水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测

水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（1）

录入时间:2010-9-25 11:17:29 来源：生物信息网

（一)实验目的

(1)了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。

(2)学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。

(3)学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。

（二)实验原理

水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。

水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。

所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。

(三)实验器材

(1) 菌落总数的测定：

1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水。

2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

(2)大肠菌群的测定；

1)培养基：

①乳糖胆盐蛋白胨培养基：

蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。

②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP042g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管等。

四）实验方法

(1)水样的采集：

1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。

(2)细菌总数的测定：

1)水样稀释及培养：

①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：

⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2)计算方法：

作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3)计数的报告：

①平板菌落数的选择：

选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择：

a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。

b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。

c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。

e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。

f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。

③细菌总数的报告：

细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。

(3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：

表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式

水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（2）

录入时间:2010-9-25 11:22:11 来源：生物信息网

1)生活饮用水或食品生产用水的检验：

①初步发酵试验：

在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。

②平板分离：

经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。

③复发酵试验：

将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。

④报告：

根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

2)水源水的检验：

用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。

②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。

③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。

表2 大肠菌群检索表（饮用水）

表3 大肠菌群数变异不大的饮用水

表4 大肠菌群检索表（严重污染水）

表5大肠菌群检索表（中度污染水）

表6大肠菌群检索表（轻度污染水）

表7 大肠菌群变异不大的水源水

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表4、表5、表6或表7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

附：滤膜法

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。

(1)准备工作：

1)滤膜灭菌：

将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。

2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。

3）培养：

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。

(2)过滤水样：

1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。

2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

(3)结果判定：

1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

①紫红色，具有金属光泽的菌落。

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

③淡红色，中心颜色较深的菌落。

2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。

3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。

食品中细菌总数的测定

录入时间:2010-9-25 11:26:31 来源：生物信息网

一、目的与要求：

1 学习并掌握细菌的分离和活菌计数的基本方法和原理

2 了解菌落总数测定在对被样品进行卫生学评价中的意义

二、原理：

菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称

为杂菌数，需氧菌数等。

三、材料

1 食品检样

2 培养基

营养琼脂培养基，无菌生理盐水

3 其它

无菌培养皿，无菌移液管，无菌不锈钢勺。

四、流程、步骤

1 取样、稀释和培养

A 以无菌操作取检样25g（或ml），放于225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振要或研磨制成1:10的均匀稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000～10000r/min的速度处理1min，制成1:10的均匀稀释液。

B 用1ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1:100的稀释液。

C 另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支10ml 吸管。

D 根据标准要求或对污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在制作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。

E 稀释液移入平皿后，将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。

F 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。

2 菌落计数方法

作平皿菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落总数后，求出同稀释度的各平皿平均菌落数。到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于0－4℃，但不要超过24h。

3 菌落计数报告方法

A 平皿菌落数的选择

选取菌落数在30～300之间的平皿作为菌落总数测定标准。每一个稀释度应采用两个平皿平均数，其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表全皿菌落数。

B 稀释度的选择

a 应选取平均菌落数在30～300之间的稀释度报告。

b 若有二个稀释度均在30～300之间时，应以二者比值决定，比值≤2取平均数，比值>2则其较小数字。

c 若所有稀释度均>300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

d 若所有稀释度均<30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。

e 若所有稀释度均无菌落生长，则应按<1乘以最低稀释倍数报告之。

f 若所有稀释度均不在30～300之间，有的>300，有的又<30，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

C 菌落计数报告方法

菌落数在1～100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算，为了缩短数字后面的零数，也可以10的指数表示。

五、结果

1 将实验测出的样品数据以报表方式报告结果。

2 对样品菌落总数作出是否符合卫生要求的结论。

希瓦菌生物学特性的实验研究

录入时间:2010-9-25 11:30:31 来源：中国人兽共患病学报

基因分型技术的快速发展，为更准确地进行微生物学分类、临床快速鉴定细菌感染、了解病原菌的致病机制以及它们与宿主的关系提供了可能。本文所阐述的希瓦菌属( Shewanella spp．) 的分类，就是随着全基因测序研究而不断趋于完善的。该菌的命名曾经历了原本归属于无色棒菌属( Achromobacter spp．)、假单胞菌属( Pseudomonas spp．)、异单胞菌属( Alteromonas spp．)也称交替单胞菌属( Rubescens spp．)、腐败假单胞菌( Pseudomonas putrefaciens )几个阶段，最终命名为希瓦菌属( Shewanella spp.)。1998年Shideh根据5S rRNA序列的同源性研究，对希瓦菌属进一步做了种、型的分类。本文主要参照Shideh等报道的分类原则和方法，对分离来自腹泻病人粪便和外环境的13株希瓦菌，进行了生物学特性的实验研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验菌株5株分离自腹泻病人的粪便，1株分离自病家附近的池塘水，1株分离自病人家苍蝇，6株分离自病家饲养的禽、畜粪便( 其中猪粪2株、羊粪3株、鸡粪1株)，共计13株。

1.2 分离培养基腹泻病人的菌株直接由麦康凯平板分离。池塘水经EC肉汤增菌后，由麦康凯平板分离。苍蝇和禽、畜粪便经含新生霉素的mEC肉汤36℃震荡培养6h，分离于CT—SMAC(头孢克肟、亚碲酸钾山梨醇麦康凯)平板。

