【9A文】生物化学实验

生物化学实验

一、糖的颜色反应及还原作用

实验一：糖的颜色反应

实验1.1莫氏实验

一、目的

掌握莫氏（molisch）实验鉴定糖的原理和方法。

二、原理

糖经浓无机酸（浓硫酸、浓盐酸）脱水产生糠醛或糠醛衍生物，后者在浓无机酸作用下，能与α-萘酚生成紫红色缩合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称“紫环反应”，其反应如下图：

利用这一性质可以鉴定糖。

三、实验器材

1、棉花或滤纸。

2、吸管1.0ml(K4)、2.0ml(K1)。

3、试管1.5K15cm(K4)。

四、实验试剂

1、莫氏试剂：称取α-萘酚5g，溶于95%乙醇并稀释至100ml。此试剂需新鲜配置，并贮于棕色试剂瓶中。

2、1%蔗糖溶液：称取蔗糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。

3、1%葡萄糖溶液：称取葡萄糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml.

4、1%淀粉溶液：讲1g可溶性淀粉与少量冷蒸馏水混合溶液合成薄浆状物，然后缓缓倾入沸蒸馏水中，边加边搅。最后以沸蒸馏水稀释至100ml。

五、操作

于4支试管中，分别加入1ml1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液、1%淀粉溶液和少许纤维素（棉花或滤纸浸在1ml水中）。然后各加莫氏试剂2滴1，摇匀，讲试管倾斜，沿管壁慢慢加入浓硫酸1.5ml(切勿振摇！)硫酸层沉于试管底部与糖溶液分成两层，观察液面交界处有无紫色环出现。

六、注意事项

1、试管中加入各种糖后，应做好标记，浓硫酸加入的方式应保持一致。

2、莫氏反应非常灵敏，所用的试剂应洗净，不可再样品中混入纸屑等杂物。

3、当糖浓度过高时，由于浓硫酸对他的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈现紫色，需稀释后再做。

思考题：

1、解释α-苯酚反应的原理。

2、用莫氏试验鉴定糖时需注意哪些？

试验1.2塞氏试验

一、目的

掌握塞氏（Seliwanoff）实验鉴定酮糖的原理和方法。

二、原理

酮糖在浓酸的作用下，脱水生产5-羟甲基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色反应，有时亦同时产生棕色沉淀，此沉淀溶于乙醇，呈鲜红色沉淀2，以果糖为例，其反应如下：

三、实验器材

1、吸管0.5ml(K3)、5.0ml(K1)。

2、试管1.5cmK15cm（K3）。

3、水浴锅。

四、实验试剂

O):V(HCl)=2:1],临用

1、塞氏试剂：溶50mg间苯二酚于100ml盐酸中[V(H

2

时配制。

2、1%果糖溶液：称取果糖1g，溶于蒸馏水并定容至100ml。

3、1%葡萄糖溶液：见实验1.1。

4、1%蔗糖溶液：见实验1.1。

五、操作

于3支试管中分别加入1%葡萄糖溶液、1%蔗糖溶液和1%果糖溶液各0.5ml。各加塞氏试剂2.5ml，摇匀。同时至沸水浴内。比较各管颜色变化及红色出现的先后次序。

六、注意事项

1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水锅内。

2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。

思考题

1、在塞氏实验中，反应产生的沉淀为何能够溶于乙醇溶液并产生鲜红色？

2、蔗糖为何有塞氏反应？

实验1.3杜氏实验

一、目的

掌握杜氏（Tollen）实验鉴定戊糖的原理和方法。

二、原理

戊糖在浓硫酸溶液中脱水生成糠醛，后者与间苯三酚结合成樱桃红色物质：本实验虽常用以鉴定戊糖，但并非戊糖的特有反应。果糖、半乳糖和糠醛等都是呈阳性反应、戊糖反应最快，通常在45s内即产生樱桃红色沉淀。

三、实验器材

1、吸管1.0ml(K3)

2、试管1.5cmK15cm(K3)

3、水浴锅

四、实验试剂

1、杜氏试剂：2%间苯三酚乙醇溶液（2g间苯三酚溶于100ml95%乙醇中）3ml，缓缓加入浓盐酸15ml及蒸馏水9ml即得，临时用配制。

2、1%阿拉伯糖溶液：称取阿拉伯糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

3、1%葡萄糖溶液，见实验1.1。

4、1%半乳糖溶液：称取半乳糖1g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

五、操作

于三支试管中加入杜氏试剂1ml，再分别加入1滴1%葡萄糖溶液、1%半乳糖溶液和1%阿拉伯糖溶液，摇匀。将试管同时加入沸水浴中，观察颜色变化，并记录颜色变化的时间。

