4. 各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30分钟。
5. 冷却到室温，用酶标仪562nm测定OD值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。
注意事项
1. 在低温条件或长期保存出现沉淀时，可搅拌或37℃温育使溶解, 如发现细菌污染则应丢弃。
2. 样品中若含有EDTA、EGTA、DTT、硫酸铵、脂类会影响检测结果，请试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒；高浓度的去垢剂也影响实验结果，可用TCA沉淀去除干扰物质。
3．要得到更为精确的蛋白浓度结果，每个蛋白梯度和样品均需做复孔, 每次均应做标准曲线。
4．当试剂A和B混合时可能会有浑浊，但混匀后就会消失，工作液在密闭情况下可保存1周。
5．需准备37℃水浴或温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为540-595nm之间，562nm 最佳。酶标仪需与96孔酶标板配套使用。使用分光光度计测定蛋白浓度时，试剂盒测定的样品数量会因此而减少。使用温箱孵育时，应注意防止因水粉蒸发影响检测结果。
二、考马氏亮蓝G－250染色法（Bradford法）
此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。
【原理】
考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。【操作步骤】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、20、40、80、100微克蛋白标准溶液，用水补足到100微升，加入3ml的染色液，混匀后室温放置15分钟。
在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定
稀释血清（或其它蛋白样品溶液），准确吸取0.1ml血清，置入50ml容量瓶中，用生理盐水稀释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作。混匀后室温放置15分钟，在595nm波长比色，计算蛋白质浓度。
【计算】
每100毫升血清中蛋白质的含量（g％）＝
【试剂】
1、考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100 毫升85％的磷酸，加入稀释到1升。
2、蛋白标准（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装，－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、常用试剂的干扰：有些常用试剂在测定中会受到不同程度的干扰。Tris、巯基乙醇、蔗糖、甘油、EDTA及少量去垢剂有较少影响，而1％SDS、1％TritonX-100及1％Hemosol的干扰严重。
2、显色结果受时间与温度影响较大，须注意保证样品与标准的测定控制在同一条件下进行。
3、考马氏亮蓝G－250染色能力很强，特别要注意比色杯的清洗。颜色的吸附对本次测定影响很大。可将测量杯在0.1mol/L HCl中浸泡数小时，再冲洗干净即可。
三、紫外分光光度法
紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是将蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作很简便，而且样品可以回收。
【原理】蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。
【操作】将待测蛋白质溶液适当稀释K倍，在紫外分光度计中分别测定样品在10mm光径石英比色皿中，分别在280nm及260nm两种波长下的吸光度值A280和A260。
【计算】1、当蛋白样品的吸光收比值A280／A260约为1.8，可用下面的公试进行计算：
蛋白质浓度（mg/ml）＝（1.45A280－0.74A260）×K（稀释倍数）
2、也可以先计算出A280／A260的比值后从下表中查出校正因子“F”值，由下面的经验公式计算出溶液的蛋白质浓度。同时从表中还可以查出样品中混杂的核酸的百分含量：
蛋白质浓度（mg/ml）＝F×A280 ×K
注：一般纯净蛋白质的光吸收比值A280/A260约为1.8，而核酸A280/A260的比值约为0.5。【方法评价】操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较大。在使用上表和公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，故计算结果有一定误差。
四、双缩脲法
【原理】
利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。
蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。
但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物
以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。
【操作】
1、取中试管4支，分别标以“1”、“2”、“3”、“4”，吸取27.8％硫酸钠—亚硫酸钠1ml，置“1”管中备用。
2、吸取血清0.2ml于另一试管中，加27.8％硫酸钠一亚硫酸钠4.8ml，用拇指压住管口倒转混合5～6次，放置约15秒，用1ml刻度管吸取1ml置于管“4”中（总蛋白测定管）。
3、将剩余的血清混悬液（如滤液不清，可重复过滤，直至澄清为止），用另一支1ml刻度吸管取此液1ml，置于管“3”（白蛋白测定管）。
4、另用一支1ml刻度吸管吸取标准血清1ml，置管“2”中（标准管）。
5、于上述4支试管中分别加入双缩脲试剂4ml，混匀。
6、在室温下放置10分钟后，以管“1”（空白管）调零，在540nm的波长下进行比色，分别记录“2”、“3”、“4”管的光密读数
【计算】
血清球蛋白含量（克／100ml）＝总蛋白含量—白蛋白含量
白：球比值＝白蛋白含量／球蛋白含量。
【临床意义】
正常人每100ml血清中含蛋白质6～8克，平均7克左右，白／球比为1.5～2.5:1。长期营养不良，
肝脏疾病，慢性肾炎时，总蛋白含量降低；大量失水（如呕吐、腹泻）时则升高。肝脏疾病、慢性肾炎以及慢性传染病有大量抗体生成时，白／球比值变小，甚至倒置。
【试剂与器材】
（一）器材
1、中试管6支。
2、刻度吸管：0.2ml、5ml、10ml、1ml。
