人CHG_5胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析
文章编号:100025404(2003)0420287204论著人CHG25胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析
徐承平,卞修武 (第三军医大学附属西南医院病理学研究所,重庆400038)
提 要:目的 建立人脑胶质瘤裸鼠脑内原位移植动物模型并探讨其生物学特性。方法 采用瘤细胞悬液接种法,将人脑CHG25胶质瘤细胞接种于裸鼠大脑实质内。分别于接种后8、14、19、24和30d处死动物并行病理检查、胶质纤维酸性蛋白免疫组化、染色体核型分析及透射电镜检查。结果 肿瘤移植成瘤率为100%,肿瘤生长稳定,肿瘤病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型。结论 本移植瘤模型能作为研究胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。接种后14d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。
关键词:胶质瘤;动物模型;原位移植;裸鼠
中图法分类号:R2332;R732352;R730.264 文献标识码:A
Establishment of orthotopic implantation model of human CHG25glioma cell line in nude mice and analysis of its biological features
X U Cheng2ping,BI AN X iu2wu(Institute of Pathology,S outhwest H ospital,Third Military Medical University,Chongqing400038,China)
Abstract:Objective T o establish an orthotopic im plantation m odel of human glioma in nude mice and investi2 gate its biological features.Methods The human CHG25glioma cells were inoculated into brains of nude mice.The animals were sacrificed at day8,14,19,24and30after inoculation.The tum ors were examined with light micro2 scope,electron microscope,kary otype analysis and immunohistochemical stain for glial fibrillary acidic protein.Re2 sults G liomas were formed in100%in nude mice,and the growth of tum ors was stable.The tum ors showed the m orphological of human glioma with the immunophenotype.Conclusion The glioma m odel in nude mice is
a reliable animal m odel for the study of the tum origenesis and biological characteristics and therapy.The14th day af2
ter inoculation might be suitable for experimental study.
K ey w ords:glioma;animal m odel;orthotopic im plantation;nude mice
恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一,其侵袭性强、发病率高、位置特殊、预后差,严重威胁着人类健康。建立一个可靠的胶质瘤异种移植瘤模型,是研究胶质瘤生物学特性和各种体内实验研究的基础。近年研究表明,肿瘤的原位移植(Orthotopic im2 plantation)动物模型是目前最为理想而可靠的肿瘤模型[1],但在脑部进行胶质瘤的原位移植瘤实验难度较大。为此,我们采用本室已建立的人脑恶性胶质瘤细胞系CHG25细胞接种于免疫缺陷动物裸鼠脑内,建立了一种人脑胶质瘤原位移植动物模型。
