(整理)发酵重点1-8.

1、发酵工程的基本定义？

发酵工程：是利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程技术体系，是生物工程与生物技术学科的重要组成部分。发酵工程也称作微生物工程，该技术体系主要包括菌株选育与保藏、菌种的扩大生产、微生物代谢产物的发酵生产和分离纯化制备，同时也包括微生物生理功能的工业化利用。

2、提出研发一个发酵新产品的可能路线

发酵生产工艺流程

除某些转化过程外，典型的发酵工艺过程大致可以划分为以下6个基本过程

①用作种子扩大培养及发酵生产的各种培养基的配制；

②培养基、发酵罐及其附属设备的灭菌；

③扩大培养有活性的适量纯种，以一定比例将菌种接入发酵罐中；

④控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；

⑤将产物提取并精制，以得到合格的产品；

回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。

3、发酵工业的特点

①常温常压下进行的生物化学反应，条件较温和

②较廉价的原料生产较高价值的产品

③通过生物体的自适应调节来完成，反应专一性强，可以得到较为单一的代谢产物

④可以产生比较复杂的高分子化合物

⑤不受地理、气候、季节等自然条件的限制，可以根据订单安排通用发酵设备来生产多种多样的发酵产品

1、为什么需要进行微生物菌种改良？

①提高目标产物的产量

生产效率和效益！

②提高目标产物的纯度，减少副产物

可有效降低产物分离成本。

③改良菌种性状，改善发酵过程

改变和扩大菌种所利用的原料范围、提高菌种生长速率、保持菌株生产性状稳定、提高斜面孢子产量、改善对氧的摄取条件并降低需氧量及能耗、增强耐不良环境的能力（如耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的过量代谢产物）、改善细胞透性以提高产物的分泌能力等。

④改变生物合成途径，以获得高产的新产品

2、你认为菌种筛选过程中最关键的环节是什么？

筛选方法

（1）平皿快速检测法

肉眼可观察的变化。显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法…

（2）形态变异的利用

（3）高通量筛选(high throughput screening)

3、如果尽量保持菌种不发生退化？

（1）控制传代次数

基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生变化的机会也就越多。因此应该尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以降低突变机率。一般情况下，斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。为此，生产菌种每移植一代，最好同时移植较多的斜面，以供一段时间生产之需，这样移植次数就可减少。

（2）选择合适的培养条件

培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌种衰退。另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。

（3）利用不同类型的细胞进行传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此用菌丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，可以达到防止衰退的目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对构巢曲霉来说，利用它的分生孢子传代易发生衰退而用它的子囊孢子移种则不易退化。

（4）选择合适的保藏方法

采用有效的菌种保藏方法也可以防止菌种的衰退。由于菌种衰退的情况不同，对有些衰退原因还不甚了解，因此要切实解决具体问题，需根据实际情况，通过实验正确地加以运用。

第三章

1、为什么需要进行微生物培养基的优化？

①必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

②有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率。

③有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

④有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。

⑤尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质的产生。

⑥原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

⑦所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。

2、除了微生物培养基的各种组成成分，你认为培养基的优化过程中还需要考虑哪些关键的

因素？

（1）菌体的同化能力

（2）培养基对菌体代谢的阻遏和诱导

葡萄糖效应，无机氮源对蛋白酶产生的阻遏

（3）碳氮比对菌体代谢调节的重要性

氮源多，菌体生长旺盛，pH偏高，不利于代谢产物积累；碳源多，易形成较低pH；碳源不足，菌体易衰老和自溶。不同生长阶段对碳氮比的最适要求不一样。一般工业发酵培养基的碳氮比为100：（0.2~2），需根据产物含氮量调整