3、玻璃漏斗。
4、快速滤纸。
5、分光光度计。
（二）试剂
1、27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液：取浓硫酸2ml加到900ml蒸馏水中，将此含酸蒸馏水加于盛有无水硫酸钠208克及无水亚硫酸钠70克，的烧杯中，边加边搅拌，待液解后全部移至1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度。取此溶液1ml，加蒸馏水24ml，检查其pH，应为7或略高于7，本试剂应贮于25℃温箱中。
2、双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）1.5克及石酒石酸钾钠（C4H4O6KNa·4H2O）6克，分别用适量蒸馏水溶解，混合后加入10％NaOH溶液300ml，最后加蒸馏水至1000ml。
3、标准血清：取经凯氏定氮标定后的血清用15％的NaCl溶液稀释25倍，贮于冰箱中备用。【注意事项】
（一）硫酸钠的溶解度与温度有关，温度低于30℃易结晶析出，故室温较低时应在37℃水浴或恒温箱进行保温。
（二）血清样品必须新鲜，如有细菌污染或溶血，则不能得到正确的结果。
（三）含脂类较多的血清，可用乙醚3ml抽提一次后再进行测定。
五、Folin－酚试剂法（又名Lowry）法
目前实验室较多用用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。
【原理】
蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。
【操作】
1、标准曲线的制备：
按下表操作，在试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白标准溶液，用生理盐水补足到1ml。加入5ml的碱性酮试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入0.5ml酚试剂混匀。
30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。
2、血清蛋白质测定。
稀释血清（或其它蛋白样品浓度）：准确吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作：
混匀各管，30分钟后，在波长650nm比色，读取吸光度。
【计算】
1、以测定管读数查找标准曲线求得血清蛋白含量。
2、无标准曲线时，可以与测定管同样操作的标准管按下式计算蛋白含量：
血清蛋白含量（g%）＝
【试剂配制】
1、碱性酮溶液：
甲液：Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH 100ml溶液中。
乙液：CuSO4?5H2O 0.5克溶于1％酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml，乙液1ml混合。此液只能临用前配制。
2、酚试剂：
取Na2WO4?2H2O 100g和Na2MoO3?2H2O 25g，溶于蒸馏水700ml中，再加85％H3PO4，50ml和HCl（浓）100ml，将上物混合后，置1500ml园底烧瓶中温和地回流10小时再加硫酸锂（Ll2SO2?H2O）150g，水50ml及溴水数滴，继续沸腾15分钟以除去剩余的溴，冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液应呈黄色（如带绿色者不能用），置于棕色瓶中保存。使用标准NaOH滴定，以酚酞为指示液，而后稀释约一倍，使最后浓度为lN。
3、蛋白标准液（0.1mg/ml）
准确称取10mg牛血清蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度。溶后分装，放于－20℃冰箱保存。
【注意事项】
1、Tris缓冲液、蔗糖、硫酸胺、基化物、酚类、柠檬酸以及高浓度的尿素、胍、硫酸钠、三氯乙酸、乙醇、丙酮……等均会干扰Folin-酚反应。
2、当酚试剂加入后，应迅速摇匀（加—管摇一管）以免出现浑浊。
3、由于这种呈色化合物组成尚未确立，它在可见光红外光区呈现较宽吸收峰区。不同实验室选用不同波长，有选用500或540nm，有选用640nm，700或750nm。选用较高波长，样品呈现较大的光吸收，本实验选用波长650nm。
蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度的测定 一．紫外吸收法 1. 近紫外吸收光谱法（280 nm） 原理：蛋白质中含有色氨酸与酪氨酸残基，这两种氨基酸残基具有吸收紫外光的性质，它们的紫外光吸收谱峰值在280 nm附近。某些蛋白质含有二硫键，也会在280 nm附近吸收紫外光。近紫外吸收法就是根据这个性质，对蛋白质进行定量。因为不同的蛋白质中所含有的色氨酸与酪氨酸的数量存在很大的差异，所以蛋白质在280 nm处的吸光度A280也存在非常大的差异。比如，当蛋白质浓度为1 mg/ml时，吸光度A280可为0-4之间的任何值。但是，大部分的蛋白质的吸光度A280时0.5-1.5之间的某个值。 该方法测定蛋白质的浓度具有明显的优缺点。这种方法操作简单，测定完成后，样品可以被回收，对buffer没有特殊要求，这是该方法的优点。该方法的缺点是：其他的生色基团会影响蛋白质吸收光谱的测定，比如核酸在该波长的紫外吸收能力非常强，少量的核酸就会对蛋白质吸光值的测定造成很大的干扰。同时，不同的蛋白质的消光系数需要在实验前确定。 蛋白质浓度的计算： 朗伯比尔定律：A(absorbance) = ε c l，因此：c（mg/ml）= A/ε l (cm)。 消光系数：当蛋白质浓度为1 mg/ml，光径为1 cm时，所测得的吸收值为该蛋白质的消光系数。 蛋白质的消光系数计算公式：A280 (1 mg/mL) = (5690n w + 1280n y + 120n c)/M。其
中M为蛋白质分子质量，5690、1280与120分别是色氨酸、酪氨酸与半胱氨酸的消光系数，n是该氨基酸残基的数目。 2. 远紫外吸收光谱法 在190-210 nm范围内，蛋白质中的肽键具有非常强的吸收紫外光的能力。此波长范围内，肽键在190 nm处的吸收值是其在205 nm的2倍，而且在190 nm，氧气对紫外光的吸收非常强，因此，通常取205 nm处的吸收值对蛋白质进行定量。对于1 mg/ml的蛋白质溶液，它们的消光系数通常在30-35之间。对于不同的蛋白质，其消光系数差别很小。 该方法的优点是操作简单，灵敏度高，样品可以回收。缺点：在使用前，必须对分光光度计进行准确校正，多种buffer，heme or pyridoxal groups在该波长具有很强的吸收紫外光的能力。 测定： 1.用生理盐水溶解蛋白质样品，确保其在215 nm处的吸收值小于1.5。 2.磷酸钾buffer不影响吸收值的测定。 3.计算公式：A2051 mg/mL = 27 + 120 (A280/A205) 或Protein concentration (μg/mL) = 144 (A215– A225)。 Notes: 1.使用这两个方法进行蛋白质定量时，最佳的吸收值范围为0.05-1，当吸收值 为0.3时，测定的结果最精确。 2.如果样品浑浊，可以扣除310 nm处的吸收值。
