精子染色质扩散实验及吖啶橙染色检测精子DNA完整性研究

Medical Diagnosis 医学诊断, 2017, 7(3), 43-49

Published Online September 2017 in Hans. https://www.360docs.net/doc/c314756439.html,/journal/md

https://https://www.360docs.net/doc/c314756439.html,/10.12677/md.2017.73008

Sperm Chromatin Diffusion

Test and Detection of Sperm

DNA Integrity by Acridine

Orange Staining

Zhenya Fang, Meihua Zhang, Anna Li, Yi Qiu*

Key Laboratory of Birth Regulation and Control Technology of National Health and Family Planning Commission of China, The Maternal and Child Health Hospital of Shandong Province, Jinan Shandong

Received: Aug. 6th, 2017; accepted: Aug. 20th, 2017; published: Aug. 28th, 2017

Abstract

Objective: To analyze and compare the accuracy and utility of determining sperm DNA integrity by sperm chromatin dispersion (SCD) test and acridine orange staining test (AOT). Methods: The lev-el of DNA fragmentation was determined by SCD test and AOT in 32 adult healthy fertile men (control group) and 27 idiopathic oligozoospermia (IO) patients. Sperm nuclei with large DNA dispersion halos or with medium-sized halos were normal and nuclei with small-sized halos or no halo were abnormal. Sperm DNA strand breaks were tested by AOT of green for native DNA and red for denatured DNA. Results: The mean percentage of sperm nuclei with large halos, me-dium-sized halos, small-sized halos and no halo in patients with IO was (51.8 ± 17.1)%, (9.4 ±

8.6)%, (11.9 ± 5.8)% and (26.7 ± 10.6)%, but in control group it was (73.2 ± 6.2)%, (14.8 ± 5.7)%,

(6.8 ± 2.9)% and (5.3 ± 2.2)%, respectively, there was a significantly difference in the IO and con-

trol group (t = 4.256, P < 0.01; t = 5.1849, P < 0.05; t = 3.6967, P < 0.01; t = 5.7971, P < 0.01). IO pa-tients showed significantly higher DNA fragmentation (38.1% ± 9.5%) in their spermatozoa com-pared to healthy males (12.1% ± 5.2%, P < 0.01) determined by SCD test. No significant differences in the AOT outcome were seen between healthy males and IO patients (P > 0.05). Conclusion: The SCD is an effective test in sperm DNA fragmentation as a screening procedure to determine semen quality during basic infertility investigation for clinical use. The presence of sperm DNA fragmen-tation may lead to male infertility.

Keywords

Sperm Chromatin Dispersion (SCD) Test, Acridine Orange Staining Test, Sperm DNA Integrity,

Idiopathic Oligozoospermia, Male Infertility

*通讯作者。

房振亚等

精子染色质扩散实验及吖啶橙染色检测精子DNA 完整性研究

房振亚，张美华，李安娜，邱毅*

国家卫生计生委生育调控技术重点实验室，山东省妇幼保健院，山东济南

收稿日期：2017年8月6日；录用日期：2017年8月20日；发布日期：2017年8月28日

摘要

目的：采用精子染色质扩散(sperm chromatin dispersion, SCD)实验检测精子DNA 碎片，分析比较SCD 实验及吖啶橙染色实验(AOT)检测精子DNA 完整性的应用价值。方法：对32例正常成年已生育的男性和27例特发性少精子症(idiopathic oligozoospermia, IO)患者同时进行SCD 实验和AOT ，对检测结果进行分析。在SCD 实验中，DNA 完整性正常无损伤精子的DNA 扩散产生大晕环或中晕环，而DNA 损伤产生DNA 碎片的精子不产生或产生很小的晕环。AOT 染色实验中，正常精子DNA 为双链，染成绿色，不成熟或损伤精子DNA 为单链，染成红色、橙色或黄色。结果：SCD 实验检测结果为：IO 患者精子大晕环、中晕环、小晕环和无晕环精子百分率分别平均为(51.8 ± 17.1)%、(9.4 ± 8.6)%、(11.9 ± 5.8)%和(26.7 ± 10.6)%，健康对照组平均为(73.2 ± 6.2)%、(14.8 ± 5.7)%、(6.8 ± 2.9)%及(5.3 ± 2.2)%，二组比较，差异有统计学意义(t = 4.256, P < 0.01; t = 5.1849, P < 0.05; t = 3.6967, P < 0.01; t = 5.7971, P < 0.01)，DNA 损伤精子百分率，IO 患者为38.1% ± 9.5%，正常生育男性为12.1% ± 5.2%，二者比较有显著性差异(P < 0.01)。AOT 的检测结果为：IO 患者的单链DNA 精子比率和正常生育男性的比较，无显著差异(P > 0.05)。结论：精子DNA 完整性异常可导致男性不育。SCD 实验是一种有效的精子DNA 完整性检测方法。

关键词

精子染色质扩散(SCD)实验，精子吖啶橙染色实验，精子DNA 完整性，特发性少精子症，男性不育

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1. 引言

精子DNA 是精子遗传物质的载体，近年来的研究表明精子DNA 的完整性能够影响精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎的发育。精子DNA 完整性对自然受孕、人工授精、胚胎、胎儿、婴儿甚至成人的发育至关重要。研究表明精子DNA 完整性是优于常规精液分析的独立参数[1]，与辅助生殖技术结局有相关性[2]。因此，对男性不育患者进行精子DNA 完整性分析，有助于探讨或发现其不育的原因，为患者的预防和治疗提供咨询及诊断依据。

本研究对少精子症(idiopathic oligozoospermia, IO)患者同时应用精子染色质扩散(SCD)实验和吖啶橙染色实验(AOT)两种方法检测精子DNA 完整性，探讨男性不育机理，并通过比较两种方法的检测结果，

Open Access

房振亚等

分析这两种方法的应用价值。报告如下。

2. 对象与方法

2.1. 对象

选取山东省妇幼保健院2014年1月至2016年2月就诊的IO患者27例为不育组，年龄(28~37)岁，平均(28.5 ± 3.2)岁，平均不育年限(5.3 ± 2.8)年。夫妇染色体检查均为正常核型。排除生殖器异常、内分泌异常及感染因素引起的不育。男性检查包括男性第二性征、阴茎、阴囊、精索、输精管、睾丸、附睾等。健康对照组选取32名近期生育过的正常成年男性，年龄(28~38)岁，平均(29.1 ± 2.7)岁，男性检查均无发现异常。