1 材料与方法
111 胶质瘤细胞来源及培养
人脑间变性星形细胞瘤细胞系CHG25由本室建立[2],按本
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970268)
作者简介:徐承平(1972-),男,重庆市涪陵人,硕士研究生,医师,主要从事肿瘤诱导分化治疗和血管生成方面的研究。电话:(023)68752246 通信作者:卞修武,E2mail:bianxiu wu@https://www.360docs.net/doc/d27352551.html,
收稿日期:2002203212;修回日期:2002208209室常规方法培养,即用含10%小牛血清(河南郑州产品)的RP2 MI1640(Hyclone公司)完全培养基,另添加适量HEPES、双抗(100UΠml青霉素及100μgΠml链霉素)、3%谷氨酰胺,置37℃、5%C O2混合气体孵箱中培养,细胞换液时间为1～2d,每3～5d传代1次,传代前用0125%胰酶消化。
112 瘤细胞悬液的制备
取对数生长期的单层培养CHG25细胞以0125%胰酶消化,收集细胞,离心去上清,用无菌生理盐水离心洗涤2次,将细胞悬浮于生理盐水中,台盼蓝染色细胞活力测定大于90%,并进行细胞记数,调整细胞浓度为2×106Πml,置于冰上备用。接种细胞量1×104Π只。
113 实验动物和接种方法
使用本校实验动物中心引进的近交系雌性BA LBΠc nuΠnu 无胸腺裸小鼠14只,体重15～20g。鼠龄5～7周,饲养于SPF 级无菌净化室内。接种部位为裸鼠右侧大脑尾状核。整个接种过程在层流超净台中进行。裸鼠经1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,俯卧位固定头颅,75%酒精消毒头顶部皮肤后,接种部位的确定参照文献[3]并作适当修改,即在裸鼠额部距颅中线右侧215mm,冠状缝前1mm处先用直径为1mm的牙科钻小心钻穿颅骨,然后用吸有5μl瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑实质中,进针深度为针尖距颅骨表面315mm,注射前
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将针稍微退回约015～1mm ,将瘤细胞悬液缓慢注入,除针前停
留2min ,然后缓慢拔针。术后无须抗感染。
114 移植瘤生长的观察和测量
定期观察裸鼠的精神、饮食、排便、体重和活动等情况,并分别在接种后8d (2只),14d (3只),19d (3只),24d (4只),30d (2只)用1%戊巴比妥钠腹腔麻醉并行4%多聚甲醛心内灌注后进行病理解剖,检察肿瘤形成的部位和大小等情况,方法为取出脑组织后沿接种点作冠状切面,测量移植瘤的最长径和
与之垂直的最宽径,依据计算公式:V (体积)=L ×W 2
Π2(L 为肿瘤最长径,W 为与L 相垂直的最宽径)求得移植瘤的体积。
115 病理形态学及免疫组化检查方法
留取瘤组织、肝脏、肺脏、肾脏置4%多聚甲醛固定并作
HE 染色和免疫组化标记。试剂为迈新公司的胶质纤维酸性蛋白(G lial fibrillary acidic protein ,G FAP )单抗和UltraSensiveT M S 2P K it 以及DAB 显色试剂盒。同时对CHG 25胶质瘤细胞和移植瘤组织进行染色,操作步骤按试剂盒说明书进行。取1只23d 的移植瘤组织按电镜要求取材、固定、制片,本校中心实验室PHI LIPS TEC NAI 10透射电镜观察。
116 染色体G 显带分析
取原位移植瘤组织进行原代培养72h 后加入秋水仙素(终浓度0108μg Πml )继续培养5h ,收集细胞,离心,去上清,逐滴加入01075m ol ΠL K Cl 溶液,37℃水浴30min ,加入甲醇∶冰醋酸(3∶1)室温固定30min ,滴片,干燥,01025%胰酶消化10min ,G i 2emsa 染色,油镜下观察计数、拍照。
2 结果
211 CHG 25细胞形态及G FAP 免疫组化特点
体外传代培养的CHG 25细胞在倒置显微镜下呈圆形、星形和梭形,以梭形和星形为主,一般有2～3个突起,胞浆中等,核圆或椭圆。免疫组化染色见瘤细胞胞浆呈G F AP 阳性表达,见图1。
图1 CHG 25细胞胞浆呈GFAP 阳性染色 (S 2P ×200)
Fig 1 Positive staining for GFAP protein in the cytoplasm of
CHG 25cells (S 2P ×200)
212 移植瘤形成与动物生存情况
本实验14只裸鼠在接种后全部存活,穿刺点无出血感染,