BCA法测蛋白浓度
【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。 【原理】： BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。 【操作】 标准曲线的绘制：取试管七支、编号，按下表操作： 【计算】 （一）绘制标准曲线。 （二）以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 （三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 【优缺点】 (一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便； (二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。 (三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量； (四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响
【器材】 （一）7220型分光光度计 （二）恒温水浴箱 （三）中试管7支 （四）枪式移液管 【试剂】 1、试剂A：1％BCA二钠盐 2％无水碳酸钠 0.16%酒石酸钠 0.4％氢氧化钠 0.95％碳酸氢钠 混合调PH值至11.25。 2、试剂B：4％硫酸铜。 3、BCA工作液：试剂A 100ml ＋试剂B 2ml混合。 4、蛋白质标准液：用结晶牛血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。 此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。 （此文档部分内容来源于网络，如有侵权请告知删除，文档可自行编辑修改内容， 供参考，感谢您的配合和支持）
bradford法测定蛋白的浓度
Bradford法测定蛋白质的浓度 原理 Bradford测定蛋白质浓度的方法和考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度一样，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速灵敏的方法。 该法是根据最常用的两种蛋白浓度检测方法之一Bradford法研制而成，实现了蛋白浓度测定的快速，稳定和高灵敏度。 利用此方法检测速度极快，10～20个样品只需不足10分钟即可完成。 灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml,最小检测蛋白量达到 0.5ug,待测样品体积为1～20ul。 且在50～1000 ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。 Bradford法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响。样品中-巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM。但受略高浓度的去垢剂影响。需确保SDS低于 0.01%，Triton X-100低于 0.05%，Tween 20, 60, 80低于 0.015%。 试剂和仪器 一、试剂 试剂盒自备： G250染色液、BSA标准蛋白。 BSA标准蛋白浓度已稀释至500μg/ml，-20℃保存。二、测试样品 待测样品蛋白浓度稀释在50-500μg/ml范围内为宜。
三、仪器 96孔酶标、酶标仪。 操作方法 标准品编号 500ug/mlBSA/μl 蒸馏水/μl10302 1.5 28.45 12 186 6830 0分别于小离心管中混匀后，取20μl加入到对应酶标孔中待测样品编号31415……待测样品稀释后，各取20μl加入到相应酶标孔中G250/μl200μl/孔 反应3-5min 1.用酶标仪测定A595nm处的吸光值。 2.根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。
蛋白质浓度测定集合
一、蛋白浓度的直接测定（UV法） 这种方法是在280nm波长，直接测试蛋白。选择Warburg 公式，光度计可以直接显示出样品的浓度，或者是选择相应的换算方法，将吸光值转换为样品浓度。蛋白质测定过程非常简单，先测试空白液，然后直接测试蛋白质。从而显得结果很不稳定。蛋白质直接定量方法，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质。紫外直接定量法相对于比色法来说，速度快，操作简单；但是容易受到平行物质的干扰，如DNA 的干扰；另外敏感度低，要求蛋白的浓度较高。 （1）简易经验公式 蛋白质浓度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor （2）精确计算 通过计算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通过如下公式计算最终结果： 蛋白质浓度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D 其中d为测定OD值比色杯的厚度 D为溶液的稀释倍数
二．紫外吸收法测定蛋白质含量 【实验目的】 1. 学习紫外吸收法测定蛋白质含量的原理。 2. 掌握紫外分光光度计的操作方法。 【实验原理】 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。 紫外吸收法可测定0.1-0.5mg/ml的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。 【实验材料】 1.实验器材 试管及试管架；50毫升容量瓶 2只；移液管；紫外分光光度计。 2.实验试剂 (1)标准蛋白质溶液：精确配制2mg／ml的酪蛋白溶液。 (2)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。
蛋白浓度测定的各种方法