2.2. 精液常规分析

按照WHO《人类精液及精子–宫颈粘液相互作用实验室检验手册》[3]和《世界卫生组织男性不育标准化检查与诊疗手册》[4]精液变量参考值的标准：液化时间少于60 min，精液量大于2 ml，密度大于20 × 106/ml，存活率≥ 60%，前向运动精子≥ 50%，精子正常形态率> 30%，为正常精液指标参数。连续3次精液常规检查5 × 106/ml ≤精子密度< 20 × 106/ml为少精子症，精子密度< 5 × 106/ml为严重少精子症。

2.3. 精子DNA完整性检测

2.3.1. 仪器和试剂

1) 仪器：E-1000荧光显微镜(日本NIKON)。OLYMPUS CX31普通光学显微镜(日本)。2) 主要试剂：低溶点琼脂、标准琼脂、二硫苏糖醇(DTT)、联咪二苯吲哚(DAPI)、三羟甲基氨基甲烷–硼酸盐–乙二胺四乙酸二钠盐(Tris-Borate-EDTA，TBE)缓冲液、瑞氏-姬姆萨染液、吖啶橙等均购自美国Sigma公司。其余试剂均为国产分析纯试剂。

2.3.2. SCD实验,根据文献[5] [6]略加修改

1) 方法：精液标本用磷酸盐缓冲液(pH6.8)调至10 × 106/ml，取0.3 ml处理好的精液与0.7ml 1%低熔点琼脂凝胶混匀，37℃孵育；吸取50 μl上述精子混合液滴在经过0.65%正常溶点琼脂预处理过的载玻片上，盖上22 × 22 mm盖玻片4℃放置5 min；小心去除盖玻片，室温(22℃左右)将标本载玻片浸入0.08 mol/L 的盐酸(HCl)内变性7 min；然后浸入含0.4 mol/L二硫苏糖醇(DTT)的精子裂解液内(pH 7.3) 20 min；再移入TBE缓冲液中3 min；然后将标本载玻片依次放入70%、90%和100%的乙醇中脱水。所有操作过程均要求标本载玻片处于水平状态。风干后放入密封盒，可存放数月。观察前染色。

2) 染色：在标本上滴50 μl 2 μg/ml的DAPI染色，立即在荧光显微镜下观察。如用普通光学显微镜观察，需进行瑞氏–姬姆萨染色。先用瑞氏染液将标本面充分覆盖；稍等片刻再加姬姆萨染液1~2滴；稍等1~2分钟后，再缓慢加磷酸盐缓冲液，直至染色液形成表面张力；染色10分钟；用蒸馏水缓缓冲洗至少2分钟，风干，立即观察结果(也可存放于密封盒内数周后观察)。

3) 结果判断：计数500个精子，观察精子晕环大小。根据环晕与精子头部横径的比例，粗分为大、中、小和无晕环4个等级，大和中晕环表示精子DNA完整无碎片，小和无晕环表示精子DNA断裂为碎片。小晕环以≤精子头直径四分之一为判断标准，中晕环> 精子头直径四分之一而≤精子头直径三分之二，大环晕> 精子头直径三分之二。

2.3.3. AOT，按参考文献[5]方法

1) 方法：精液标本根据文献[2]配制的泰洛氏(Tyrode’s)液洗涤3次，精子沉淀稀释至50 × 106/ml；

房振亚等

涂片，风干；卡诺氏(Carnoy’s)液(1份冰醋酸：3份甲醇)固定2 h，风干；用新配制的0.19 mg/ml的吖啶橙(pH 2.5)避光染片5 min；双蒸水冲洗染片，盖上盖玻片立即观察。

2) 结果判断：采用荧光显微镜计数500个精子(波长450~490 nm)，观察精子着色情况，绿色精子为

未受损伤的双链DNA精子，红色及黄色、橙色为受损伤的单链DNA精子。

2.4. 统计学分析

采用SPSS(11.5版)软件系统进行统计处理，精液常规分析数据、SCD实验及AOT检测数据均以均数± 标准差(x± s)方式表达；健康对照组和不育组比较经t检验。P < 0.05视为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 精液常规检查结果

精液常规分析如表1所示。IO患者精子密度、活力、畸形率与健康对照组有显著性差异(P < 0.001)。

3.2. 精子DNA完整性检测结果

3.2.1. SCD实验结果

SCD实验通过显示大、中、小晕环和没有晕环4个等级来分析含碎片DNA精子的百分率，见图1。

IO患者精子大晕环、中晕环、小晕环和无晕环精子百分率分别平均为(51.8 ± 17.1)%、(9.4 ± 8.6)%、(11.9 ± 5.8)%和(26.7 ± 10.6)%，健康对照组平均为(73.2 ± 6.2)%、(14.8 ± 5.7)%、(6.8 ± 2.9)%及(5.3 ± 2.2)%，二组比较，差异有统计学意义(t = 4.256, P < 0.01; t = 5.1849, P < 0.05; t = 3.6967, P < 0.01; t = 5.7971, P <

0.01)。IO患者含DNA碎片精子(小晕环和无晕环精子)百分率为26%~82%，平均(38.1 ± 9.5)%，健康对

照组8%~18%，平均(12.1 ± 5.2)%，二组比较，差异有统计学意义(t = 9.2438, P < 0.01)，见表2、表3。

3.2.2. AOT结果

AOT根据双链DNA精子染成绿色，单链DNA精子染成红色或黄色的原理来分析含DNA碎片精子的百分率，见图2。健康对照组绿色荧光的精子平均为(60.1 ± 16.6)%，具有橙色、黄色或红色荧光的精子平均为(39.8 ± 19.2)%，不育组绿色荧光的精子平均为(54.7 ± 12.2)%，具有橙色、黄色或红色荧光的精子平均为(45.5 ± 13.8)%，两组比较，差异均无统计学意义(t = 0.5617和t = 0.6720，P > 0.05)，见表3。

3.2.3. SCD实验与AO实验结果比较

SCD实验中无晕环和小晕环的精子为DNA损伤精子，AO实验中黄色、橙色及红色精子为单链DNA 精子。健康对照组SCD实验的小晕环、无晕环精子占总精子数的百分率为(12.1 ± 5.2)%，AO实验的红、橙、黄色精子占总精子数的百分率为(39.8 ± 19.2)%，差异有统计学意义(t = 5.0443, P < 0.01)。IO患者SCD 实验的小晕环、无晕环精子百分率为(38.1 ± 9.5)%，AO实验的红、橙、黄色精子的百分率为(45.5 ± 13.8)%，差异无统计学意义(t = 0.4312, P > 0.05)。