六．注意事项

1、试管中加入各种糖后，应做好标记，并按顺序置于沸水浴锅中。

2、实验过程中，要仔细观察溶液颜色的变化情况。

思考题

1、在Tollen反应分析位置样品时，应注意些什么问题？

2、列表总结和比较本实验三种颜色反应的原理及其应用。

二、多糖的性质

多糖的实验

一、目的

1、熟悉淀粉多糖的碘实验反应原理和方法。

2、进一步了解淀粉的水解过程。

二、原理

淀粉分布于植物界，谷、果实、种子、块茎中含量丰富，工业用的淀粉主要来源于玉米、山芋、马铃薯。本实验以马铃薯为原料，利用淀粉不溶于或难溶于水的的性质来制备淀粉。

淀粉遇碘呈蓝色1，是由于碘被吸附在淀粉上，形成一复合物，此复合物不稳定，极易被醇、氢氧化钠和加热等使颜色褪去，其他多糖大多数能与碘呈特异的颜色，此类呈颜色物质也不稳定。

淀粉在酸催化下加热，逐步水解成分子较小的糖、最后水解成葡萄糖，

（C

6H

10

O

5

）（C

4

H10O5）C

17

H

22

O

11

C

4

H

12

O

4

淀粉各种糊精麦芽糖葡萄糖

淀粉完全水解后，失去与碘的作用，同时出现单糖的还原性。

三、实验器材

1、马铃薯3、布氏漏斗（K1）、抽滤瓶500ml（K1）

2、纱布、研钵（K1）4、表面皿10cm（K1）、白瓷板、皮头滴管

5、试管1.5cmK15cm(K4)8、量筒25ml（K1）

6、电炉、石棉网9、吸管1.0ml(K1)

7、烧杯50ml（K1）10、木质试管

四、实验试剂

1、稀释液：配制2%碘化钾溶液，加入适量碘，使溶液呈淡棕黄色即可。

2、0.1%淀粉：称取淀粉1g，加少量水，调匀，倾入沸水，边加边搅，并以热水稀释至1000ml，可加数滴甲苯防腐。

3、10%NaOH溶液:称取NaOH10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

4、本尼迪特试剂：见实验2.

5、20%硫酸（V/V）：量取蒸馏水78ml置烧杯中，加入浓硫酸20ml（相对密度1.84）.摇匀，冷却后贮于试剂瓶中。

6、10%碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠10g，溶于蒸馏水并稀释至100ml。

五、操作

1、马铃薯淀粉的制备

讲生马铃薯去皮，在研钵中充分研碎，加水混合，用纱布过滤，除去粗颗粒，滤液中的淀粉很快沉到底部，多次用水洗淀粉，抽滤，滤饼放在表面皿上，在空气中干燥即得。

2、淀粉与碘的反应

（1）置少量自制淀粉于白瓷板上，加1至3滴稀碘液，观察颜色变化。

（2）取试管1支，加0.1%淀粉液5ml，再加2滴稀碘液，摇匀后，观察其颜色变化。将管内液体分成3分，其中1分加热，观察颜色是否褪去。冷却后，颜色是否全部恢复。另2份分别加入乙醇或10%NaOH溶液，观察颜色变化并解释

之。

3、淀粉的水解

在一小烧杯内加入1%淀粉溶液25ml及20%硫酸1ml，放在石棉网上小火加热，微沸后每隔2min取出反应2滴置于白瓷板上做碘试验。与此同时另取反应液3滴，用10%碳酸钠溶液中和后，做本尼迪特试验（参阅试验2），记录试验结果并解释之。

六、注意事项

1、淀粉提取时可适当加热以促进淀粉聚沉，但温度不能超过50℃，否则会因溶解度增大而减少产量。

2、用水洗涤淀粉时需待淀粉沉降完全后再小心倾出上清液，亦可直接用滴管吸去上清液。

思考题

淀粉有没有还原性？如何验证？

三、植物组织中可溶性总糖的测定

一、目的

掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。

二、原理

糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟基糠醛，糠醛或羟基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在60nm处有最大吸收。在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