1.3 希瓦菌属的鉴定用bioMerieux公司的A TB半自动细菌鉴定仪-ID32 GN和Api 20E及Api 20NE试条根据说明书进行鉴定。

1. 4 腐败希瓦菌( Shewanella putrefaciens，SP)和海藻希瓦菌( Shewanella algae，SA) 的鉴别用Hugh—Leifson O／F 试验培养基，以观察其对糖、醇氧化分解的能力及在6.5％的盐胨水中和SS琼脂的生长情况和绵羊血琼脂上是否有溶血现象进行属内区分。培养基购自市售的干燥培养基。

2 结果

2.1 菌体形态 13株希瓦菌，均为革兰阴性，无芽孢，直杆状或微弯曲的杆菌，大部分单个或偶有

短链状排列。

2.2 生物学特性该菌为需氧菌，糖代谢类型为氧化型。对营养要求不高，在肉汤培养基中，经36℃培养3～6h呈均匀混浊，18 ~24h液面形成菌膜，继续延长时间后，则管底形成膜状物沉淀。在pH8.4 的碱性胨水中生长良好。在半固体琼脂中显示有动力，表层菌苔呈淡粉红色，但色素不扩散，也不溶于乙醇及氯仿等有机溶剂。在KIA琼脂中产生大量的硫化氢。在麦康凯琼脂上，形成无色半透明光滑、淡橙色菌落。在CT—SMAC琼脂上形成无色半透明中心略带淡灰色的菌落。在S S琼脂上部分菌株被抑制，在绵羊血琼脂平板上大部分菌落不溶血。

2.3 生化鉴定结果根据美国CDC的生物学分类原则，并通过用传统的鉴定方法对13株不同来源的希瓦菌的生物学实验研究，结果其中9株为腐败希瓦菌，4株为海藻希瓦菌，详见表1 。

使用微生物鉴定系统：A TB -Expression的ID 32GN试条及API 20 NE和20 E同步进行鉴定，其鉴定结果均为腐败希瓦菌，符合率分别为94.7～99.9% ，不能区分希瓦菌的不同种别。

2.4 生物分型在9株腐败希瓦菌中，生物1型6株，其特性为能氧化分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其中还有3株能分解阿拉伯糖，2株分解木糖。在SS琼脂和6.5% 氯化钠胨水中均不生长，在血琼脂平板上不溶血。生物2型3株，突出特征是除能缓慢氧化分解葡萄糖和产生尿素酶外，对其他几种试验的糖类和醇类均不能氧化分解，但是它们都能在SS 琼脂上生长、在6.5%氯化钠胨水中不生长，并有部分菌株能利用枸橼酸盐和丙二酸盐，在血平板上不溶血。4株海藻希瓦菌的鉴定结果显示，除能微弱氧化葡萄糖、果糖和核糖外，对其它几种糖、醇均不能氧化，而在SS琼脂和6.5% 氯化钠胨水中均能生长，并能在血琼脂平板上缓慢出现溶血现象。

表1 13株希瓦菌的生化试验结果

2.5 宿主分布 5株病人菌株中，有3株属于海藻希瓦菌，2株属于腐败希瓦菌的生物2型。8株外环境非人类菌株。有5株属于腐败希瓦菌的生物1型，2株为腐败希瓦菌的生物2型，另1株自苍蝇分离的菌株被鉴定为海藻希瓦菌。

3 讨论

3.1 希瓦菌的分类从1941年由Derby和Hammer首先分离并命名为假单胞菌以来，迄今已有近70年的历史，在70年代曾隶属于假单胞菌属，异单胞菌属也称交替单胞菌，直至1985年，Mac—Donell等将其划定为非发酵菌群中一个独立的属希瓦菌属，DNA的G+C含量为44～54 mol% 。近些年，由于科学家对新希瓦菌种的不断发现，至今希瓦菌属已有21个种。据Shideh等报道，美国疾病预防控制中心( CDC)将希瓦菌属中与人类疾病有关的希瓦菌分为腐败希瓦菌和海藻希瓦菌两个种，而把腐败希瓦菌又分为三个生物型。通过手工生化试验可以完成鉴定。目前广泛用于临床的微生物自动鉴定系统，但大都不能准确用于希瓦菌属中腐败希瓦菌和海藻希瓦菌及亚种间的区分。还有赖于常规的传统方法进行种间的鉴定及分型。

希瓦菌属于非发酵菌群，一般为条件致病菌，但由于抗生素的广泛应用，使病原菌发生了很大变化，由条件致病菌引起的感染日益增多，同时因为宿主的因素，往往也会造成机会感染。近年来见诸于由本菌引起的多起临床感染及病人血液、

脓液、尿液、痰液和创伤分泌物等临床标本中检出该菌的报道，因此希瓦菌引起的感染性疾病应引起临床和微生物学界的高度关注。据Shideh等报道，临床上的分离株有77属于美国CDC分型中的腐败希瓦菌生物2型，同时海藻希瓦菌引起人类的感染也占相当的比重。至于海藻希瓦菌引起人类感染的原因目前还不清楚。通过对希瓦菌的生物学特性及其生物型分型的实验研究，以及本菌引起的感染以及探讨外环境与宿主之间的关系，传染源的追溯都有重要的流行病学意义。