也未出现手术损伤神经的症状。裸鼠在接种后8d 肉眼未见瘤结节,自14d 起可见明显瘤结节形成并迅速进入快速生长期,在23d 后大多数裸鼠开始出现体重明显下降,消瘦,面容不洁,
活动减少,并很快发展为恶病质,同时伴有弓背、偏瘫、激惹等神经受损症状。生存最长的2只在28d 后也开始出现了上述同样的症状。测得接种后14,19,24,30d 移植瘤的平均体积分
别为0141,5150,14130,32115mm 3
。除1只穿刺点头皮下有一粟粒大瘤结节形成外,所有裸鼠的颅内接种点、肝、肾、肺等主要脏器均未见明显的肿瘤病灶。
213 移植瘤组织学检查
所有裸鼠脑内均见瘤组织形成,移植瘤组织位于右大脑实质内,早期常围绕小血管呈局灶性浸润性生长,排列呈束状、小团块状,随着接种时间的增加,瘤细胞团逐渐连接成片,
间质血管逐渐增加。瘤细胞胞浆中等,嗜酸性;核大小不一,深染,呈卵圆形、梭形,核分裂像少见,见图2。瘤组织内未见明显出血、坏死,瘤周组织轻度水肿,未见包膜形成。
图2 移植瘤细胞核呈梭性,圆形,核大深染,瘤组织内可见较
多微血管 (HE ×400)
Fig 2 G rafted tumor cells show spindle or round sh apes w ith large
and d
arkly stained neuclei.Microvessels can easily be identi 2fied in the xenograft (HE ×400)
214 免疫组化观察
免疫组化见移植瘤细胞胞浆内G FAP 蛋白表达呈散在弱阳性,见图3。
图3 免疫组化染色显示移植瘤细胞GFAP 蛋白弱阳性
表达 (S 2P ×200)
Fig 3 Weak expression of GFAP protein in grafted tumors by
immunohistochemical staining (S 2P ×200)
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215 电镜观察
移植瘤细胞为胶质源性,胞浆突起内中间丝较正常减少,但仍可见明确的中间丝,见图4。瘤细胞核浆比例明显增大,核不规则,呈梭形,卵圆形,可见明显核膜凹陷、核沟形成,以常染色质为主,部分可见染色质边集。胞浆内可见较多线粒体,内质网,其余细胞器较少。瘤组织内血管丰富
。
图4 移植瘤细胞突起内可见中间丝,核不规则 (TE M ×17000)
Fig 4 I rregular neuclei and intermediate filaments can be
seen in grafted tumors (TE M ×17000)
216 染色体G 显带分析
移植瘤染色体显示为人体肿瘤细胞染色体的特征,呈中或亚中着丝粒染色体,染色体数目50～100,超二倍体占70%,超三倍体占24%,超四倍体占6%,以短臂染色体增加为主。
3 讨论
恶性胶质瘤因其对人类身体健康的高度危害性而一直备受人们的广泛关注,但在其治疗上至今尚无明显的实质性进展。建立一个能模拟人体肿瘤微环境以及生物学特性的胶质瘤动物模型是进行各项实验研究的基础和前提条件。目前,国外已相继建立了多种人脑胶质瘤动物模型,包括异种异位(肾被膜下、皮下等)和异种原位(脑内),广泛应用于各种试验性研究。皮下移植简单方便,易于观察,并且成功率高,最为常用。原位移植技术难度高,操作复杂、费时,观察困难,在一定程度上限制了其应用,由于实验技术条件等多种原
因,人胶质瘤原位移植动物模型的国内报道甚少[4]
。近年,随着分子生物学以及各种实验技术的迅速发展,原位移植引起了众多研究者的浓厚兴趣,并且逐渐成为当前各种肿瘤动物移植研究的重点和热点之一。随着研究的深入展开,越来越多的资料表明原位移植瘤和异位移植瘤在血管生成、浸润性、转移性、瘤细胞生物活性物质的表达、瘤组织微环境渗透压等许多生物
学行为上存在明显差异[1,5]
。根据肿瘤发生的“种子2土壤”微环境学说以及许多原位移植瘤所表现出的特有生物学行为特点提示肿瘤的原位移植更能体现和模
拟人体肿瘤的各种生物学特性,在肿瘤研究中具有更加重要的作用。人脑胶质瘤因其本身位置的特殊性且具有独特的生物学行为,建立人脑胶质瘤原位异种移植动物模型,对于研究胶质瘤的各种生物学特性,尤其是在胶质瘤的各种实验性治疗(如药物、血管生成和基因治疗等)研究以及寻找、筛选有效的抗胶质瘤新药等
方面具有十分重要的意义和价值[6～9]
。
Jaw orski 等[10]