蛋白浓度测定的各种方法 蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。 蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法，BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法 蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量
范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。常用的测定蛋白质含量方法的比较方法 测定范围 （μg/ml） 不同种类 蛋白的差异 最大吸收 波长(nm) 特点凯氏定氮法
小 标准方法，准确，操作麻烦，费时，灵敏度低，适用于标准的测定紫外分光光度法 100—1000 大 280
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。 [操作步骤] 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比，可用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 [试剂] 1．双缩脲试剂：取CuSO4·5H20(c.P.)1.5g和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加2.5mol／L NaOH溶液300ml，KI 1.0g，然后加水至1000ml。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。 2．标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10g/L的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1g/L的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0.05mol/L NaOH配制。 [器材] 1．试管：15×150mm 试管7只； 2．1ml，5ml移液管； 3．坐标纸； 4．721分光光度计。 [操作步骤]
实验一 蛋白质浓度的测定实验报告
蛋白质浓度的测定 一．实验原理 考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当他与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感性。 在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。故可用于蛋白质浓度的测定。 二．实验设备与试剂 设备：普通离心机，721型分光光度计 试剂：标准蛋白液（100ug/ml） 三．实验材料 新鲜绿豆芽 四．实验内容 1.标准曲线的制备 取9支干净的试管，按表进行编号并加入试剂。 2.样品蛋白的测定 （1）样品蛋白液制备 准确称取2g新鲜绿豆芽胚轴的部分，研磨成匀浆，离心分离（4000r/min,10min）。取上清液用0.9%nacl定容到10ml。 （2）含量测定 另取两只干净的试管，加入样品液0.1ml，0.9mlnacl和考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀。室温静置3min，与波长595nm处比色，读取吸光度。 五．实验结果 1.标准曲线 结果如表所示，并以吸光度为纵坐标，个标准液含量为横坐标做标准曲线。
2.样品蛋白含量的测定 样品蛋白的比色结果如表，根据直线方程求出每支试管中蛋白质含量。 根据公式求出样品绿豆芽蛋白质含量 样品蛋白的体积 蛋白质含量（ug/g鲜重）= 测定时取样的体积 称取样品的重量 六．结果与讨论 结果：绿豆芽蛋白质含量=1233.0ug/g 讨论： 1.试液为混合均与就取样 2.量取溶液时读数有误差 3.读取A值时有读数误差 4.比色杯中的误差
蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法 一、实验目的 学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。 二、实验原理 考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G250 的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大 吸收峰改变为595nm。考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合 比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标 准蛋白质溶液。 （2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后， 再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。 2. 器材： （1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支 三、操作方法 1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行） 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 标准蛋白 含量( g) 0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0 标准蛋白 溶液 （0.1mg/ mL）(mL) 0．1 0．2 0．3 待测蛋白 质溶液 (mL) 2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1. 3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水 (mL) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 考马斯亮 蓝试剂
摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm 以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。 2. 未知样品蛋白质浓度的测定 测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。 四、实验结果 1．标准曲线的绘制 2．蛋白浓度的计算 鸡血清稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.421 羊血清稀释200倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.500 肝匀浆稀释100倍后0.1mL样品测得OD595nm平均值为0.360 再将各所得OD值代入以下公式计算: 蛋白质含量(mg/mL)=(96.28﹡OD﹣9.1704)( μg)﹡稀释倍数/100(μL) 求得各样品浓度如下: 鸡血清=31.36 mg/mL 羊血清=77.94 mg/mL
可溶性蛋白质含量的测定
植物体内可溶性蛋白质含量的测定 植物体内的可溶性蛋白质含量是一个重要的生理生化指标，如在研究每一种酶的作用时常以比活(酶活力单位／毫克蛋白质，unIT／Mg ProTeIn)表示酶活力大小及酶制剂纯度，这就需要测定蛋白质含量。常用的测定方法有LoWry法和考马斯亮蓝G－250染色法，本实验将分别介绍这两种方法。 方法一：LoWry法(劳里法) 【原理】 LoWry法是双缩脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸(PHosPHoMolyBdATe ＆PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。LoWry法除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3～15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。LoWry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1.双缩脲法的原理双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。 双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1～10Mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约05Mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如TrIs缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。 2.福林-酚法的原理该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应： (1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。 (2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(ＦolIn试剂)还原，混合物深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5～100μg蛋白质。ＦolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
蛋白质含量测定方法比较
. 蛋白质含量测定主要有五种方法，分别是凯式定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、酚试剂法和考马斯亮蓝法。这五种方法各有特点，优缺点明确。 凯氏定氮法 蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 优点：重现性好，是目前分析有机化合物含氮量常用的方法,是一种蛋白质测定的经典方法, ,测试结果准确。 缺点：操作比较繁复，费时,试剂消耗量大。且此法测定的蛋白质含量实际上包括了核酸，生物碱，含氮类脂，卟啉，含氮色素等非蛋白质含氮化合物。 双缩脲定氮法 双缩脲（NHCONHCONH）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个33分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称4为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 优点：较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的
缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋1 / 5 . 白质测定。 缺点：不太灵敏；不同蛋白质显色相似。 紫外吸收定氮法 双缩脲法是传统的分光光度法测定蛋白质的方法,当含有两个或者两个以上肽键的物质和碱性的硫酸铜反应时,形成紫色的络合物,这个颜色产物是肽键中的氮原子和铜离子配价结合的结果。蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。形成颜色产物的量取决于蛋白质的浓度。实际测定时,必须预先用标准蛋白质溶液制作一个标准校正曲线,通常用牛血清白蛋白水溶液做蛋白质标准溶液。不同浓度的标准蛋白质溶液加入双缩脲试剂后,反应生成的颜色产物用紫外-可见分光光度计在540nm 波长下测定吸光度,以双缩脲试剂加缓冲或水作空白对照。然后将测得的值分别对蛋白浓度(mg/ ml) 作图,得标准曲线。未知蛋白样品用双缩脲试剂做同样处理,根据测得吸光度值在标准曲线上直接查得未知蛋白质样品中得蛋白质浓度。 优点：对各种蛋白质呈色基本相同;特异性和准确度好,精密度好;呈色稳定性好,试剂单一,方法简便。快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。 缺点：准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。此外，进行紫外吸收
蛋白质测定实验报告
蛋白质测定方法——化学报告
蛋白质的检测 酚试剂法灵敏度较高 20~250mg 费时蛋白质在碱性溶 液中其肽键与 Cu2+螯合，形成 蛋白质一铜复合 物，此复合物使 酚试剂的磷钼酸 还原，产生蓝色 化合物 酚类、柠檬 酸、硫酸铵、 tris缓冲液、甘 氨酸、糖类、 甘油等均有干 扰作用
