探究卵巢病变冰冻切片与石蜡切片病理诊断的对比
探究卵巢病变冰冻切片与石蜡切片病理诊断的对比
发表时间：2018-04-28T13:17:40.603Z 来源：《中国医学人文》2018年第1期作者：赵宇
[导读] 提高制片质量并加大取材范围、提高诊断水平并加强与临床医生的沟通，可提高卵巢病变术中诊断的准确率。
七台河市妇幼保健院 154600
【摘要】目的研究分析卵巢病变冰冻切片与石蜡切片的病理诊断比较，分析未确诊或误诊的原因，以提高术中诊断的准确性。方法此次研究的对象是选择568例卵巢病变手术患者，将其临床资料进行回顾性分析，对比术中冰冻切片和术后石蜡切片的诊断结果。结果术中冰冻切片和术后石蜡切片结果完全符合533例（93.8%）、基本符合13例（2.3%）、未确诊15例（2.6%）、误诊7例（1.2%），冰冻诊断确诊率为96.1%。结论提高制片质量并加大取材范围、提高诊断水平并加强与临床医生的沟通，可提高卵巢病变术中诊断的准确率。
【关键词】卵巢病变；冰冻切片；石蜡切片；病理诊断
Objective to study and compare the pathological diagnosis of frozen section and paraffin section of ovarian lesions, and analyze the causes of undiagnosed or misdiagnosed diseases, so as to improve the accuracy of intraoperative diagnosis. Methods the object of this study was to select 568 patients with ovarian lesions. The clinical data were retrospectively analyzed, and the diagnostic results of frozen sections and paraffin sections after operation were compared. Results intraoperative frozen section and postoperative paraffin section were 533 cases (93.8%), 13 cases (2.3%), 15 cases (2.6%) were not diagnosed, 7 cases (1.2%) were misdiagnosed, and the diagnostic accuracy of frozen diagnosis was 96.1%. Conclusion the accuracy of intraoperative diagnosis of ovarian lesions can be improved by improving the quality of film production, increasing the range of materials, improving the diagnostic level and enhancing communication with clinicians.
[Key words] ovarian disease; frozen section; paraffin section; pathological diagnosis
冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，再进行切片的方法，在术中能及时明确病变性质和类型，为临床选择合适的手术方案提供了依据。诸多研究[1-4]表明术中冰冻诊断是有效的，但都存在极少数的误诊或未确诊的情况，分析和总结误诊或未确诊的因素，提高准确性成为一个研究热点。本文通过对卵巢病变冰冻切片与术后石蜡病理诊断结果进行统计分析，并总结切片诊断不相符的原因，进一步提高卵巢冰冻切片诊断的准确性。
1 资料与方法
1. 1 一般资料选择2011年1月～2016年12月收治的568例卵巢病变手术患者，年龄6～86岁，平均年龄（38.45±11.74）岁，病变位于左侧228例、右侧212例、双侧128例。
1. 2 方法按照卵巢病变性质分为良性（非肿瘤性囊肿、良性肿瘤）、交界性、恶性（原发性肿瘤和转移性肿瘤），按照组织学分类标准分为上皮源性肿瘤、性索-间质肿瘤、生殖细胞肿瘤，分别统计术中术后病理诊断结果、组织来源诊断情况，并比较冰冻切片及石蜡切片病理诊断的准确率。
1. 3 评价标准为研究冰冻诊断的准确性，将判断标准分为三种：确诊包括完全符合和基本符合，完全符合：术中冰冻切片诊断和术后石蜡切片诊断完全一致；基本符合：良性和恶性判断一致，分类有差异；未确诊：术中不能通过冰冻切片确定病变性质，仅向临床医生提供切片所反映的特征和参考意见；误诊：良性和恶性判断不一致或者肿瘤来源不一致。