健康对照组32 63.1 ± 10.5 67.8 ± 12.3 21.3 ± 6.2 2.8 ± 0.6

不育组27 10.8 ± 6.9a48.2 ± 15.9a41.2 ± 15.3注：a与健康对照组比较，P < 0.001。

房振亚等

健康对照组32 73.2 ± 6.2 14.8 ± 5.7 6.8 ± 2.9 5.3 ± 2.2

不育组27 51.8 ± 17.1a9.4 ± 8.6b11.9 ± 5.8a26.7 ± 10.6a

注：与对照组比较，a P < 0.01，b P < 0.05。

Table 3. Comparison (s) of SCD experiment and ao experimental results

表3. SCD实验与AO实验结果比较(x± s)

SCD AOT

例数小、无光晕精子(%) 红、橙、黄色精子(%) 绿色精子健康对照组32 12.1 ± 5.2 39.8 ± 19.2a60.1 ± 16.6

不育组27 38.1 ± 9.545.5 ± 13.8 54.7 ± 12.2

注：与SCD比较，a P < 0.01。

Figure 1. Light microscope sperm picture of SCD test. C for the healthy control

group, 1, 2, 3 were large halo sperm, 4 was small halo sperm; d is a sterile group, 1

is a large halo sperm, 2 is a halo ring sperm, 3 and 4 are halo sperm, 5 is a halo - free

ring sperm. (general optical microscope, ×1000)

图1. SCD试验普通光镜精子图片。c为健康对照组，1、2、3号为大晕环精子，

4号为小晕环精子；d为不育组，1号为大晕环精子，2号为中晕环精子，3、4

号无晕环精子，5号为无晕环退化精子。(普通光学显微镜，×1000)

Figure 2. a is for the healthy control group, b is for the infertility group, the green

arrow refers to normal double stranded DNA sperm (green), the red arrow refers to

single strand DNA sperm (red, orange, yellow) (fluorescence microscope, ×1000)

图2. AOT。a为健康对照组，b为不育组，绿色箭头所指为正常双链DNA精子

(绿色)，红色箭头所指为单链DNA精子(红色、橙色、黄色)(荧光显微镜，×1000)

4. 讨论

人类精子成熟过程中，其DNA极易受内外环境因素影响而形成DNA碎片，从而引起精子形态和功能异常，导致男性不育，并带来遗传风险。尽管精子DNA完整性一直是生殖医学领域研究热点，但过去

房振亚等

对精子DNA完整性的研究并不多，主要是存在方法学的不足。随着技术的发展和研究的深入，精子DNA 完整性检测方法逐渐增多。然而这些方法大都需要流式细胞仪或荧光显微镜分析观察，或检测试剂昂贵或步骤繁琐，限制了这些方法的临床应用。SCD实验是由Fernández等[5]2003年创立的一种精子DNA 完整性检测方法，基本方法和原理是：将精子悬液与琼脂糖混合铺于载玻片上，酸处理后用裂解液裂解细胞去除核蛋白，用DAPI染色后在荧光显微镜观察精子。损伤断裂的DNA在酸处理后不能再产生特征性晕环。根据晕环的大小，可以判定精子DNA是否有碎片也就是确定其DNA的完整性，从而对男性生育力进行评估。然而由于荧光容易发生淬灭，晕环的大小在荧光显微镜下不容易区分，也不容易区分精子和其他精液细胞。2005年Fernández等[6]改进了SCD检测方法，用瑞氏染液染色，可在光学显微镜下观察。精子头部晕环清晰易辨，并保留了精子尾部，得以区分精子和其他细胞。还能清晰地观察到荧光染色无法观察的退化的精子。使观察结果更加准确可靠。正常精子没有DNA碎片，具有大的晕环或中等晕环；而存在DNA碎片的精子没有晕环形成或有很小的晕环，或没有晕环且着色很淡，呈退化迹象。

本研究在改良的SCD实验[6]基础上，适当缩短了操作时间，使之更适于临床应用。并改瑞氏染液为瑞氏–姬姆萨染液进行染色，在普通光学显微镜下清晰观察到精子晕环，方法稳定、简单，重复性好，可直观定量显示精子DNA完整性水平，适于临床检测。

在实验方法建立过程中，我们发现影响精子SCD实验结果的因素为混合精子用的低溶点琼脂的浓度会影响精子粘附在载玻片上的牢固程度，从而影响实验效果。预处理载玻片时，正常溶点琼脂涂布不均匀可能使精子脱落，载玻片上出现无精子空白区域而检测不到精子。其次, 合适、稳定的室内温度(20℃~32℃)也是SCD实验成功的关键。预实验结果表明，如果室温低于18℃，则影响变性及裂解的效果，但16℃左右对染色效果仍无影响。因此，严格遵守实验程序，保持室温相对稳定，对于SCD实验成功至关重要。

本研究采用SCD实验，观察了IO患者的精子DNA损伤情况，结果发现小晕环、无晕环精子百分率高于健康对照组[分别为(38.1 ± 9.5)%和(12.1 ± 5.2)%]，说明IO患者的精子DNA损伤程度高于健康对照组。最近，Gallegos 等[7]对泌尿生殖系统感染的男性不育患者精子进行SCD检测，精子DNA碎片是正常生育男性的3倍(35.2%:10.8%)，经过抗菌治疗后，精子DNA碎片下降到13.6%和11.2%。本研究结果与以上研究结果相符。提示IO患者精子DNA完整性异常，可能是精子质量下降的原因。

AOT是一种常用的检测精子DNA单链或双链结构的方法[8][9][10]。其染色机理是：精子在附睾内成熟期间，精子头部DNA的硫醇类逐渐转为二硫化物，使DNA具有对抗酸所致变性的性能，从而保持了双链结构。而不成熟精子或受损伤的DNA在酸的作用下变性，成为单链。AO荧光物质结合双链DNA 呈单体形式，发绿色荧光，而与单链DNA结合时呈聚合物形式，发红色或黄色荧光。