由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以实验的形式进行详细阐述： 1 材料与方法 1.1 仪器材料 (1)仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。 (2)试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、0.12mol/LpH=4. 7醋酸- 醋酸钠缓冲液、乙醇-乙醚等体积混合液、浓H2SO4 、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0. 050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾- 硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、双缩脲试剂、考马斯亮蓝G- 250试剂。 1.2 实验方法 (1)凯氏定氮法测定蛋白质含量 将待测样品与浓硫酸共热,含氮有机物即分解产生氨(消化) ,氨又与硫酸作用,变成硫酸铵。为了加速消化,可以加入CuSO4 作催化剂和加入K2SO4 以提高溶液的沸点,而加入30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进行滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。 (2)紫外吸收法测定蛋白质含量 蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸收紫外光的性质,吸收峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下,蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系,可以进行蛋白质含量的测定。 紫外吸收法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,
蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告)
蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法 （实验报告） 实验日期：2015年4月28日实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：*** 班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：******** I. 实验目的 1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法； 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II. 实验原理 考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。 考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂
(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液 5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。 (2)考马斯亮蓝G-250试剂 50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。 (3)正常人血浆。 2.实验器材 可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。 IV. 实验操作步骤 1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂 混匀，室温放置5min后即可比色。以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。 标准曲线绘制数据表
012345样1样2标准蛋白μg 数 020********* A59500.51 70.80 5 0.94 1 1.15 7 1.19 2 1.46 5 1.44 2.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。 V. 实验结果分析 结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。
蛋白浓度测定
蛋白浓度测定 BCA法测定样品蛋白的浓度 1、原理：在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu2+ 络合，将Cu2+还原成Cu+。BCA 试剂可敏感特异地与Cu+结合，形成稳定的有颜色复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。通过制备经过梯度稀释的、浓度抑制的一组蛋白质标准品，然后将其与未知浓度的待测蛋白质仪器检测，根据绘制出的标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。 2、准备：96孔板、枪（枪头）、酶标仪（提前开启）、Pierce的BCA蛋白定量分析试剂盒、PBS、蛋白标准品（-20℃分装保存）、PBS缓冲液、待测蛋白样品。注意：蛋白标准品有两种：一种是BCA试剂盒原装蛋白标准品（2mg/ml），另一种是10mg/ml蛋白标准品，需要稀释到2mg/ml。 3、操作步骤： ①准备1ml RIPA裂解液：加100μl phosstop、10μl cocktail和10μl PMSF到880μl 1X RIPA buffer中，混匀后置于4℃中备用。（若蛋白提取完后直接进行蛋白定量，则可直接用剩余的裂解液。） ②准备BSA标准品：Pierce BSA原浓度为2 mg/ml，取5个200μl EP管按下表配好标准品。
设置好每孔所加样品后（如下表）： ③涡旋混匀标准品，每个加10ul （横排并列第二个做复孔）。 ④涡旋混匀待测蛋白，每个加1ul （横排并列第二个做复孔）。 ⑤加140ul水到标准品孔，149ul水到待测样品孔。 ⑥根据数量（标品5*2个+待测样品n*2个），按A:B=50:1配制BCA工作液，每孔100ul。（若需5ml，则5ml A液+ 100ul B液） ⑦用保鲜膜覆盖孔板后，再盖上孔板盖子，置于60℃孵育20min，在酶标仪540-570 nm (562 nm) 处读值。 4、注意事项： ①在加标准蛋白或样品蛋白时，应用相应量程的枪头对溶液进行充分的混匀，以降低因溶液浓度不均对实验造成的影响。 ②在操作过程中，对枪的量取要细心，防止枪头内残余太多标准蛋白样品，影响标准曲线的绘制。 ③此法测浓度，所加的标准品及样品的量都极少，在操作过程中，在吸取标准蛋白及样品时，尽量只让枪头的口接触液面吸取，以减少实验误差。 ④使用排枪加液体时要注意观察排枪所吸取液体的体积是否一致，加入孔中时避免打出气泡，干扰酶标仪测定。 ⑤测浓度要求精确，否则会导致上样量不一致，所以每个样品都要换枪头。