2 结果
2. 1 卵巢病变的统计描述卵巢病变按照性质分类，术中诊断为良性473例、交界性肿瘤15例、恶性肿瘤65例（准确性分别为99.4%、86.7%、92.9%），未确诊15例。在与术后诊断对比中，有3例良性肿瘤（2例应为交界性、1例应为恶性）、4例交界性肿瘤（应为恶性肿瘤）诊断错误，共计7例误诊。按照组织来源分类，上皮源性肿瘤的数量最多194例（34.2%），生殖细胞肿瘤次之72例（12.7%），性索-间质肿瘤6例（1.1%），其他296例（52.1%）。
2. 2 术中冰冻切片与术后石蜡切片诊断比较术中对568例冰冻切片进行诊断，术后进行石蜡切片进行确诊。术中确诊546例（完全符合533例，占9
3.8%，基本符合13例，占2.3%）、未确诊15例（2.6%）、误诊7例（1.2%），冰冻准确率96.1%。未确诊的病理主要是冰冻切片质量欠佳或者取材不充分、只能用“不排除”、“倾向”、“待进一步”等词对病变特征进行描述并为临床医师提供参考意见。误诊病例7例：性质和组织来源均判断错误6例，具体表现在术中冰冻切片诊断为交界性4例，术后石蜡切片诊断为恶性；术中冰冻诊断为良性2例，术后诊断为交界性。1例性质诊断错误，术中诊断为良性，术后诊断为恶性。
3 讨论
冰冻切片是术中常用的病理诊断方式，可对手术方式进行指导，其诊断结果均高于其他检查方法，已经广泛应用于外科手术中[4]。因此冰冻切片的准确性保障手术的治疗效果。石蜡切片病理诊断可以作为最终确诊方式，其诊断时间较长，无法在术中应用，而冰冻切片可在30 min内获得诊断结果，可在手术中对病灶性质进行确定，以明确手术方式。另外，针对恶性肿瘤患者，手术切除肿瘤组织后，可根据组织边缘的检查，判断肿瘤是否切除干净，避免二次手术给患者带来的伤害。
本文收集了568例卵巢病变的冰冻诊断确诊率为96.1%，与李凡等[3]统计的卵巢病变术中诊断准确性相似。交界性肿瘤冰冻诊断确诊率为86.7%，符合报道中的确诊率。Kayikcioglu等[5]报道33例卵巢交界性肿瘤患者的误诊情况（3例术中为良性、术后为交界性， 4例术中为交界性、术后为恶性），徐炼等[6]研究了交界性肿瘤诊断可能出现的错误，并给出一些建议，本文中报道的误诊有6例（共7例误诊）与交界性肿瘤相关。另外， 15例未确诊病理主要体现在冰冻切片不能排除局灶有交界性肿瘤，需要石蜡切片作进一步的诊断。
由于冰冻诊断存在时间紧、取材的局限性以及送检组织较小等原因，会造成漏诊或误诊，特别是交界性肿瘤的冰冻诊断要格外注意[6-8]。在实际中导致误诊或者未确诊的原因如下：取材不充分、制片质量差、诊断水平不高、与临床医生沟通不足等 [9]。为提高冰冻诊断的准确率，可做改进如下：①提高技师的业务水平，确保制片质量；②加大取材范围，不同质地的组织分别取材；③提高病理诊断医生的诊断水平，多总结，积累阅片经验；④加强与临床医生的沟通；⑤冰冻切片与细胞学涂片诊断相结合，可提高临床诊断准确率。
参考文献
[1] 刘群，巴合提牙尔·祖农，白惠君，等. 655例卵巢肿瘤术中快速冷冻病理检查的准确性分析. 诊断病理学杂志， 2016， 23（2）：
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
冰冻切片快速病理诊断30年总结
冰冻切片快速病理诊断30年总结 秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编：066001 术中冰冻切片快速病理诊断是1818年由Pieter de Riemer首先创造发明的，1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法。目前国内外已将此项技术普遍应用于临床，解决手术中的病理诊断问题。并日益受到外科医生和患者的欢迎和肯定。随着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增多，截止到2012年10月份，本院病理科开展快速冰冻病理诊断30余年，共完成冰冻快速病理诊断1476例，积累了一定的经验和教训，为了更进一步提高冰冻快速病理诊断水平，提高冰冻诊断准确率，降低误诊率，作者将30年来所有冰冻切片快速病理诊断病例进行总结分析如下。 1 材料和方法 1.1 一般资料本组1476例大部分来自本院住院病人，小部分来自其他医院。其中男897例，女579例，年龄最大81岁，最小5个月。 1.2 病变部位乳腺1052例，软组织42例，胃33例，淋巴结33例，骨12例，腹膜9例，睾丸及附睾8例，甲状腺47例，小肠15例，大肠25例，膀胱5例，脊椎5例，阑尾10例，胆道14例，阴茎19例，卵巢53例，脑及脑膜3例，前列腺3例，肝12例，肾26例，脊髓2例，喉2例，子宫42例，精索1例，纵隔1例，腹膜后1例，眼1例。 1.3 方法本组1476例均采用德国进口莱卡冰冻切片机切片，HE染色，普通光学显微镜观察。 1.4 结果1476例中，恶性肿瘤687例，良性肿瘤388例，瘤样病变170例，炎症202例，结核29例，确诊1457例，未能确诊15例，误