将同一胶质瘤细胞株分别接种于脑组织和腹腔内发现其移植瘤组织BEH AB (Brain en 2riched hyaluronan binding )表达具有明显差异,提示胶质瘤原位移植与异位移植具有不同的生物学行为特点。人脑恶性胶质瘤细胞系CHG 25为本室采用人脑胶质瘤手术标本建立,组织学类型为混合性少突2星形细胞瘤(WH O Ⅱ级)。本室既往采用CHG 25瘤细胞悬液接种法接种于裸鼠皮下,发现移植瘤呈结节状,无明显浸润性。为探讨CHG 25瘤细胞在脑内的成瘤情况,本实验采用CHG 25瘤细胞悬液接种法建立了人胶质瘤原位移植动物模型,结果也发现该动物模型与皮下移植模型具有明显不同的生物学特性。14只裸鼠全部
成瘤,移植成瘤率100%,与国内外报道基本一致[3,4]
。移植瘤在脑实质内呈高度浸润性生长,无包膜形成,血管丰富,瘤细胞异型性明显;免疫组化标记和电镜观察符合星形细胞来源的肿瘤;染色体显带分析为人特征性的中和亚中着丝粒染色体,证实了移植瘤的人源性而非鼠源性。本动物模型在接种后2周即可见明显的肿瘤形成,且生长明显加快,3周后动物开始出现消瘦,偏瘫、弓背等神经症状,并迅速出现恶病质而死亡,与临床具有良好的模拟性。根据本模型的生物学特性,提示接种后2周左右为利用此模型的最佳时期。同时本模型操作简单,重复性好,移植瘤生长稳定,实验周期短,有利于进行各项实验性研究。 在本实验中,我们认为建立人脑胶质瘤原位异种移植实验动物模型的关键在于准确定位接种点和严格控制接种量,同时特别注意注射和拔针的速度以及停针时间。只有保证了瘤细胞的接种位置和接种数量的一致性,才能确保移植瘤生长的一致性、稳定性和可比性。另外,实验采用的动物为免疫缺陷动物,饲养条件高,价格昂贵,因此,无菌操作观念,技术熟练程度,接种后勤观察等也是实验成功的重要保证。参考文献:
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(编辑 陈聪连)
个案与短篇 文章编号:100025404(2003)0420290201左肺粘液脂肪肉瘤1例
A case report of myxoliposarcoma of the left lung
吴 蔚,杨 康 (第三军医大学附属西南医院胸心外科,重庆400038)
原发于肺部的脂肪肉瘤(临床报道)罕见,现将收治的1例报告如下。
1 临床资料
某男,44岁,因痰中带血1周,发现左下肺包块2d于2000年5月入院。查体:浅表淋巴结未扪及肿大,肺心腹未见异常。胸部CT示左下肺前段见8.3cm×6.2cm×8.0cm密度增高块影,边界清楚,密度不均匀,内有密度增高条状影,入院后多次在CT引导下行经皮肺穿刺活检,最后一次活检抽出少量暗红色、粘稠物质,病检示“良性间叶肿瘤”,考虑诊断为左下肺间叶肿瘤。在全麻下行剖胸探查术,术中见胸腔有约200ml血性胸水,原发肿瘤位于左下肺,质中,约12cm×9.0cm×6.0cm大小,与左上肺粘连浸润不能分开,左上肺舌叶上段有3cm×3 cm包块,肺门、隆突下、肺动脉旁未见淋巴结肿大,手术予以完整切除左全肺,术后患者恢复出院,病理观察:瘤细胞呈圆形、卵圆形,星芒状,胞浆丰富,淡染,核圆形、卵圆形、梭形,大而深染,分裂像可见,瘤细胞弥漫片状排列,分布于粘液样基质中,病理诊断为“左肺粘液型脂肪肉瘤”。
2 讨论
脂肪肉瘤多发于大腿及腹膜后,肺原发性脂肪肉瘤罕见。
作者简介:吴 蔚(1975-),男,重庆市人,医师,主要从事心脏移植方面的研究。电话:(023)65387414
收稿日期:2002203206;修回日期:2002205220脂肪肉瘤起源原始间充质细胞,生长缓慢,病程可长达数年,多位于深部组织[1]。临床上主要表现为无痛性肿块,细胞穿刺活检敏感度底仅63%～80%,且有20%假阳性[2]。CT与MRI可显示肿瘤大小、部位及与邻近器官组织解剖关系,明确诊断一般靠术中切除病灶送组织学病检。根据其病理学特征可分为5型:分化良好脂肪肉瘤;粘液脂肪肉瘤;圆形细胞脂肪肉瘤;多形性脂肪肉瘤;去分化脂肪肉瘤。治疗首选手术切除,至少应切除肿瘤边缘2～3cm以上的正常组织,因其较少发生淋巴转移,故不必常规行淋巴结清扫,放疗对粘液型和分化差型者敏感,化疗单独运用效果不佳,常作为手术和放疗的辅助治疗。出现复发病变及手术切除边缘不充分等因素影响肿瘤的局部复发率,而病理分级、肿瘤深度、大小等因素与肿瘤的远处转移密切相关,本例患者手术切除病灶后2个月入院化疗即发现已有颈部及腹部多个转移病灶,故我们认为肺部脂肪肉瘤治疗应建立在早期诊断,积极手术,术后早期联合化疗放疗,以提高治疗效果。
关键词:肺;脂肪肉瘤
中图法分类号:R730.262 文献标识码:B
参考文献:
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(编辑 陈聪连)
092第25卷第4期
2003年2月
第 三 军 医 大 学 学 报
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胶质瘤细胞的培养及应用(终审稿)