蛋白浓度的测定
蛋白质浓度测定：紫外分光光度法 OD280/OD260＜1.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mg/m1)＝1.45*OD280一0.74*OD260 OD280/OD260﹥1.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mg/m1)= OD280/K×L＝（OD280/6.3×1）×10g/L 本实验样品：牛血清白蛋白E1%cm＝6.3（100ml/cm.g） K：克分子消光系数；E1%cm：百分比吸光度的吸光系数； 注：不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故标准管与测定管的蛋白
质氨基酸组成应相似，以减小误差。 OD是optical density（光密度）的缩写， OD＝1og（1/trans），其中trans 为检测物的透光值。 吸光度：吸光度，absorbance，是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来，同一种物质，吸光系数就不变。当一束光通过一个吸光物质（通常为溶液）时，溶质吸收了光能，光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。 吸光度用A表示， A＝abc，其中a为吸光系数，单位L/（g·cm），b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ，c为溶液浓度，单位g/L。影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量，温度通过影响c，而影响A。 一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表其他杂质（多糖等）的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一个意思。 A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的DNA一般在1.8~2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260和A280读数；同时，对同一样品10倍数量级稀释后测定吸光值发现，分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是：当A260读数处在0.1-0.5 之间，A200 到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚（30 ul/ml）残留使A230，A260，A280均变大（差不多增加一倍），但A260/A280和A260/A230均在2左右。 少量异硫氰酸胍（132 uM）残留使A230变大，但A260，A280几乎不变，所以A260/A280仍在2左右，而A260/A230大大低于2。大量异硫氰酸胍（2.4 M）残留使A230，A260，A280均变大，根本就没有办法测定了。PEG（6.25%）残留使A230，A260，A280均变大，但对A230，A260影响更大，所以A260/A280比2大不少，而A260/A230仍在2左右。 核酸抽提中常用的试剂，如Phenol，GuanidineIsothiocyanate，PEG都能使A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致。因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280和A230。干净的核酸A260/A230应该在2左右。如果有在230 nm 处的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物 1.蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
BCA法测定蛋白浓度-酶标仪 一、药品 1.BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，500次酶标仪，碧云天），含以下成分： a)BCA试剂A（P0012-1，100ml，碧云天），室温保存 b)BCA试剂B（P0012-2，3ml，碧云天），室温保存 c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（P0012-3，1ml，碧云天），-20度保存 二、仪器和试剂 1.酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm最佳），水浴锅 2.96孔单条可拆酶标板（平底） 3.15 ml 离心管1个（准备BCA工作液用） 4. 1.5 ml 离心管1个（准备蛋白标准品工作液用） 5.单道移液器和枪头，8道移液器（排枪）和枪头 6.PBS 三、操作步骤 1.水浴锅调至37℃。 2.蛋白标准品工作液（1 mg/ml）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-20℃冰箱中取 出，完全溶解并混匀。取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240μl PBS，即稀释5倍，即配成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。 3.计算BCA工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×2×1.1（标准品和样本均需测复孔）。 BCA工作量按50体积的BCA试剂A加上1体积的BCA试剂B配制（即50:1），需充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
4.按下表配制8个蛋白标准液（S0~S7），充分摇匀。 蛋白标准品工作液（1 mg/ml）(l)PBS (l) 5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。 （1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比为10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml时。如预计蛋白浓度太高或太低，
蛋白浓度测定