诊4例。 2. 讨论 冰冻切片质量差，最初很多著名的病理学家如Ewing、Brewer、Simpson等曾经怀疑冰冻切片的准确性，1960年Cryostat冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提高，但和石蜡切片相比仍很逊色，对准确的冰冻病理诊断带来一定困难，尤其对年轻的病理科医生来说难度较大，缺乏经验的病理科医生难以胜任此项工作，下面根据自己个人的经验发表一点看法。 2.1 冰冻切片快速病理诊断的优缺点：冰冻切片快速病理诊断的优点是在手术过程中随时取材，迅速做出准确可靠的病理诊断，同时也减少了病人二次手术的痛苦。缺点是切片厚，细胞大，层次多，易造成错觉。另外冰冻切片诊断要求报告快，没有更多思考讨论余地，一旦报错，将造成严重的无法弥补的后果。 2.2 准确率：本文对1476例冰冻切片进行了统计分析，结果准确率为98.7%，未能确诊率为1.02%，误诊率为0.3%，与国内报道相比准确率相仿，而误诊率低于各家报道。 2.3 未能确诊和误诊的原因：⑴取材不当：恰当准确的取材是正确诊断的必备条件，取材不当就不可能得出正确的病理诊断。当临床切取肿物困难时，所送检的肿物标本不一定是肿物中心组织，很可能是肿物边缘组织，这种组织大部分是肿物周围的正常成分，或仅带有少量肿物，此时应多切几个切面进行观察，在把握不足的情况下可多取几块组织做切片，以防漏诊。⑵切片质量不佳：切片过厚，组织未能展平出现折叠，组织缺损，染色深浅不均等都直接影响诊断结果。
冰冻切片实验方案和HE染色
2-3人一组，分为7组（上课时需携带实验步骤） 冰冻切片操作方法及步骤： 1取材：(昆明小鼠各个组织或器官) 取材时不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。 2包埋： 取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。 小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。 注意：大组织进行包埋时，只要使组织固定在支承器上即可，切勿浪费包埋剂。 3修平： 将冷冻好的组织块，夹紧于切片机直承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。 注意：修平过程中，正确使用切片机，不要一次性大量切割组织块，以防损毁切片刀。 4切片： 调好切片的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。 5调防卷板： 制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。 6切片工作完成后，将冷冻机内的所有废物清理干净，切勿乱扔。 冰冻切片时的注意事项： 1 防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。 2 多例多块组织同时需做冰冻且片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。 3 放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。 4 组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。 5 当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。 6 用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
免疫组化方法(冰冻切片)
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
甲状腺癌术中冰冻切片误诊的诊断与治疗