蒽酮法几乎可以测定所有的糖类物质，不但可以测定戊糖于己糖，而且可以测定寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素、糖原等（因为反应液中的浓硫酸可以将多糖水解成单糖而发成反应），所以用蒽酮法测出的糖含量，实际上是溶液中的总糖含量。

此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅。

三、实验器材

1、新鲜植物叶片5、水浴锅、电炉

2、吸管1.0ml（K2）、5ml（K1）、0.1ml6、电子分析天平

（K1）、0.2ml(K1)、0.5ml(K3).7、容量瓶100ml（K1）、玻璃漏斗。

3、试管1.5cmK15cm(K7)8、量筒、研钵、三角烧杯

4、紫外可见分光光度计。

四、实验试剂

1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml80%（V/V）的硫酸中，当日配制使用。

2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml）：100ml葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）

五、操作

1、制作标准曲线

取干净试管6支，按表6进行操作。

以吸光度为纵坐标，各标准溶液浓度（mg/ml）为横坐标作为图得标准曲线。

取新鲜植物叶片，洗净表面污物，用滤纸吸去表面水分。称取0.5g，剪碎、加入3ml蒸馏水，在年播种磨成匀浆，转入锥形瓶，并用12ml蒸馏水冲洗研钵2至3次，洗出液也转入锥形瓶中。用塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，冷却后过滤并定容至100ml，此为待测液，吸取待测液0.5ml于试管中，加蒸馏水0.5ml，浸于冰水浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值有标准曲线查算出样品液的糖含量。

六、计算

（总糖）=[(CKV)/m]K100%

式中（总糖）：总糖的质量分数（%）；

C:从标准曲线上查出的糖含量（mg/ml）;

V:样品稀释后的体积（ml）

m:样品的质量（mg）

七、注意事项

1、若提取物中过多色素会干扰显色，须事先除去。

2、参见实验8注意事项。

思考题

1、本实验蒽酮法用于测定植物叶片的可溶性糖，非可溶性糖可用此方法除去

吗？

2、制作标准曲线时应注意哪些问题？

三、蒽酮-硫酸比色定糖法

一、目的

掌握蒽酮比色法定糖的原理和方法。

二、原理

蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。蒽酮可以和游离得的己糖或多糖中的己糖基，戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应溶液呈蓝绿色，在620nm出有最大吸收。

蒽酮可与其他一些糖类发生反应，单显现的颜色不同，当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色，对于以上特定的糖类，反应较稳定。本法多用于测定糖原含量，亦可用于测定葡萄糖含量。

三、实验器材

1、无蛋白滤液或其他材料4、紫外可见光光度计

2、吸管1.0ml（K2）、5ml（K1）、0.1ml5、水浴锅

（K1）、0.2ml(K1)、0.5ml(K3).6、电炉

3、试管1.5cmK15cm(K7)7、电子分析天平。

四、实验试剂

1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000ml体积分数为80%(V/V)的硫酸中，当日配制使用。

2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml），100mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000ml （可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。

3、标准唐宇溶液（0.1mg/ml）:100mg糖原溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作为防腐剂）。

五、操作

1、创作标准曲线

取干净试管6支，按表5进行操作。

3、样品含糖量测定

吸去1ml无蛋白糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出用哪个自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光光度值由标准曲线查算查出样品液的糖含量。

四、计算

=[CV/m]K100%

式中，糖的质量分数（%）

C:从标准曲线上查出的糖质量浓度（mg/ml）

V:样品稀释后的体积

m:样品的质量

五、注意事项

1、蒽酮试剂中硫酸的浓度为80%。因为蒽酮不能溶于低于80%的硫酸溶液中，测

定样品含水量不能多，试管应干燥污水，否则蒽酮会在测定液中析出而影响测定。

2、不同显色温度和时间对产物的吸光度影响较大，沸水浴时间过长，糠醛衍生

物遭破坏，颜色会消退。

3、试剂为浓硫酸，操作时要小心，注意安全。

思考题

1、蒽酮法中硫酸起什么作用？

2、有哪些糖可用蒽酮法测定？

六、脂肪酸价的测定

一、目的

了解脂肪酸价测定的原理和方法。

二、原理

天然优质长期暴露在空气中会发生臭味，这种现象称为酸败，酸败是由于油脂水解释放出的脂肪酸，在空气中被氧化成醛或酮，从而有一定的臭味，酸败的程度用酸价来表示，酸价是中和的1g油脂的游离脂肪酸所需KOH的毫克数。油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量。反应时如下：

