PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

实验原理:

多聚酶链式反应（PCR 扩增DNA 片段及

琼脂糖凝胶电泳产物检测

一、实验目的:

1、 了解PCR 技术的基本操作

2、 理解PCR 的原理

3、 讨论PCR 的应用

PCF 是 一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增

DNA 片段的技术，这一技术需要模板、

四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行

DNA 的解旋和聚

1、PCR 反应组分

条件

参与的组分

在DNA M 制中 的作

用

实验条件/材 料

模板

DNA 的两条单链

提供复制的模

板

模板DNA

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA 子链 的

原料

dNTP mixture 酶 DNA 聚合酶 催化合成DNA 子

链

Taq DNA 聚合 酶

酶

解旋酶 打开DNA 双链 温度控制

引物

一小段单链DNA 或

RNA

为DNA 聚合酶提供 合成的3 '端起点

引物I 引物II

此外，试验中用到的还有 Mgcl2， Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为 Taq

酶提供合适的PH 条件。

2、PCR 反应条件

PCR 利用了 DNA 的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合， 现在使用的PCR

仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

PCR —般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤——变性、复性和延伸。

(!)变性(模板DNA解旋)

模板DNA经加热至90 C以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便

于它与引物结合，为下轮反应作准备。

(2) 复性(退火)

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50C左右，引物与模板 DNA单链的互补序列

配对结合。

(3) 延伸

DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板, 按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

3、PCR产物的检测

(1) 紫外分光光度计

DNA在 260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出 DNA的含量。

(2) 琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与 DNA片段的长度成负

相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA在有DNAmarker (不同已知碱基

对大小的DNA片段的混合物)的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的 DNA片段与已知的

条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker继续电泳。核酸荧光染料可以与 DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特