甲状腺癌术中冰冻切片误诊的诊断与治疗 【摘要】目的探讨甲状腺癌术中冰冻切片误诊的诊断和治疗的对策。方法回顾性分析本院22例术中冰冻切片误诊的甲状腺癌患者的临床资料。结果再次手术13例,行患侧残余腺叶并峡部及对侧腺叶次全切除术10例,加全组淋巴结清扫术2例,患侧残余腺叶并峡部切除术3例。二次手术石蜡病理切片提示残余癌3例,1例残余腺体未见癌组织,肿大的淋巴结见癌组织,残癌率为30.77%。结论对于临床高度怀疑甲状腺癌而冰冻切片未能确诊的病例一期行患侧腺叶全切术或次全切除术是可行的,可以避免二次手术。 【关键词】甲状腺癌;病理学检查;再手术 甲状腺癌在头颈部肿瘤中发病率较高,约占头颈部恶性肿瘤的5.1%。由于大多数甲状腺癌分化良好,生长缓慢,恶性程度低,主要采用手术治疗,首次手术方式选择正确与否对预后尤为重要。而术中冰冻切片是目前诊断甲状腺癌最可靠的方法,外科医生常根据其结果来决定手术方式。但冰冻切片存在着一定的假阴性率,本文对术中冰冻病理诊断为甲状腺良性肿瘤,而术后石醋切片为甲状腺癌的22例资料进行分析。 1 资料和方法 1.1 一般资料本组22例,男6例,女16例,男女比为1: 2.7,年龄14~73岁,平均38.5岁。22例均以颈部肿物就诊,病程为10 d~11年,肿物大小在1~7 cm,位于左侧5例,右侧8例,双侧9例;所有病例双侧颈部均未扪及肿大淋巴结。 1.2 辅助检查结果术前18例行B超检查,拟诊甲状腺腺瘤9例,甲状腺腺瘤囊性变3例,结节性甲状腺肿4例,甲状腺占位性病变2例;1例行CT检查提示弥漫性甲状腺肿,甲状腺推移、压迫气管。所有病例均未发现颈部有肿大淋巴结,病灶未见有钙化影,所有病例术前未行穿刺活检术。 1.3 术中冰冻切片结果甲状腺良性病变18例,结节性甲状腺肿3例,甲状腺良性肿瘤,未排除恶变可能1例。术后石蜡病理切片检查为甲状腺癌,其中滤泡癌7例,乳头状癌15例。伴结节性甲状腺肿4例。 1.4 治疗情况首次手术方式:患侧腺叶局部切除术10例,次全切除术3例,双侧局部肿块切除术3例,双侧腺叶全(次)切除术6例,1例加同侧颈前淋巴结清扫术。二次手术行患侧残余腺叶并峡部及对侧腺叶次全切除术10例,加全组淋巴结清扫术2例,患侧残余腺叶并峡部切除术3例,其余9例未再次手术。 2 结果 2.1 再次术后病理情况二次手术石蜡病理切片提示残余癌3例,1例残余腺体未见癌组织,肿大的淋巴结见癌组织,其余9例切除标本未见癌组织残留,残癌率
冰冻切片实验步骤
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
冰冻切片步骤 很全面
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及
关于开展术中快速冰冻切片病检的通知
关于开展术中快速冰冻切片病检的通知 各临床科室： 手术中快速冰冻切片病理检查是一项特殊的临床病理急会诊工作。我院与××医院病理科协作，开展术中快速病理冰冻检查，现将相关事宜通知如下： 1、目的： （1）明确送检标本是否有病变； （2）明确病变的性质（良性或恶性或交界性），确定淋巴结是否转移或邻近脏器有无浸润，以便制定手术方案； （3）了解手术切缘有无癌瘤残留，以决定手术范围。 2、预约： 手术前一天由手术者电话预约，预约电话：﹢﹢﹢﹢﹢（科室座机）或﹢﹢﹢﹢﹢﹢﹢（手机）。 已预约申请的患者，如根据术中实际情况或其它原因不再进行快速冰冻切片病理检查时，临床医师应及时通知病理科撤销预约申请。 3、送检标本注意事项： （1）对需做术中冰冻切片病理检查的标本请勿用生理盐水或流水冲洗，请勿固定，离体后尽快送达病理科。 （2)送检肿物要完整，不得只送检部分，否则病理科有权拒收标本。 （3）对于怀疑乳腺导管内病变的标本，请临床手术医师务必在病变导管开口标记（可系线）；对于乳腺不可触及的影像学检查有异常的病变部位请务必标记（可金属针定位）；对于保乳手术的标本，请务必标记切缘。 （4）对于肿物较小的标本请务必做好标记。 （5）对于肿瘤肉眼可见的种植或转移灶或转移的淋巴结，请与肿瘤一并送检，尤其是卵巢肿瘤。 4、收费： 凡送术中冰冻切片病理检查同时也应做常规病理检查。 冰冻﹢﹢元+常规﹢﹢元=﹢﹢元（一个标本）。 5、送检：由检验科协同司机班送检。 6、流程： 手术者术前填写好术中快速病检同意书——患者或家属签字——处置单上账——术中取出的标本、同意书、已上账的处置单一并送病理科——××分钟左右病理科电话反馈快速冰冻病检结果——×天后病理科反馈常规病检结果。 医务科 二〇××年×月×日
冰冻切片免疫荧光染色流程