蛋白质的定量分析是生物化学和其它生命学科最常涉及的分析内容，是临床上诊断疾病及检查康复情况的重要指标，也是许多生物制品，药物、食品质量检测的重要指标。在生化实验中，对样品中的蛋白质进行准确可靠的定量分析，则是经常进行的一项非常重要的工作。蛋白质是一种十分重要的生物大分子：它的种类很多，结构不均一，分子量又相差很大，功能各异，这样就给建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析的方法代来了许多具体的困难。目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法： 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法，BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法 蛋白质测定的方法很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。例如凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，用于大批量样品的测试则不太合格；双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；考马氏亮兰染色法因其灵敏而又简便开始重新受到关注；BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎；胶体金法具有较高的灵敏度，可达到毫微克水平，用于微量蛋白的测定。 常用的测定蛋白质含量方法的比较
由于凯氏定氮法的操作作过于复杂，双缩脲法的灵敏度又太低，下面介绍Folin—酚试剂法，考马氏亮蓝G—250染色法，紫外分光光度法、胶体金法等几种最常用使用的方法。 一、Folin－酚试剂法（又名Lowry）法 目前实验室较多用用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。 【原理】 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。 【操作】 1、标准曲线的制备： 按下表操作，在试管中分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ml蛋白标准溶液，用生理盐水补足到1ml。加入5ml的碱性酮试剂，混匀后室温放置20分钟后，再加入0.5ml酚试剂混匀。 30分钟后，以第1管为空白，在650nm波长比色，读出吸光度，以各客的标准蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘出标准曲线。 2、血清蛋白质测定。 稀释血清（或其它蛋白样品浓度）：准确吸取0.1ml血清，置于50ml容量瓶中，用生理盐水释释至刻度（此为稀释500倍，其它蛋白样品酌情而定）。再取三只试管，分别标以1、2、3号，按下表操作：
BCA蛋白浓度测定-酶标仪法
. 酶标仪BCA法测定蛋白浓度-一、药品500次酶标仪，碧云天），含以下成分：BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0012，1. 100ml，碧云天），室温保存试剂A（P0012-1，a)BCA ，碧云天），室温保存P0012-2试剂B（，3mlb)BCA 度保存P0012-3，1ml，碧云天），-20c)蛋白标准（5mg/ml BSA）（二、仪器和试剂最佳），水浴锅酶标仪（测定波长为540-595nm之间，562nm1. 孔单条可拆酶标板（平底）2.96 1个（准备BCA工作液用）3.15 ml 离心管个（准备蛋白标准品工作液用） 1.5 ml 离心管14. 道移液器（排枪）和枪头5.单道移液器和枪头，8PBS 6. 三、操作步骤℃。1.水浴锅调至37℃冰箱中取出，）的配制：将蛋白标准品（5mg/ml）从-202.蛋白标准品工作液（1 mg/ml倍，即配μl PBS，即稀释5完全溶解并混匀。取60μl 蛋白标准品（5mg/ml），加入240 成蛋白标准品工作液（1 mg/ml）。BCA。2×1.1（标准品和样本均需测复孔）BCA计算工作液总量= 0.2 ml×（样本数+8）×3. BCA需充分混匀。50:1），体积的BCA试剂B配制（即试剂工作量按50体积的BCAA加上1 24工作液室温小时内稳定。
S0~S7），充分摇匀。4.按下表配制8个蛋白标准液（ 0.2 20 D 80S3 0.3 S4 7030E 0.4 S5 F 40 600.5 G 50 50S6 1.0 0S7 100H 5.将96孔酶标板的A1孔放在左上角，按下表加入蛋白样本和标准品。 （1）先在第3~4条酶标板的蛋白样本孔（N 1~N8）中加入待测蛋白样本各2μl，再用排枪在蛋白样本孔中追加PBS液各18μl，使总量达到20μl。（此时蛋白样本的稀释比1 / 2 . 时。如预计蛋白浓度太高或太低，可适当10，适用于预计蛋白浓度为2~8mg/ml为调整稀释比例）个蛋白标准液S0~S7）中加入上面配制的8）（2再在第1~2条酶标板的蛋白标准品孔（。
蛋白质含量测定
实验十六蛋白质含量的测定 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求： 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消 化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理： 凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 ( 1 ) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04(NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2 (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4 (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O (4) (NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器： 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液 6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成． 7、0.01mol/LHCL标准溶液或0．01mol/L硫酸标准溶液． 8、KDN-08A(04A)定氮仪 10、三角瓶250ml 3只。 11、量筒50ml、l0ml、l00ml。