本研究在进行SCD实验的同时还对同一份标本的精子涂片进行AOT。结果发现，AOT中，IO患者和健康对照组的绿色精子百分率和红、橙、黄色精子百分率无统计学差异，健康对照组和IO患者均显示较高水平的DNA碎片。提示AOT用于精子DNA完整性检测的可靠性不高。Eggert-Kruse等[11]也曾对AOT用于评价精子质量提出了质疑，在其研究中，AOT与精液参数(如精子计数、动力、形态、活率、以及精子–宫颈粘液作用实验等)没有相关性。有人认为这可能与对颜色辨别的灵敏度、稳定性有关[12]。

在本研究中，健康对照组的AOT与SCD实验结果不一致。AOT结果明显高于SCD实验结果，差异有统计学意义。提示AOT如何用于评价精子DNA完整性以及是否适用还需进一步探讨。

相对于AOT，本研究使用的SCD检测方法具有简单、快速、准确、廉价、分辨率高的特点，适用于临床应用。但仍需要进一步扩大样本，建立SCD实验检测标准和正常参考值，以便进一步扩大SCD 实验的临床应用范围。

房振亚等基金项目

山东省科技发展计划资助(基金号：2015GSF118072)。

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吖啶橙荧光染色法

吖啶橙荧光染色法【实验原理】吖啶橙(acridine orange, A0)是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧光发射峰为530nm (DNA )、640 ( RNA )，它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光( 502nm) 激发下，细胞核发亮绿色荧光(约530nm)，核仁和胞质RNA发橘红色荧光(>580nm)。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA、RNA两种核酸。【实验用品】 1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂 (1)0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH2PO4?H2O 2.76g，加蒸馏水至100ml; B 液：Na2HPO4 ? 7H2O 5.36g，加蒸馏水至100ml; 取A 液16.5ml + B 液33.5ml + NaCl 8.5g，用蒸馏水稀释至100ml。 (2)1%吖啶橙原液取0.1g吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml (临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS溶液稀释10倍)。 3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。 (1 )取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。 (2)95%乙醇溶液固定5min。 (3)滴加0.01%吖啶橙染液5min。 (4)盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。【结果与观察】荧光显微镜下(选用蓝色激发滤片)，可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质及核仁显示橘红色荧光【注意事项】 (1 )制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。 (2)每种荧光染料，均有自己的最适pH,此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。

AOEB染色的讨论

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色 AO / EB原理与流程 zhongyisheng: 1 原理：吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。溴乙锭(E仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。凋亡的细胞呈现为染色增强，荧光更为明亮，均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构。非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。二者形态迥然相异，很易判别。在荧光显微镜下观察，可见四种细胞形态：活细胞(VN)，核染色质着绿色并呈正常结构；早期凋亡细胞(VA)，核染色质着绿色呈固缩状或圆珠状；非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质着橘红色并呈正常结构；晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。 2 AO/EB染色及观察结果：取20-100μl的1：100稀释的染色剂置于载玻片的贴壁细胞上室温下静置20min，PBS洗涤2-3遍，上覆盖玻片，荧光显微镜下观察结果并计数20-200个细胞。ym1051: 1.能否提供具体实验步骤? 2.您在文中所说的"1：100稀释的染色剂"是怎样稀释的?如何在载玻片上种上贴壁细胞? zhongyisheng: 1 用1mlEP管稀释时，先取微量的染色剂，然后再取稀释剂（如BSA）加入EP管吹打即可。 2 消毒灭菌处理后的盖玻片平放入培养皿或中即可实验。 ym1051:我好像已明白具体过程了:首先要进行细胞爬片,然后将染色剂滴加在已爬有细胞的盖玻片上,温育后洗涤,再盖上盖玻片则可进行观察了.是这样吗?如果不经过爬片处理而将细胞进行消化,再将细胞和染色剂滴加在盖玻片上进行观察,行吗? zhongyisheng:的确，不经过爬片而是将贴壁细胞消化下来一样可以进行进一步的实验。这是悬浮细胞的典型方法。当然，由于进行免疫组化染色进行的形态学检查经常考虑到细胞的原貌，在国际上比较通用，尤其是在进行动态检查时。医琳师妹：我将我所作的方法与大家共享：吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用 15mg吖啶橙溶于100ml 的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。 2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。（有人用PBS配制吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合液，各含100μg/ml。细胞离心，悬液于PBS 中，取100μl细胞悬液加4μl荧光染色液，轻轻吹打，滴至载玻片上，加盖玻片后立即置荧光显

ChIP试剂盒染色质免疫共沉淀全套解决方案

https://www.360docs.net/doc/c314756439.html, 染色质免疫共沉淀全套解决方案——ChIP试剂盒染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）作为最佳的研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法，它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 ChIP不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP的进一步完善，它必将会在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。当前国内科研情况而言，研究分化，转录，发育，iPS，肿瘤干细胞，表观遗传学等等领域的老师都会做ChIP实验，还有部分老师会自己买抗体，手工配置试剂。但由于这个实验本身实验步骤比较繁琐而且其中很多步骤都非常关键，所需的试剂较多，容易造成配置间的误差，实验周期较长，若未设置阴性和阳性对照，更会导致结果无法分析，从而进入无休的困惑。经典染色质免疫共沉淀(ChIP)试剂盒(p-2002)：提供了对细胞样品进行染色质免疫沉淀反应所需的所有试剂。并且本试剂盒中含有一种阳性对照抗体(RNA聚合酶II抗体)、一种阴性对照抗体(正常小鼠的IgG)、GAPDH引物(可以作为阳性对照来保证试剂盒中试剂和操作步骤没出现问题)。在大多数生长期的哺乳动物细胞中，RNA聚合酶II会在GAPDH基因启动子上富集，准备起始转录，因此该启动子能与RNA聚合酶II发生免疫沉淀反应，而不能与正常小鼠IgG发生。在本染色质免疫沉淀反应中，细胞耦合了甲醛，提取出其中的染色质。染色质进行适当的打断，然后加入到微孔中与其表面上吸附的抗体发生免疫反应。特异性结合到微孔上的DNA从抗体-捕获蛋白-DNA复合物上释放出来，翻转后，通过本公司专门设计的高速离心柱纯化。洗脱下来的DNA可直接用于随后的各种分析。本试剂盒是基于96孔板的，市场上同类产品中最快捷的试剂盒，对CHIP过程进行了彻底的简化，操作简捷，方便易学整个处理过程不到5小时，同时可拆卸式的96孔板模式使研究人员能根据自己需要选择手工或是高通量分析。