冰冻切片免疫荧光染色流程(表面分子，以CD4为例) （1）冰冻切片室温晾干15分钟； （2）用组化油笔将待染组织圈好，置PBS中浸泡10分钟，以去除OCT；（3）用含10％正常山羊血清的PBS室温封闭切片1 小时（此步可以不洗涤，把封闭液吸干即可）； （4）加入CD4单抗(1:100; SeroTec, Inc, Raleigh, NC, USA)，4℃孵育过夜；（5） PBS洗3次，每次10分钟； （6）加入罗丹明标记的羊抗小鼠的IgG二抗(1:50; Sigma 公司)，37℃孵育1小时； （7） PBS洗3次，每次15分钟； （8）封片后，荧光显微镜观察结果并拍照； （9）在每切片中随机选择5个视野计数阳性细胞数。 注意事项：（1）整个实验过程中勿使表面干燥 （2）稀释、加二抗（荧光抗体）及此后的洗涤过程中注意避光 附注1：如目的分子为胞内分子，各种液体中需要加透膜剂0.3%TrixtonX100。附注2：所用液体（表面分子染色不用0.3%TrixtonX100）： （1）pH7.4 0.01MPBS： 配方为：0.1MPBS 100ml+ddH2O 900ml+NaCl 7.65g 0.1MPBS 配方为：Na2HPO4 23g+NaH2PO4﹒2H2O 5.9g+NaCl 17g 定容至2000ml, 高压， pH7.2-7.4 （2）洗涤液：0.3%TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装15ml/支－20℃保存 （3）封闭液：10％NGS－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1.2ml/支－20℃保存 （4）抗体稀释液：1％BSA－0.3% TrixtonX100－pH7.4 0.01MPBS，分装1ml/支－20℃保存
远程术中冰冻切片检查与诊断简介1
远程术中冰冻切片检查与诊断 一.简介及意义 冰冻切片检查与诊断（简称“术中冰冻”）是将手术中切除的病理组织在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断的一种诊断方法；是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的会诊方式，如果诊断为恶性肿瘤，就可以直接根据结果选择手术方式及范围，从而有效地避免了二次手术及损伤。 二．方法及原理 将手术中切除的病理组织无需固定、直接送检，在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断，冰冻切片取材后剩余、未曾冷冻的组织（冻剩）均会制备石蜡切片并进行常规病理诊断。 三．应用范围 适用范围 1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤、良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案时。 2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 3.确定肿瘤部位的手术边缘有无肿瘤组织残留。 4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 不适用范围 1．疑为恶性淋巴瘤者。 2．过小的标本(标本长径≤0.2cm者)和含水分较多的脑组织。 3．术前易于进行常规活检者（例如：肠镜、胃镜、支气管镜、穿刺组织标本等）。 4．脂肪组织、骨组织和钙化组织。 5．需要依据核分裂计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 6．主要根据肿瘤生物学行为特征（如浸润、转移）而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 7．已知具有传染性的标本(例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等)。 8．钳夹、烧灼后的标本不能进行冰冻切片。
四、送检流程 1、预约： 1）项目开展时间为全周，工作时间是上午8:30－下午17:00。遇法定假期以具体通知为主。具体安排为：周一、三、五在本院病理科完成，周二、四、六、日送到金域检验中心病理科完成。推荐冰冻尽量安排在周一、三、五来完成。 2）预约方式：需要进行术中冰冻的临床科室需至少提前一天17:00前预约第二天手术。致电给病理科，登记患者姓名和手术时间等信息。 ① ②、电话预约客服中心(4001-111-120)工作时间为周一至周六8:00-21:00、周日8:00-17:30。 2、手术： 送检保存：手术标本送检冰冻时，无需加固定液，不要沾水，过小标本可用拧后的生理盐水湿棉布包裹防止坏死。 3、配送:由专门医护人员直接将手术标本从手术室送至本院病理科，并做好相关登记。 4、标本处理：标本处理依次经过标本接收、取材、冰冻切片、染色及封片等步骤制作成玻片，处理时间在20分钟内。 5、诊断： ①、病理医生上班时：直接阅片作病理诊断，做出诊断报告不超过10分钟。 ②、病理医生休息时：通过数字化远程病理系统将制片扫描上传，由金域检验中心病理室的病理医生（提前预约好）阅片作病理诊断。金域病理中心在收到远程图片后做出诊断报告不超过10分钟。 6、报告：病理医生做出诊断后，即时发送电话报告或传真报告，随后会再发出一份常规石蜡报告，确保结果准确性。