（4）pH对不同菌体代谢的影响

可用酸碱调节发酵液pH，合理配制培养基可使整个发酵过程中pH处于较为适宜的状态。可流加底物进行pH调节。

3、如果让你优化某一微生物菌种的培养基，你会怎么去做？

①根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题，初步确定可能的培养基成分；

②通过单因子优化实验确定最为适宜的各个培养基组分及其最适浓度；

③最后通过多因子实验，进一步优化培养基的各种成分及其最适浓度。

正交实验设计

响应面分析方法

遗传算法设计

第四章

1、工业发酵中造成染菌的主要因素有哪些？

种子带菌、空气带菌、设备渗漏、灭菌不彻底、操作失误、技术管理不善…

2、如果发酵中染菌了，你会怎么做？

1）种子培养或种子罐中发现污染。

发酵早期染菌可以适当添加营养物质，重新灭菌后再接种发酵。

2）中后期染菌，如果杂菌的生长将影响发酵的正常进行或影响产物的提取时，应该提早放罐。

3）有些发酵染菌后发酵液中的碳、氮源还较多，如果提早放罐，这些物质会影响后处理提取使产品取不出，此时应先设法使碳、氮源消耗，再放罐提取。

第五章

1.简述种子扩大培养的目的与要求及一般步骤。

答：目的：①接种量的需求。②，菌种活化和驯化。③，缩短发酵时间，保证生产水平。

总结就一句话：为发酵提供高质、高量种子。

要求：①菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短。

②菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特性等符合要求。 ③菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。

④无杂菌污染，保证纯种发酵。

⑤菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。

步骤：菌种→斜面培养→固体斜面培养基或摇瓶液体培养基→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐

2. 影响种子的质量的因素有哪些？可采取什么措施保证种子的质量？

答：（1）原材料质量、培养温度、湿度、通气与搅拌、斜面冷藏时间、培养基、pH ① pH 是否在种子的要求范围内

② 糖、氨基氮、磷酸盐的含量

③ 菌丝形态、浓度和培养液的外观（色泽、气味、混浊度、颗粒等）

④ 有无染菌

⑤ 其他，如某些酶的活力、溶氧和尾气等

（2）菌种稳定性检查：定期考察、挑选，出现退化要及时复壮；

适宜的生长环境：营养丰富的培养基、适宜的培养温度、湿度和通气量；

种子无杂菌检查：每一步移种均需进行无菌检查

第六章

1、微生物生长可以分成几个阶段？次级代谢产物通常在什么阶段开始合成？

1）延迟期、对数生长期、衰减期、稳定期、衰亡期

2）稳定期

2、 根据无抑制细胞生长动力学（Monod 方程），试述μ与Cs （基质浓度）之间的关系。 t s t

S K S +=max μμ

3、什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？

连续培养：指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。（张道敬版）

稀释率：单位时间内连续流入发酵罐中的新鲜培养基体积与发酵罐内的培养液总体积的比值

第七章

1、微生物生长中呼吸强度和摄氧率变化的一般规律是什么？

呼吸强度：单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量。Q O2:mmolO 2/(kg 干菌体·h) 耗氧速率：单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，也称摄氧率。γ:mmolO 2/(m 3·h) γ= Q O2 X

X ：菌体浓度， kg 干菌体/m 3

微生物在发酵过程中的耗氧速率取决于微生物的呼吸强度和单位体积发酵液的菌体浓度，而呼吸强度又受到菌龄、菌种性能、培养基及培养条件等诸多因素的综合影响。

分批培养过程中细胞耗氧(摄氧率)的一般规律：

在培养初期，呼吸强度Q O2逐渐增高，此时菌体浓度很低；

在对数生长初期呼吸强度达到最大值，此时菌体浓度还较低，摄氧率并不高；

随着细胞浓度的迅速增高，培养液的摄氧率也迅速增高，在对数生长期的后期达到最大值； 在对数生长期末，由于培养基中营养物质的消耗以及培养装置氧传递能力的限制，呼吸强度下降，虽然这时细胞浓度仍有增加甚至达到最大值，但细胞活力已经下降，导致培养液的摄氧率下降；

培养后期，因基质耗尽，细胞自溶，呼吸强度进一步下降，摄氧率也随之迅速下降。

2、影响氧传递的因素有哪些？氧在传递过程中的传质阻力有哪些？

1）影响推动力方面的因素：温度、溶质、溶剂、氧分压

2）影响K L a 的因素：设备参数、操作条件、发酵液特性

供氧：空气中的氧从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。

耗氧：氧自液体主流通过液膜、菌体丛、细胞膜扩散到细胞内。整个过程必须克服一系列的阻力，才能被微生物利用。

供氧方面的阻力：

①气膜阻力，主流气流与气膜间的气膜阻力

②气液界面阻力，与空气情况相关

③液膜阻力，气液界面至液体主流间的液膜阻力

④液流阻力

耗氧方面的阻力：

①细胞周围液膜阻力，与发酵液成分和浓度相关

②菌丝丛或团内的扩散阻力

③细胞膜阻力，与微生物的生理特性相关

④细胞内反应阻力。

)