O

RCOOH+KOHRCOOK+H

2

三、实验器材

1、油脂（猪油、豆油等均可）4、三角烧杯（锥形瓶）100ml（K3）

2、电子分析天平5、量筒50ml（K1）

3、碱式滴定管25ml（K1）6、水浴锅。

四、试剂

1、0.100mol/LKOH标准溶液。

2、1%酚酞指示剂：用70%至90%乙醇配制。

3、中性醇醚混合液：取95%乙醇（C.P.）和乙醚（C.P.）按1:1等体积混合；或苯醇混合液：取苯(C.P.)和95%乙醇（C.P.）等体积混合；上述混合液加入酚酞指示剂数滴，用0.100mol/L，KOH溶液中和至红色。

五、操作

准确称量油脂1至2.000g于100ml三角烧瓶中，加入醇醚混合液150ml，振荡溶解（固体脂肪需水浴溶化再加入混合溶液）或40℃水浴中溶化至透明，溶液由红色变为无色，继续用0.100mol/LKOH标准液滴定至淡红色，1min不褪色为终点，记录KOH的用量V(ml)。

六、计算

脂肪的酸价=[(cVK56.1)]/m

式中c：标准KOH物质的量浓度（mol/L）

V:样品消耗KOH的体积（ml）

56.1：每摩尔KOH的质量（g/mol）

m:样品质量（g）

七、注意事项

去油脂的量尽量根据样品大致酸价取样，或者先做预实验，在做正式试验。

思考题

1、实验中能否用相同浓度的NaOH替代KOH作为滴定用碱。

2、造成食品酸价升高的因素有哪些？有何办法可防止油脂的水解、氧化和酸

败？

六、卵磷脂的提取与鉴定

一、目的

了解用乙醇作为溶剂提取卵磷脂的原理和方法。

二、原理

软磷脂在脑、神经组织、肝、肾上腺和红细胞中含量较多，蛋黄中含量特别多。卵磷脂易溶于醇、乙醚等脂溶剂，可利用这些脂溶剂提取。

新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈现黄褐色，卵磷脂中的胆碱基在碱性溶液中可分解成三甲胺，三甲胺有特异的鱼腥臭味，可鉴别。

三、实验器材

1、鸡蛋黄。5、试管1.5cm×18cm（×1）。

2、烧杯50ml（×1）。6、吸管2ml（×1）。

3、量筒50ml（×1）。7、电子天平。

4、蒸发皿（×1）。

四、实验器材

1、95%乙醇（C.P.）。

2、10%氢氧化钠溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml。

五、操作

1、提取

于小烧杯内置蛋黄约2g，加入热95%乙醇15ml，边加边搅，冷却，过滤，将滤液置于蒸发皿内，蒸汽浴上蒸干，残留物即为卵磷脂。

2、鉴定

取卵磷脂少许，置于试管内，加10%NaOH溶液约2ml，水浴加热，看是否

产生鱼腥味。

六、注意事项

卵磷脂粗品因被氧化或色素的存在而颜色较深，可用丙酮进一步提纯。

思考题

1、卵磷脂提取过程中，加入热95%的乙醇的作用是什么？

2、卵磷脂的生物学功能有哪些？

七、血清胆固醇的定量测定（硫酸铁法）

一、目的

学习胆固醇测定的一种方法，学会制备无蛋白血清液。

二、原理

血清经无水乙醇处理，蛋白质被沉淀，胆固醇及其酯则溶在无水乙醇中。在乙醇提取液中加磷酸铁试剂（即浓硫酸和三价铁溶液），胆固醇及其酯与试剂形

成比较稳定的紫红色化合物，呈色程度与及其酯含量成正比，可用比色法（560nm）定量测定。

胆固醇的结构如下：

三、实验器材

1、人血清。4、离心管0.6cm×4cm（×2）。

2、紫外光可见分光光度计。5、试管1.5cm×15cm（×3）。

3、离心机（4000r/min）。6、吸管0.1ml（×1）、1ml（×3）、5ml（×1）。

四、实验试剂

1、10%三氯化铁溶液：10gFeCl3·6H2O（A.R.）溶于磷酸（A.R.），定容至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏，可用一年。

2、硫酸铁试剂（P·S·Fe试剂）：取10%FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色瓶内，加浓硫酸（A.R.）至刻度。

3、胆固醇标准贮液：准确称取胆固醇（C.P.）80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml。