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
1091例手术中冰冻切片病理诊断准确性分析
内容摘要：作者：张剑虹成日青林媛媛赵秀芳张凡刘军超张九鸿 作者：张剑虹成日青林媛媛赵秀芳张凡刘军超张九鸿 【关键词】冰冻切片; 病理诊断; 准确性 随着临床医学手术水平的不断提高，手术中要求送检冰冻病理切片快速诊断的病例日益增多，临床手术医师对病理报告的依赖性也逐渐增加，快速病理冰冻诊断已成为指导临床手术医师确诊和制订合理手术方案的必需手段之一。然而手术中冰冻切片病理诊断受到很多因素的制约，准确性很难达到与常规石蜡切片相一致的效果。为此我们收集我院病理科近两年的冰冻切片资料1091例，分析探讨冰冻切片诊断价值和准确性及其影响因素，旨在不断提高手术中病理诊断质量，从而降低医疗事故隐患。 1 材料与方法 选取我院2003.1～2005.12月的冰冻切片资料1091例，为防止制成的冰冻切片镜下组织形态发生改变，送检标本要求用干纱布包裹或置于不加任何液体的洁净容器内及时送达病理科，病理医师详细检查大体标本后取肉眼确认病变最明显区域1～2块组织，迅速置全自动恒冷切片机（英国产shandn as 620e型）上制作切片。每个组织块切取两张切片，厚4μm，经酒精固定，he染色，普通光镜（olympus bx51）下观察，并经2～3名医师阅片后集体讨论确诊；如送检组织不合格（凝血块、坏死渗出物等），立即请手术医师第二次取材送检，冰冻残余组织做常规石蜡切片，并与另外多处取材石蜡切片对照分析。 2 结果 1091例冰冻组织分布在12个系统及组织，如女性生殖系统485例，占总例数44.4%，乳腺病变364例，占33.3%，甲状腺58例，占5.3%，消化系统52例，占4.7%等。送检最活跃的科室为妇科、产科，其次为普外科等，见表1。表1 1091例冰冻标本在各系统分布情况石蜡证实良性病变775例，其中771例冰冻符合，冰冻准确率96.9%；石蜡证实恶性病变286例，冰冻报告恶性281例，冰冻准确率97.6%；石蜡证实交界性病变29例，冰冻报告交界性24例，冰冻准确率82.8%。1091例冰冻标本中，与石蜡切片报告相符的为1056例，冰冻切片总的诊断准确率为96.8%，误诊14例，误诊率为0.13%，见表2。表2 1091例冰冻与石蜡切片诊断结果比较 3 讨论 3.1 冰冻切片病理诊断病变的价值冰冻在外科手术中应用广泛，术中冰冻可使外科医生在手术中知晓病变性质（良性、交界性、恶性），从而决定适当的手术方案。自1960年cryostat 冷冻切片机在临床病理应用以来，随着病理技术人员素质的提高和切片设备的更新换代，冷冻切片质量与石蜡切片已相差无几，使病理医师对手术中冰冻切片诊断准确率不断提高。我院近年内投资进口大型衡冷柜式切片机，为冰冻切片的准确性提供了必要的保障。所以目前冰冻切片为临床快速确定诊断和决定手术范围的一个重要依据，主要应用价值体现在：1.决定病变的性质，要求病理医师在最短的时间内确定送检组织是肿瘤或是非肿瘤性病变，如为肿瘤则需再确定良性或恶性，因病变不典型而不能确定良性、恶性病变时，则提一个考虑性或倾向性意见供临床考虑，或待石蜡切片再定。2.确定切除肿瘤的边缘是否残留肿瘤组织。我们遇到最多的是乳腺癌手术实施保乳治疗时的上、下、左、右及基底五个切缘，如切缘发现癌组织，则需扩大切除范围，此时冰冻切片结果对临床手术范围起到了决定性作用。3.辨认组织，如先天性巨结肠须证实手术切缘的肠壁内是否有肌间神经节细胞存在，如未见神经节细胞则须再切肠管,直至查见肌间神经节细胞为止。 4.确定淋巴结有无癌转移，手术医师取
术中快速冰冻诊断
术中快速冰冻诊断 1、什么叫“冰冻切片”？ 冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断，手术医生根据病理诊断结果决定手术范围。 2、什么叫“术中快速冰冻切片病理诊断（快速活检）”？ 手术中快速活体组织病理学检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的急会诊，它是一种高技术、高难度、高风险的项目，是临床病理实践中最重要、最难的一项工作。快速活检要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片（或快速石蜡切片）的观察，向手术医师提供的参考性病理诊断意见。与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。因此，应向临床医师说明快速活检的：①局限性、②适用范围、③慎用范围和④不宜应用范围。 