胶质瘤细胞的培养及应 用 文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-
胶质瘤细胞的培养及其应用 【摘要】胶质瘤细胞及组织培养的方法日益成熟，近些年来有了一些新的改进，已经广泛应用于胶质瘤实验的多方面研究：放疗、化疗、生物治疗等方面细胞学实验以及的建立。 【关键词】胶质瘤；；应用 据统计大约9%的人类肿瘤是脑肿瘤，而脑肿瘤中90%是胶质瘤［1］。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤。在成人致命原发脑肿瘤中，高级别恶性胶质瘤最常见，确诊后中位生存期为9~12个月［2］，而且这些患者是经过积极治疗的，包括外科切除、放疗、化疗等。这些治疗的失败部分归咎于胶质瘤细胞侵袭性生长以及与周围正常脑组织交错，因而外科手术难以完全切除［3］；同时由于其异常的生物学特性，对放、化疗的抗拒，导致术后放、化疗失败；而且经常以同级别或高级别复发［4］。因此需要开辟新的治疗方法如生物治疗以及开发新的治疗药物，这些新的治疗方法及新药研制都需要以为依据。目前关于胶质瘤的常用研究方法有临床实验和基础实验。其中常用的基础实验有细胞实验以及动物实验。细胞学实验是基础，是利用培养的细胞进行实验，从细胞水平、分子水平揭示胶质瘤的细胞特性。它具有许多优点：可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动［5］；研究的条件可以人为控制；研究的样本比较均一；研究的内容便于观察、检测和记录；可以用于许多领域的研究；相对而言比较经济。 1 胶质瘤的历史
1925年，Fish培养人恶性胶质瘤细胞获得成功，开创了体外研究胶质瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1个人胶质瘤细胞株TC178，使体外长期连续动态观察胶质瘤细胞成为可能。 20世纪70年代以来，随着基础培养技术的迅猛发展，胶质瘤细胞的体外培养和克隆技术日趋成熟。近年来更是探索出许多新的培养方法，并应用于各项研究。目前胶质瘤的细胞培养技术比较成熟，已经建立了许多胶质瘤品系，如国内的人脑恶性胶质瘤体外SHG-44，是1980年取材于额叶的组织块经胰酶消化，单层静止培养而成的；细胞形态有星形、梭形；流式细胞光度仪测定，此细胞以四倍体为主，G1期占54.57%、S期占 15.17%、G2/M期占30.25%；免疫组化提示本细胞中存在S-100和GFAP；存于苏州大学附属第一医院神经外科细胞实验室。已经明确的胶质瘤细胞系（株）有许多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、 TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后还会不断建立新的品系。 2 目前常用培养方法及应用 现有的胶质瘤形式主要有：单层细胞培养、三维/立体培养及联合培养等。 2.1 单层及应用 传统意义上的单层细胞培养可以分为原代培养以及传代培养两类。前者是从供体获得组织后的初次培养，后者一般为利用现有的细胞系
裸鼠胶质瘤模型
（1）丁香园总结： 瘤子长不出无非两方面原因，老鼠或者细胞。关于裸鼠，楼上已有描述，接种部位和接种年龄。一般来说，左侧前肢靠近心脏，血供会比较丰富，容易生长新血管。 虽然文献都报道在腋窝注射，但如果局部皮下组织致密，会相对容易形成浓聚的小包块，容易达到有效的细胞浓度。裸鼠周龄不要小于四周，否则动物可能不能耐受，过 早死亡，也不可大于六周，否则免疫力会增强，不容易形成肿瘤。如果以上都不能成瘤，实验室之前又没有固定protocol，动物可以尝试NOD/SCID。细胞数量每个细胞株不同而有不同剂量，恶性程度高，有些胶质瘤，4次方就已经足够了，有些难长的， 恐怕7次方都嫌不够。但一般达到2×10的7次方就不能再往上加，因为细胞悬液已 经达到饱和状态，再往上增加细胞可能在注射时针管会对细胞有物理损伤。细胞悬液 大概是一个注射点150微升左右。另外，还可以添加matrigel，理论上可以促进成瘤。 裸鼠种植瘤需注意： 1、肿瘤细胞的状态 2、细胞的数量:每只注射 2X106-107 3、裸鼠的选择：5-8周龄 4、种植部位：血供丰富区域，如腋窝中后部、腹股沟中上部。 （2）具体操作解析： 1、能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞系能否成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问题，但最高不要超过 1*107 2、接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1 小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错 的 3、成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也 不大好摸出来。