人类X染色质(巴氏小体)制备与观察

人类X染色质（巴氏小体）的制备与观察摘要巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中形成的呈异固缩状态，贴近于核膜边缘的染色小体，在遗传学、细胞观察方面有重要意义。实验中作者取人口腔颊部上皮细胞与发根毛囊细胞进行硫瑾染色操作，通过显微观察对巴氏小体进行识别与计数，描述巴氏小体的形态，并统计其在不同性别人体细胞中的出现率。引言在哺乳动物体细胞间期细胞核中，除一条X染色体外，其余的X染色体失活并呈异固缩状态，此即为巴氏小体。又称X小体、性染色质，直径约1μm，通常位于间期核膜边缘。1949年，加拿大学者Barr在雌性猫的神经元细胞核中发现一种染色很深的小体，而在雄性猫中则极少出现[1]。通常人类男性细胞核中很少或没有巴氏小体，而女性有1个，性染色体异常的患者如XXY、 XXYY、XXX、XXXY等，巴氏小体的数量＝X染色体数量－1。综合巴氏小体与哺乳动物性染色体的剂量补偿效应，Lyon M．F 于1961年提出Lyon 假说，主要内容有： (1)正常的雌性哺乳动物两条X染色体只有一条在遗传上有活性，另外一条失活； (2)X染色体失活是随机的。因此表达是随机的，结果在杂合子中会出现嵌合现象（mosaic）。例外：有袋类失活的X染色体全部是父方的。 (3)失活发生在胚胎发育的早期，如人在受精后的16天（5000-6000个细胞时）。一个细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的后代细胞中该染色体均失活。 Lyon假说虽然可以解释一些问题但不是全部，如人类中的44AXO型个体表现为Turner 综合症、44AXXY表现为Klinefelter综合症。随着生物学和医学的发展人们已经认识到单条X染色体失活现象是普遍存在的，但失活的染色体上存在失活区和非失活的。如人类中位于X染色体上的基因，G6PD（葡萄糖-6磷酸脱氢酶）、AHF（抗溶血第Ⅷ因子）等是非失活的，而Xg血型基因是失活的。巴氏小体的生物学观察，对于优生学中鉴别性别和预防性连锁疾病的发生，以及作为癌细胞核异常主要形态学特征之一鉴定癌细胞，有重要价值[1]。本次实验将通过实验掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别巴氏小体的形态特征及所在部位，并了解巴氏小体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点。 1.实验材料 1.1.生物材料：人体口腔颊部上皮细胞，人体发根毛囊细胞。 1.2.器材：显微镜，解剖针，牙签，眼科镊，载玻片，盖玻片，滤纸条。 1.3.试剂：硫瑾，1mol/L HCl，蒸馏水，45%醋酸。 2.实验步骤 2.1.观察人口腔颊部上皮细胞巴氏小体 2.1.1.取材用灭菌的牙签轻刮口腔颊部上皮，涂片，晾干。 2.1.2.加1mol/L 的盐酸水解10-15分钟。轻轻水洗，晾干。 2.1. 3.硫瑾染色10-20分钟，洗净，晾干。

细胞染色方法

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，染色与观察：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.

注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。（二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，

人类性染色质小体的制备与观察实验报告

人类性染色质小体的制备与观察 1949年，Barr在猫神经元核仁附近发现一种染色很深的小体。仔细研究发现这种小体出现在多数雌猫神经元中，而在雄猫的神经元中则极少出现。他以更多的动物组织做了深入的研究，结果发现食肉类、偶蹄类、灵长类（包括人类）等动物的不同组织的体细胞中，同样显示这种性别差异。Barr称这种小体为核仁随体（现在我们通常称之为Barr小体，性染色质小体，或X染色质。下文统称这种小体为X染色质），并推论这种小体是由性染色体的异染色质衍化来的。 Barr的推论是正确的，但他并沿岸有弄清这小体竟是1条X染色体还是2条X染色体的异染色质形成的。这是因为间期的染色体在核中伸展成丝状，异染色质虽可染上较深的颜色，但无法辨别它究竟是一条染色体或仅是一条染色体或仅是染色体的一个片段。20世纪60 年代前后，根据对性染色体异常病人的X染色体与X染色质数目的关系的研究发现，X染色质数等于一个个体的X染色体数减1。进一步的研究表明，一个X染色质是一条异染色质化的X染色，在间期其DNA的复制要比其他的染色体晚（Morishima，1962）。在一个个体中，究竟是来自父本还是来自母本的X染色体失活，则是随机的，这种随机失活是生物体内的剂量补偿机制（LYON，M.，1962）。从上述我们可以看出X染色质是一种包含结构基因的异染色质，这种异染色质通常称为兼性异染色质（facultative chromatin）。通常用口腔粘膜、头发根鞘、外周血细胞等制备X 染色质。由于取材方便，方法简单，X染色质检测广泛应用于性别畸形的诊断中。检查羊水细胞的X染色质，还可在产前诊断胎儿性别。在人类细胞中，还存在另一种异染色质小体，这就是Y染色质，Y染色体在间期也呈现异固缩状态。Y染色质如何检测呢？研究发现，Y染色体长臂的远端经过荧光染料喹吖因（quinacrine）染色后，可发出明亮的荧光，这种荧光在间期细胞中表现为一个明亮的荧光点，直径约在0.3-1um。在多数情况下，其他的染色体不显荧光或不具有如此强的荧光，因此，这种荧光亮点就成了检测Y染色质的一种方法。用于制备X染色质的材料同样可用于制备Y染色质。制备两种染色质的方法有多种，Schwarzacher（1974）曾对此做过详尽的综述。在本实验中，我们将选择两种材料、两种染色方法制备并观察X染色质小体。

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验具体方法及步骤

染色质免疫共沉淀（ChIP）实验具体方法及步骤在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。 4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100 ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为 4x106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