3、“快速活检”的适用范围： ①需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 ②了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 ③确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 ④确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 4、“快速活检”的慎用范围： 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 5、“快速活检”的不宜应用范围： ①疑为恶性淋巴瘤。 ②过小的标本（检材长径≤0.2cm者）。 ③术前易于进行常规活检者。 ④脂肪组织、骨组织和钙化组织。 ⑤需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 ⑥主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 ⑦已知具有传染性的标本（例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等）。
免疫组化操作方法原理步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结 1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。 2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。 3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。 4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。 5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。 6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。 7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。 一、概念和常用方法介绍 1、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。 2、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。 3、分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较
冰冻切片检查注意事项
手术中冰冻切片检查规范 一、手术中冰冻切片检查注意事项 (一) 手术中冰冻切片检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题，尤其需要临床医师与病理医师间的密切合作。 (二) 手术中冰冻切片检查要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片的观察，向手术医师提供参考性病理诊断意见，由于组织未得到充分有效的固定、脱水以及切片较厚等等，与石蜡切片病理诊断的准确率有一定的差距，一般仅限于良、恶性的鉴别。与常规石蜡切片的病理诊断相比，手术中冰冻切片检查具有更多的局限性和误诊的可能性，误诊率5%以上。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。 (三) 有关临床医师应于手术前向患者和／或患者授权人说明手术中冰冻切片检查的意义和局限性等，取得患者和／或患方的知情和理解。患者和／或患者授权人应在由医院制定的《手术中冰冻切片检查知情同意书》签署意见和签名。 (四) 主持手术的临床医师应在手术前一天向病理科递交手术中冰冻切片检查申请单，填写患者的病史，重要的影象学、实验室检查结果和提请病理医师特别关注的问题等。一般不接受电话预约和临时申请手术中冰冻切片检查。 （五）手术中冰冻切片检查的手术标本在切除后应立即送到病理科，并注明手术的部位，重点部位应做标记或加以说明。同时手术
