DNA测序原理和方法

DNA 测序原理和方法

DNA 序列测定分手工测序和自动测序，手工测序包括Sanger 双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert 化学降解法。自动化测序实际上已成为当今DNA 序列分析的主流。美国PE ABI 公司已生产出373 型、377 型、310 型、3700 和3100 型等DNA 测序仪，其中310 型是临床检测实验室中使用最多的一种型号。本实验介绍的是ABI PRISM 310 型DNA 测序仪的测序原理和操作规程。

【原理】ABI PRISM 310 型基因分析仪(即DNA 测序仪)，采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应用该公司专利的四色荧光染料标记的ddNTP(标记终止物法)，因此通过单引物PCR测序反应，

生成的PCR产物则是相差1个碱基的3”"末端为4种不同荧光染料的单链DNA混合物，使得四种荧光染料的测序PCR 产物可在一根毛细管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检测器窗口中的CCD(charge-coupled device)摄影机检测器就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光，以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为DNA 序列，从而达到DNA 测序的目的。分析结果能以凝胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输出。

它是一台能自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA 片段的碱基顺序或大

小和定量的高档精密仪器。PE公司还提供凝胶高分子聚合物，包括DNA测序胶(POP 6)和GeneScan胶(POP 4) 。这些凝胶颗粒孔径均一，避免了配胶条件不一致对测序精度的影响。它主要由毛细管电泳装置、Macintosh 电脑、彩色打印机和电泳等附件组成。电脑中则包括资料收集，分析和仪器运行等软件。它使用最新的CCD 摄影机检测器，使DNA测序缩短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析为10?40min。

由于该仪器具有DNA 测序，PCR 片段大小分析和定量分析等功能，因此可进行DNA 测序、杂合子分析、单链构象多态性分析(SSCP)、微卫星序列分析、长片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，临床上可除进行常规DNA测序外，还可进行单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变检测、HLA配型、法医学上的亲子和个体鉴定、微生物与病毒的分型与鉴定等。

【试剂与器材】

1. BigDye测序反应试剂盒主要试剂是BigDye Mix，内含PE专利四色荧光标记的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS ，反应缓冲液等。

2. pGEM-3Zf (+)双链DNA对照模板0.2g/L，试剂盒配套试剂。

3. M13(-21)引物TGTAAAACGACGGCCAGT ，3.2 卩mol/L 即3.2pmol/ 从试剂盒配套试剂。

4. DNA测序模板可以是PCR产物、单链DNA和质粒DNA等。模板浓度应调整在PCR反应时取量1 gl 为宜。本实验测定的质粒DNA，浓度为0.2g/L,即200ng/ g。

5. 弓I物需根据所要测定的DNA片段设计正向或反向引物，配制成3.2 g mol/L即3.2pmol/ g 1如重组质粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6. 灭菌去离子水或三蒸水。

7. 0.2ml或和0.5ml的PCR管盖体分离，PE公司产品。

8 3mol/L醋酸钠(pH5.2)称取40.8g NaAc 3H2O溶于70ml蒸馏水中，冰醋酸调pH至5.2，定容至100ml，高压灭菌后分装。

9. 70%乙醇和无水乙醇。

10. NaAc/乙醇混合液取37.5ml无水乙醇和2.5ml 3mol/L NaAc混匀，室温可保存1年。

11. POP 6测序胶ABI 产品。

12. 模板抑制试剂(TSR) ABI 产品。

13. 10X电泳缓冲液ABI产品。

14. ABI PRISM 310 型全自动DNA 测序仪。

15. 2400 型或9600 型PCR 仪。

16．台式冷冻高速离心机。

17.台式高速离心机或袖珍离心机。

【操作步骤】

1. PCR测序反应

(1) 取0.2ml 的PCR 管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂：

所加试剂测定模板管标准对照管

BigDye Mix 1 g l 1 gl

待测的质粒DNA 1 g l -

pGEM-3Zf (+) 双链DNA －1gl

待测DNA 的正向引物1g l -

M13(-21)引物一1 gl

灭菌去离子水2g l 2gl

总反应体积5gl不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，稍离心。

⑵将PCR管置于9600或2400型PCR仪上进行扩增。98 C变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为

96C 10s，50C 5s, 60C 4min，25个循环，扩增结束后设置4°C保温。

2. 醋酸钠/乙醇法纯化PCR 产物

(1) 将混合物离心，将扩增产物转移到1.5ml EP 管中。

⑵加入25 g醋酸钠/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12 000r/min于4C离心30 min，小心弃上清。

⑶加70%(V/V)的乙醇50 g洗涤沉淀2次。12 000r/min于4 C离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀

10 ~ 15min。

3. 电泳前测序PCR 产物的处理。

(1) 加入12 g的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。

(2) 将溶液转移至盖体分离的0.2ml PCR 管中，稍离心。

⑶在PCR仪上进行热变性(95C 2min)，冰中骤冷，待上机。

4. 上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺

序文件。仪器将自动灌胶至毛细管， 1.2kV 预电泳5min ，按编程次序自动进样，再预电泳(1.2kV，20min)，在7.5kV下电泳2h。电泳结束后仪器会自动清洗，灌胶，进下一样品，预电泳和电泳。每一个样品电泳总时间为2.5h。电泳结束后仪器会自动分析或打印出彩色测序图谱。

5. 仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。

6. 测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。

【计算】

测序反应精确度计算公式：100% —差异碱基数(不包括N数)/650海00%

差异碱基即测定的DNA 序列与已知标准DNA 序列比较不同的碱基，N 为仪器不能辨读的碱基。

【注意事项与评价】

1. ABI PRISM 310 基因分析仪是高档精密仪器，需专人操作、管理和维护。

2. 本实验测序PCR反应的总体积是5g，而且未加矿物油覆盖，所以PCR管盖的密封性很重要，除加完试剂后盖紧PCR管盖外，最好选用PE公司的PCR管。如PCR结束后PCR液小于4?4.5 g,l则此PCR反应可能失败，不必进行纯化和上样。

3. 作为测序用户来说，只需提供纯化好的DNA 样品和引物，一个测序

PCR 反应使用的模板不同，需要的

DNA量也就不同，PCR测序所需模板的量较少，一般PCR产物需30?90ng，单链DNA需50?100ng，双

链DNA需200?500ng，DNA的纯度一般是A260nm/A280nm为1.6?2.0,最好用去离子水或三蒸水溶解

DNA，不用TE缓冲液溶解。引物用去离子水或三蒸水配成 3.2pmol/敲好。

4．本实验使用的测序试剂盒是BigDye 荧光标记终止底物循环测序试剂盒，一般可测DNA 长度为650bp 左右。本仪器DNA测序精确度为（98.5 ±.5） %，仪器不能辨读的碱基N < 2%,所需测定的长度超过了650bp, 则需设计另外的引物。为保证测序更为准确，可设计反向引物对同一模板进行测序，相互印证。对于N 碱基可进行人工核对，有时可以辨读出来。为提高测序的精确度，根据星号提示位置，可人工分析该处彩色图谱，对该处碱基作进一步核对。