(*L L C C a K OTR -=

3、什么是临界氧浓度？

临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。

4、为什么氧容易成为好氧发酵的限制性因素？

1）氧的溶解度小；2）……………………

另：：：

1、氧在微生物发酵中的作用

1）许多微生物细胞必须利用分子态的氧作为呼吸链电子传递系统末端的电子受体，最后与氢离子结合生产水，同时在呼吸链的电子传递过程中可以释放出大量的能量，供细胞生长和代谢使用。

2）氧还可以作为中间体直接参与一些生物合成反应。

2、影响微生物耗氧的因素：

1）微生物本身遗传特征一般为25~100mmolO2/(L·h)

2）菌龄幼龄菌生长旺盛，呼吸强度大

3) 发酵条件pH、温度影响细胞内酶活性，代谢产物影响细胞的呼吸

4) 代谢类型产物通过三羧酸循环（TCA）获取的，呼吸强度高，耗氧量大，通过糖酵解途径（EMP）获得的，呼吸强度低。

3、控制溶解氧的意义

溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响可能是不同的，发酵不同阶段对氧浓度的要求不同。

空气中的氧在发酵液中的溶解度很低，所以发酵工业中给发酵罐通气时空气中氧的利用率很低。例如，在抗生素发酵过程中被微生物利用的氧不超过空气中的2%；在谷氨酸发酵过程中，氧的利用率为10~30%。因此，大量经过净化处理的无菌空气在给发酵液通气过程中因溶解少被浪费掉。

因此，必须设法提高传氧效率，降低设备费和动力消耗，减少泡沫形成和染菌机会，同时大大提高设备利用率。

第八章

1.发酵过程中的参数检测有何意义？生产中主要检测的参数有哪些？

答：（意义没有写，自己写）

一般发酵过程的优化控制实施的具体步骤可以通过以下四步来完成。

①确定能反映过程变化的各种理化参数及其检测方法

②研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响及其机制，获取最佳范围和最适水平

③建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的量化关系，为发酵过程优化控制

提供依据

④通过计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，

实现发酵过程的最优控制

常规的发酵工艺控制参数有温度、pH、搅拌转速、空气流量、罐压、液位、补料速度及补料量等。能表征发酵过程性质的直接状态参数有pH、溶解氧（DO）、溶解CO2、氧化还原电位（r H），尾气中的O2和CO2含量、基质（如葡萄糖）或产物浓度、代谢中间体浓度、菌体浓度。通过直接状态参数可以求得发酵体系中各种间接状态参数，如比生长速率、摄氧率、CO2释放速率、呼吸商、氧得率系数、氧体积传质系数、基质消耗速率、产物合成速率等。

2.发酵过程的温度为什么会变化？什么是发酵热？

答：引起温度变化的原因是由于发酵过程中所产生的净热量，称为发酵热

Q发酵=Q生物+Q搅拌+Q通气-Q蒸发-Q辐射

生物热是指微生物在生长繁殖过程中，本身产生的大量热量

3.在微生物培养过程中，引起pH改变的原因有哪些？pH对发酵的影响表现在哪些方

面？

答：（1）

①，微生物消耗底物导致培养基pH改变。②，微生物

的代谢产物改变pH。（如生成乳酸）③，生成的CO2

未能及时释放，导致pH下降。）

（2）发酵液pH的改变①会导致微生物细胞原生质体膜的电荷发生改变，对个别离子渗透性的改变，从而影响微生物对培养基中营养物质的吸收及代谢产物的分泌；

②可能影响菌体代谢方向，影响菌体中各种酶活及菌体对基质的利用速率（例如蛋

白酶的活性随pH变化较大，分解产物or利用底物中蛋白质）；③对代谢产物合成的影响。

4.

5.机械搅拌发酵罐中，搅拌器的搅拌作用是什么？

答：搅拌的作用是把气泡打碎，强化流体的湍流程度，使空气与发酵液充分混合，使气、液、固三相更好地接触从而改善供氧性能。

6.

7.发酵中泡沫形成的原因是什么？泡沫对发酵有哪些影响？

答：通气、搅拌、CO2及发酵液中糖、蛋白质和代谢物等稳定泡沫的物质，使发酵液含有一定数量的泡沫。发酵液的理化性质对泡沫的形成起决定作用。温度、pH、基质浓度以及泡沫的表面积对泡沫的稳定性也有很大影响。

负面影响：①发酵罐装料系数降低②增加了菌群的非均一性③增加染菌机会④如“逃液”，导致产物流失⑤消泡剂的加入有时会影响发酵产量或给下游分离纯化精制带来麻烦