标本应保持新鲜，不要加用固定液或用含水溶液清洗，以免影响制片和诊断。 （六）手术中冰冻切片检查诊断报告一般在手术标本送达病理科后30分钟内做出。并以书面文字形式通知临床手术科室。特殊情况（如标本过大，取材过多，或多个冰冻标本同时送检等），报告时间可以超过30分钟。 （七）工作开展时间：手术中冰冻切片检查的开展时间为周一至周五，周六和周日如有需要可提前预约。 （八）手术医师应在手术后及时填写常规石蜡病理检查申请单到病理科，以便病理科及时发出常规病理报告。 二、手术中冰冻切片检查适用范围 (一) 需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 (二) 了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 (三)确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 三、手术中冰冻切片检查慎用范围 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 四、手术中冰冻切片检查不宜应用范围 五、(一)疑为恶性淋巴瘤。 六、(二)过小的标本。
术中快速冰冻诊断
术中快速冰冻诊断 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
术中快速冰冻诊断 1、什么叫“冰冻切片” 冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断，手术医生根据病理诊断结果决定手术范围。 2、什么叫“术中快速冰冻切片病理诊断（快速活检）” 手术中快速活体组织病理学检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的急会诊，它是一种高技术、高难度、高风险的项目，是临床病理实践中最重要、最难的一项工作。快速活检要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片（或快速石蜡切片）的观察，向手术医师提供的参考性病理诊断意见。与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。因此，应向临床医师说明快速活检的：①局限性、②适用范围、③慎用范围和④不宜应用范围。 3、“快速活检”的适用范围： ①需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 ②了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 ③确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 ④确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 4、“快速活检”的慎用范围： 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 5、“快速活检”的不宜应用范围： ①疑为恶性淋巴瘤。 ②过小的标本（检材长径≤者）。 ③术前易于进行常规活检者。 ④脂肪组织、骨组织和钙化组织。 ⑤需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 ⑥主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。
免疫组化超详细步骤
免疫组化 一实验目的：分别用KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体检测肺癌组织中KRAS、NRAS、HRAS蛋白的表达情况 二实验原理: 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术. 三实验试剂及耗材:经病理医生确认的肺癌组织切片、KRAS、NRAS、HRAS蛋白抗体、DAB 显色试剂盒、抗原修复液、PBS、苏木素染料、1%盐酸酒精溶液、0.05%氨水、二甲苯、等 四实验设备：切片机、4℃冰箱、显微镜、烤片机 五主要试剂配置: 缓冲液 应用液A NaH2PO4 38.4g配成1000毫升溶液 应用液B Na2HPO4·12H2O 114.8g配成1000毫升溶液 配制1000毫升PBS需要14毫升应用A液，36毫升应用B液，加8.5gNaCl。 枸橼酸钠抗原修复液 应用液A 枸橼酸 10.55g配成1000毫升溶液 应用液B 柠檬酸三钠（三水合柠檬酸三钠） 29.01g 配成1000毫升溶液 配制500毫升抗原修复液需要9毫升应用A液，41毫升应用B液。 苏木素染液配方：苏木素2g,无水乙醇250毫升，硫酸铝17.6g蒸馏水750毫升，碘酸钠0.2g，冰醋酸20毫升。先将苏木素溶于无水乙醇，再将硫酸铝溶于蒸馏水水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠，最后加入冰醋酸。 抗体说明书建议的抗体稀释度 N-Ras 1:50-1:500 H-Ras 1:50-1:500 K-Ras 1:20-1:200 六实验步骤： 1组织常规石蜡切片厚度3-5um，防脱片捞片后晾干，放入72℃烤箱烤片2小时。 2 切片脱蜡水化程序