吖啶橙溴化乙锭双荧光染色试剂盒

吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色试剂盒简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA,属于异染性荧光染料， AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发橙红色荧光。溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB)嵌合到双链DNA 或RNA 的碱基对中，无碱基特异性，发红色荧光。吖啶橙可透过活细胞膜，EB 不能通过与活细胞膜具有相同通透性的细胞膜。组成：操作步骤(仅供参考)： 1、 AO/EB 工作液的配制：取试剂(A)、试剂(B)、试剂(C)，按照试剂(A):试剂(B):试剂 (C)=1:1:8的比例稀释成AO/EB 工作液。 2、每份细胞样品中加入AO/EB 工作液2μl ，混合均匀。 3、低速离心，弃上清。 4、用AO/EB Dilution Buffer 重悬细胞，细胞计数，将细胞密度调整为0.5~5×106个/ml 。 5、加入1μl AO/EB 工作液，充分混匀。 6、取洁净载玻片，滴加上5μl 细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。 7、在荧光显微镜B 域进行观察。染色结果：注意事项： 1、用能通过活细胞膜与DNA 结合后发蓝色荧光的Hoechist 33342和只能通过死细胞与DNA 结合后发红色荧光的碘化吡啶( propidium iodide ，PI)对细胞进行双染的方法也比较常用。编号名称 DA0039 100T Storage 试剂(A): AO solution 200μl 4℃ 避光试剂(B): EB solution 200μl RT 试剂(C): AO/EB Dilution Buffer 50ml 4℃ 避光使用说明书 1份活细胞绿色荧光死细胞橙色荧光

染色质免疫共沉淀技术的发展

染色质免疫共沉淀技术的发展姚汪劲松发育生物学2013级2013110046 摘要：本文主要介绍了染色质免疫沉淀技术的发展历程、基本原理和优缺点，并且介绍了反向染色质免疫沉淀技术，并对两种方法进行了比较。关键词：染色质免疫共沉淀；反向染色质免疫共沉淀；应用，研究前景。目前，不断发展的DNA和蛋白质相互作用的方法和技术已经成为研究DNA复制、重组、修复和转录的核心。其中凝胶阻滞实验（EMSA），报告基因分析，DNA微阵列，质谱分析法MS，酵母单杂交系统和染色质免疫共沉淀技术（ChIP）是被广泛应用于研究DNA 和蛋白质相互作用的方法。真核生物基因组DNA以染色质形式存在，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核生物基因表达调控机制的基本途径。生物体内基因表达调控主要发生在转录过程中，转录调控是顺式作用元件(Cis-acting elements)如启动子(Promoter)、增强子(Enhancer)与反式作用因子(Trans-acting factors)相互作用的结果。基因组DNA的甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化和磷酸化修饰，核小体重新定位及染色体结构重建都影响调控。转录调控具有细胞类型、发育阶段和外界环境刺激的差异性，哺乳动物转录调控序列分散在较大区域，组蛋白修饰状态达100多种，这些因素都增加了转录调控的复杂性。 ChIP是一种在体内研究转录因子和靶基因启动子区域直接相互作用的方法，可以在体内直接确定它们之间相互作用方式的动态变化，能够得到转录因子结合位点的信息，确定其直接靶基因。它早期多被用于研究核小体上的DNA和组蛋白的相互作用以及组蛋白的修饰等方面。近年来，随着生物技术的迅速发展，ChIP技术不断发展和完善，被广泛应用于体内转录调控因子与靶基因启动子上特异核苷酸序列结合方面的研究，并成为在染色质水平研究基因表达调控的有效方法。特别是，此技术与DNA芯片和分子克隆技术相结合，可用于高通量筛选已知蛋白因子的未知DNA靶位点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入研究DNA与蛋白质相互作用的调控网络。 ChIP技术由Orlando等于1997年创立。其基本原理为将处于适当生长时期的活细胞用甲醛交联后将细胞裂解，染色体分离并打碎为一定大小的片段；然后用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白与DNA交联的复合物，对特定靶蛋白与DNA片段进行富集。采用低pH值条件反交联，DNA与蛋白质之间的Schiff键水解，释放DNA片段。通过对目标片段的纯化与检测，获得DNA与蛋白质相互作用的序列信息。在上述ChIP过程中，甲醛能够进入细胞并使蛋白质与DNA或蛋白质与蛋白质之间通过希弗(Scihff)键交联，形成稳定结合的复合物。如果交联效果不太好，可以先用交联剂DMA(Dimethyl adipimidate)或DSG (Disuccnimidyl glutarate)处理细胞，以加强后续甲醛交联的效果。破碎DNA可采用超声物理破碎或特定酶切消化，以获得所需长度的DNA片段。由于DNA片段长度将影响抗体免疫沉淀效率，因此破碎DNA是ChIP实验成功与否的重要因素。超声效果与细胞裂解是否充分、细胞浓度及裂解液成分等因素有关。超声处理后的液体应从浑浊状态变为透明状态。选择专一性及亲和力较高的抗体是ChIP成功的关键。非特异性抗体将增加大量的非目标靶点DNA片段信息，从而掩盖了真实的蛋白质结合位点信息；而亲和力较差的抗体，则无法获得高信噪比靶点DNA片段。另一方面，在甲醛交联过程中可能会掩盖一些蛋白质的表位，这会影响到一部分蛋白质和DNA复合体的免疫沉淀反应。因此，用Western印迹或免疫组化等常用的实验方法证明的能够对目标蛋白质进行免疫结合的抗体，并不能保证一定能够成功地进行ChIP实验。例如，Weitsman 等检验了不同的雌激素受体β抗体在ChIP中的免疫沉淀能力，发现有的抗体虽然能够在标准免疫沉淀条件下与抗原结合，但不适合ChIP条件下使用，并

吖啶橙染色液

吖啶橙染色液吖啶橙染色液(1mg/ml) 产品简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。 (1mg/ml)为储存液，使用时应稀释到合适浓度后使用。染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB 染色合用双染，因EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。自备材料： 1、荧光显微镜 2、低速离心机 3、 PBS 4、细胞计数板 5、载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)： 1、收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用PBS 清洗细胞1次，计数并调节

细胞浓度至106/ml。 2、取适量的细胞悬液，加入Acridine Orange Stain(1mg/ml)，使AO终浓度为8.5～17 μg/ml，轻轻混匀。 3、室温避光染色15～20ml，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。 4、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515nm)，计数并拍照。染色结果：正常细胞细胞被均匀染成黄绿色荧光凋亡细胞染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒注意事项： 1、Acridine Orange Stain(1mg/ml)不含破膜剂，较少单独使用。 2、吖啶橙染色常与EB染色合用，可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。 3、如有低温离心机进行离心效果更佳。 4、操作过程中应注意减少试剂暴露于强光下的时间。 5、试剂有一定毒性，请小心操作。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：6个月有效。