4、胆固醇标准溶液：将贮液用无水乙醇准确稀释10倍即得，此标准溶液含0.08mg/ml胆固醇。

5、无水乙醇。

五、操作

1、胆固醇的提取

吸取血清0.1ml置于干燥离心管内，先加无水乙醇0.4ml，摇匀后再加无水乙醇0.2ml，摇匀，10min后离心（3000r/min）5min，取上清液备用。

2、比色测定

取干燥试管3支，编号，分别加入无水乙醇1.0ml（空白管）、胆固醇标准溶液1.0ml（标准管）、上述乙醇提取1.0ml（样品管），各管皆加入硫酸铁试剂1.0ml，摇匀，10min后，分别转移至比色杯内，用紫外可见分光光度计在560nm处比色。

六、计算

m=÷0.04×100

式中m：100ml血清中胆固醇的质量（mg）；

A1：样品液的吸光度；

A0：标准液的吸光度；

C0：标准液中胆固醇浓度，即0.08mg/ml；

0.04：1ml血清胆固醇乙醇提取液相当于0.04ml的血清；

100：100ml血清。

100ml人血清中胆固醇的质量正常值为110~220mg。

七、注意事项

硫酸铁实际中含磷酸、硫酸，还有三氯化铁，称量三氯化铁时，注意防潮，要快速称量，因其氧化性，称量后注意清洁残留物。不要用称量纸类，要用烧杯称量，再缓慢加入磷酸。用时，小心加入硫酸即成；配置好的磷酸铁试剂，放入通风橱内，用时小心，防止腐蚀。

思考题

测定血清中胆固醇的含量，有何临床意义？胆固醇对人的作用有哪些？如何控制膳食中的胆固醇？

八．维生素C的定量测定——磷钼酸法

一、目的

1、了解维生素C的测定方法。

2、加深理解维生素C的理化性质。

二、原理

钼酸铵在一定条件下（有硫酸和偏磷酸根离子存在）与维生素C反应生成蓝色结合物，在一定浓度范围内（样品控制浓度在25至250μg/ml）吸光度与浓度成直线关系，在偏磷酸存在下，样品所存在的还原糖及常见的还原性物质均无干扰，因而专一性好，且反应迅速。

MoOI-+维生素CMo(MoO4)3+维生素C

三、实验器材

1、松针、绿色蔬菜、橘子、广柑等富含维生素C的生物材料。

2、紫外可见光光度计

3、水浴锅

4、离心机4000r/min7、试管1.5cmK15cm（K10）

5、组织捣碎机8、试管架

6、吸管0.10ml(K2),0.20ml(K2)9、吸管架

四、实验试剂

1、5%钼酸铵：5g钼酸铵加蒸馏水定容至100ml。

2、草酸（0.05mol/L）-EDTA(0.2mmol/L)溶液：称取H

2C

2

O

4

-2H

2

O6.3g和

EDTA-Na

2`2H

2

O0.0744g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml。

3、硫酸（1:19）：称取19份体积蒸馏水加入1份体积硫酸。

4、冰乙酸（1:5）：称取5份体积水加入1份体积冰乙酸即成。

5、偏磷酸-乙酸溶液：取粉碎好的偏磷酸3g，加入48ml（1:5）冰乙酸，溶解后加蒸馏水稀释至100ml；必要时过滤；此试剂放冰箱中可保存3天。

6、标准维生素C溶液（0.25mg/ml）:准确称取维生素C25mg，用蒸馏水溶液，加适量草酸-EDTA溶液，然后用蒸馏水稀释至100ml，放冰箱贮存，可用一周。

五、操作

1、制作标注曲线

取试管9支，按表52进行操作。

30℃水浴15min后，测定，以吸光度值为纵坐标，维生素质量（μg）为横坐标作图。

3、样品测定

将所用生物材料如青菜、松针，洗净擦干，真确称量5.000至10.000g，加入草酸-EDTA溶液至50ml，组织捣碎机中匀浆2min，取上清液离心（4000r/min）5min(也可准确称量5.000g，加入研钵内，加入少许草酸-EDTA溶液，捣碎，如此反复三次，最后一并倒入100ml容量瓶内，然后用草酸-EDTA溶液定容至100ml，取上清，离心。)，取上清液0.5ml，加蒸馏水0.5ml，其余按做标准曲线第三步（即加草酸-EDTA）做起，根据吸光度值查标准曲线。