吖啶橙荧光染色法

. ’. 吖啶橙荧光染色法【实验原理】吖啶橙（acridine orange ，AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA 和RNA 同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm ，荧光发射峰为530nm （DNA ）、640（RNA ），它与双链DNA 的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA 和RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm ），核仁和胞质RNA 发橘红色荧光（>580nm ）。吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA 、RNA 两种核酸。【实验用品】 1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。 2、试剂（1）0.1mol/l pH7.0 PBS 液 A 液：NaH 2PO 4·H 2O 2.76g ，加蒸馏水至100ml ； B 液：Na 2HPO 4·7H 2O 5.36g ，加蒸馏水至100ml ；取A 液16.5ml ＋B 液33.5ml ＋NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至100ml 。（2）1%吖啶橙原液取0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml （临用时配制0.01%吖啶橙染液：将1%吖啶橙原液用pH7.0 PBS 溶液稀释10倍）。 3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。（2）95%乙醇溶液固定5min 。（3）滴加0.01%吖啶橙染液5min 。（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。【结果与观察】荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA 的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色【注意事项】（1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。（2）每种荧光染料，均有自己的最适pH ，此时荧光最强。当pH 改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH 缓冲液中进行。

吖啶橙

技名词定义中文名称：吖啶橙英文名称： acridine orange 定义：可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式C17H19N3 · HCl · ZnCl2, 分子量438.12g/mol,是一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻断滤光片波长515nm。它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染，因EB只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞.它还可以用作移码突变的诱变剂,能镶嵌于两个相邻的碱基对之间，这样在DNA复制过程中，会使DNA链增加或缺失一个碱基，造成移码突变。吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。简称：AO AO能与无机酸形成盐，具有绿色荧光。如果再稀释的话，便水解成游离的AO，而呈现紫色荧光。吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色测定PC12细胞凋亡（acridine orange/ethidium bromide, AO/EB）：（1）细胞爬片：在6孔培养板中预先置入玻璃盖玻片，接种细胞悬液，干预后，予95%乙醇固定15分钟，微干，然后准备荧光染色。将100mg/L 溶于PBS的吖啶橙和100mg/L溶于PBS的溴化乙锭各5μl（临用前混合加入，加样量宜小，有时各2μl-5μl足够，量太大容易形成细胞凋亡的假阳性），在照相前混匀后加入，轻轻吹打，30秒后用激光共聚焦显微镜观察照相。（有人用15mg吖啶橙溶于100ml pH6.8的PBS中过滤，避光保存）计取5个视野，共100个细胞中凋亡细胞百分数。（2）如制成细胞悬液：取100μl PBS稀释的细胞悬液，加2μl的染色液，其中AO/EB，各含100μg/ml，加入染料30秒后观察摄像。

实验十 X染色质标本的制作和观察

实验十X染色质标本的制作和观察一、实验目的掌握X染色质标本的制备过程及识别方法。二、实验用品器材：显微镜，牙签，载玻片，盖玻片，滴管，吹风机，染色缸试剂：硫堇，甲醇，冰醋酸，蒸馏水，1N的HCL，香柏油，二甲苯材料：人口腔粘膜上皮细胞三、实验原理 1．X染色质是X染色体由常染色质变为异染色质后失活而成。典型的X染色质位于核膜内侧缘，大小为1~1.5um，形状多为半圆形、三角形、不规则形。正常女性间期细胞中X染色质的阳性率为10~30%，在男性间期细胞则平均低于1%。从理论上讲，正常女性的间期细胞中都应该有一个X染色质，但事实上由于染色方法、染色技术以及X染色质在细胞核中的位置不同，实际检查中不可能在每个细胞中都看到。 2．X染色质的本质是兼性异染色质。在胚胎发育的3~4周，女性胚胎中两条X染色体中的一条随机发生失活变为X染色质；而存在于女性卵子中的X X染色质示意图X染色质光镜图四、实验内容与方法硫堇（thionine）染色法： 1．取材：取口腔粘膜细胞。漱口3~4次后，用牙签从面颊部内侧粘膜刮取口腔粘膜细胞，将细胞涂于干净载玻片上，用签字笔写下学号，置于空气中自然干燥。 2．固定：配固定液：按照甲醇：冰醋酸=3：1的比例配制固定液，置于染色缸中。固定：将载玻片放入固定液中固定，10分钟后取出，用吹风机吹干。 3．分化：干燥后将载玻片放入盛有1NHCL的染色缸中分化10分钟。 4．冲洗：用自来水冲洗玻片，再用蒸馏水冲洗一次。 5．染色：将载玻片放入盛有硫堇的染色缸中静置30分钟。 6．冲洗：自来水冲洗载玻片，冲去多于的染液，用吹风机吹干。 X染色质核膜

吖啶橙荧光染色试剂盒

吖啶橙荧光染色试剂盒产品简介：吖啶橙(Acridine Orange,AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA、RNA，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此AO常用于细胞内DNA和RNA进行检测。AO与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO与DNA的结合，其荧光发射峰为530nm，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO与单链核酸的磷酸根（带负电荷）产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO与RNA的结合，其荧光发射峰为640 nm，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA分子中显绿色，与DNA单链或RNA结合时发桔黄色或橙红色荧光。 Jimei 吖啶橙染色试剂盒（Acridine Orange Detection Kit）主要由AO Stain、AO Stain Buffer组成，常用于细胞凋亡的检测。染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB染色合用双染，EB只染死细胞使之产生桔黄荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。自备材料： 1、荧光显微镜 2、低速离心机 3、PBS 4、细胞计数板 5、载玻片、盖玻片操作步骤（仅供参考）：（一）AO单独染色 1、收集细胞（采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞），用AO Stain Buffer（1×）清洗细胞1次，加入适量的AO Stain Buffer（1×）重悬细胞，计数并调节细胞浓度至 106/ml。 2、取适量的细胞悬液和AO Stain，按照细胞悬液和5μl AO Stain=19：1的比例混合，轻轻混匀。 3、室温避光染色15 min，滴加于载玻片上并加盖玻片或上流式细胞仪分析。 4、荧光显微镜下观察（激发滤光片波长488nm，阻断滤光片波长515 nm），计数并拍照。

染色质免疫共沉淀技术

知无不“研”|一文读懂染色质免疫共沉淀技术（ChIP）染色质免疫共沉淀技术（ChIP）基于体内分析而发展的染色质免疫沉淀分析（Chromatin immunoprecipitation assay kit,ChIP）技术可以真实、完整地反映结合在DNA序列上的调控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，因此能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。近年来，这种技术得到不断的发展和完善。采用结合微阵列技术在染色体基因表达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管病以及中央神经系统紊乱等疾病主要通路的一种非常有效的工具。染色质免疫沉淀分析（ChIP）的基本原理是在活细胞状态下，当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白、蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合时，它们必然靠的比较近或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。固定的蛋白质－DNA复合物通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过抗原抗体的特异性识别反应沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的未知DNA信息。今天小编将珍藏多年的ChIP实验心得拿出来与大家一同探讨。应用领域 1、判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰 2、检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位 3、研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系 4、转录因子研究技术流程

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC法)

细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法) 简介：自噬(autophagy)是细胞受到刺激后吞噬自身的细胞质或细胞器，最终将吞食物在溶酶体内降解的过程，自噬体(autophagosome)为双层膜包被的圆形或椭圆形结构，内含细胞质、长寿蛋白质和异常蛋白聚集物，损伤或多余细胞器如线粒体、粗面内质网和微体、病毒和细菌等。单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC )是一种荧光色素，是嗜酸性染色剂，通常被用于检测自噬体形成的特异性标记染色剂，其检测激发滤光片波长355nm 。阻断滤光片波长512nm 。Leagene 细胞自噬染色检测试剂盒(MDC 法)，适用于培养细胞的自噬染色，又称为MDC 染色液，可与EB 合用双染。组成：操作步骤(仅供参考)： (一)、MDC 单独染色： 1、用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。 2、离心，收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。 3、加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。 4、取适量细胞悬液至新的EP 管中，加入MDC Stain ，轻轻混匀。 5、室温避光染色。 6、离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞2次，弃上清。 7、加入Collection buffer 重悬细胞，滴加于载玻片上并加盖玻片。 8、荧光显微镜下观察(激发滤光片波长355nm ，阻断滤光片波长512nm)，计数并拍照。 (二)、与EB 双染色： 1、用去离子水稀释1×Wash buffer 至1×。 2、离心收集细胞，用1×Wash buffer 清洗细胞1次，弃上清。 3、加入适量的1×Wash buffer 重悬细胞，计数并调节细胞浓度至106/ml 。 4、取适量细胞悬液至新的EP 管中，分别加入MDC Stain 和 EB 染色液，轻轻混匀。 5、滴加于在玻片上，室温避光染色，加盖玻片。编号名称 DA0041 Storage 试剂(A): MDC Stain 1ml -20℃ 避光试剂(B): 10×Wash buffer 20ml 4℃ 试剂(C): Collection buffer 10ml 4℃ 使用说明书 1份

吖啶橙染色试剂盒

吖啶橙染色试剂盒简介：吖啶橙(Acridine Orange, AO)属于三环杂芳香燃料，可以标记DNA 、RNA ，属于异染性荧光染料。该染料具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA 和RNA 染色。因此AO 常用于细胞内DNA 和RNA 进行检测。AO 与核酸结合方式主要有：1、插入性结合，AO 嵌入核酸双链的碱基对之间，这种结合方式主要为AO 与DNA 的结合，其荧光发射峰为530nm ，激发后呈绿色荧光；2、静电吸引，带正电荷的AO 与单链核酸的磷酸根(带负电荷)产生静电间的吸引结合，这种结合方式主要为AO 与RNA 的结合，其荧光发射峰为640nm ，激发后呈红色荧光，少量结合会呈桔黄色或桔红色荧光。因此，吖啶橙嵌合到双链DNA 分子中显绿色，与DNA 单链或RNA 结合时发桔黄色或橙红色荧光。 Leagene 吖啶橙染色试剂盒(Acridine Orange Detection Kit)主要由AO Stain 、AO Stain Buffer 组成，常用于细胞凋亡的检测。染色后在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。吖啶橙染色常与EB 染色合用双染， EB 只染死细胞使之产生桔黄色荧光，由此可区分出正常细胞、凋亡细胞及坏死细胞。组成：自备材料： 1、荧光显微镜 2、低速离心机 3、 PBS 4、细胞计数板 5、载玻片、盖玻片操作步骤(仅供参考)： (一) AO 单独染色 1、收集细胞(采用流式细胞仪检测时，应先固定细胞)，用AO Stain Buffer(1×)清洗细胞，编号名称 DA0037 100T Storage 试剂(A): AO Stain 500μl 4℃ 避光试剂(B): AO Stain Buffer(10×) 10ml 4℃ 使用说明书 1份

染色质免疫共沉淀(ChIP)实验

染色质免疫共沉淀（ChIP）染色质免疫共沉淀可以：（1）组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”；（2）转录调控分析；（3）药物开发研究；（4）DNA损失与凋亡分析。 1实验方法原理：在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来。 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 2实验材料、试剂、仪器耗材：细胞样品甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、Lysis Buffer、洗脱液、RNaseA、蛋白酶K、omega胶回收试剂盒等离心管、超声仪、电泳仪、离心机等 3实验步骤：一、细胞的甲醛交联与超声破碎（第一天） 1. 取出1平皿细胞（10 cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9 ml）。 2. 37℃孵育10 min。 3. 终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5 min即可。

4. 吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5. 细胞刮刀收集细胞于15 ml离心管中（PBS依次为5 ml，3 ml和3 ml）。预冷后2 000 rpm 5 min收集细胞。 6. 倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100 ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800 ul。 7. 超声破碎：VCX750，25%功率，4.5 s冲击，9 s间隙。共14次。二、除杂及抗体哺育（第一天） 1. 超声破碎结束后，10 000 g 4℃离心10 min。去除不溶物质。 2. 留取300ul做实验，其余保存于-80℃。 3. 300 ul中，100 ul加抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl（NaCl终浓度为0.2 M），65℃处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。 4. 在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1 h。 5. 1 h后，在4℃静置10 min沉淀，700 rpm离心1 min。 6. 取上清。各留取20 ul做为input。一管中加入1 ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。三、检验超声破碎的效果（第一天） 1. 取100 ul超声破碎后产物，加入4 ul 5M NaCl，65℃处理2 h解交联。 2. 分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。四、免疫复合物的沉淀及清洗（第二天）