人胃癌裸鼠移植瘤模型的建立
人胃腺癌裸鼠移植瘤模型的建立 动物：／c(／)裸小鼠，鼠龄6～1 0周，体重l5～25 g，雄性。饲养在无特殊致病菌、空气洁净的净化工作台内，室内恒温、恒湿，定期消毒。笼具、垫料、饲料和饮水均经高压蒸气灭菌，并在无菌条件下适时更换。 方法：收集培养的823细胞(癌细胞在含10% 小牛血清的1640 培养液中，于2恒温孵育箱中培养，常规传代。)在细胞培养至对数期时，用1640制成约2×l07个／细胞悬液，取0．2(4x106个823细胞/只)注入裸小鼠颈部皮下或者背部皮下，每组接种3只鼠，当皮下移植瘤长至直径为l 3左右时取出移肿瘤（大约在10d左右），及时放入含无血清培养液的平皿中，A再在超净工作台内修剪肿瘤组织，去除脂肪，结缔组织及坏死肿瘤组织，并用无血清培养液洗涤2次，将瘤组织切成约l ×l ×2的小块，加入适量的备用。 以戊巴比妥经腹腔注射麻醉裸鼠，常规消毒背部肩胛区，（切开局部皮肤）用无菌套管针抽吸准备好的23大小瘤块，将其接种于裸鼠背部肩胛区皮下，建立祼鼠皮下移植的人体胃癌祼鼠模型。作鼠间传代(2只／代)。 移植瘤生长特性：胃癌细胞接种后的第三天即可见到裸鼠接种处皮下出现结节，直径约1．5，质地较硬，在以后的几天中，上述皮下结节没有继续增大，此阶段为肿瘤细胞生长的潜伏期(7-10d左右)。随后，裸鼠皮下的肿瘤结节开始缓慢生长．体积逐渐增大。大概(25-30d)传代后荷瘤鼠皮下移植瘤的生长情况与初代移植瘤相近。 A具体操作： 1一般要求 需在无菌条件下进行。可在接种罩、超净工作台或无菌室内操作。动物处死后，用新吉尔灭(1∶1000)或碘酊、酒精消毒，对每个实体瘤应分别用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的空针抽吸。瘤块污染常是接种失败的主要原因，应予注意在高温季节操作时，应注意降温，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块。 常用腋下部位皮下作为实体瘤接种部位；肌肉接种则用大腿肌肉；腹水型接种于腹腔。2瘤块的制备 接种用的瘤块应选择接种后7－10d、肿瘤生长旺盛且无溃破而动物健康较好的瘤源动物，颈椎脱臼，固定于蜡板上，用碘酊及酒精消毒操作部位皮肤(消毒面应尽可能大一些)。切开皮肤、选择生长良好无坏死或液化的瘤组织。在无菌平皿内，剪成2－33的小块。平皿内放置少许消毒的生理盐水缓冲液或其它营养液，以保存瘤块。平皿应放置在冰块上。用无菌套管针抽吸或向套管针内塞进一小瘤块，接种于同种受体动物右前肢腋窝皮下(接种部位皮肤应先用碘酊、酒精消毒)。接种操作时间应尽可能的缩短，从一个瘤块所取的材料一般应在30内接种完。 3瘤细胞悬液的制备 如每次需要接种的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种。具体方法为，在无菌操作下取瘤块，除去坏死组织，将数个瘤块混合，剪成小块，用玻璃组织匀浆器研磨，磨匀后放入无菌容器内，加生理盐水适量稀释成1∶3－1∶4的瘤细胞悬液。容器置冰块上，用空针抽吸，每次抽吸前应将细胞混匀。每个动物接种0.2。整个操作应在30内完成。 停止给予受试物之次日(或停止给予受试物后1－5d)处死动物，先称体重，后解剖皮下瘤块，称重。如对照组小白鼠肿瘤平均重量小于1g或20%鼠的瘤重小于400，大白鼠肿瘤平均重量小于2g，表示肿瘤生长不良。在试验期间给受试物组鼠死亡超过20%，或平均体重(去瘤后)下降(自身对照)超过15%者，表示受试物的毒性反应。应当减少剂量重新试验。
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用
人肝癌组织裸鼠移植瘤模型建立及其应用 王全凯1，杨全会2，郭静2，谢广云1，崔涛1，许荣焜2，许建宁1* 1. 中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所，北京 100050 2. 中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005 摘要：目的建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物制剂疗效的观察。方法将人原发肝癌手术新鲜组织移植于BALB/c裸鼠皮下，建立人肝癌组织裸鼠移植瘤动物模型；于同体移植后第15 天连续ig给予长科制剂（CKBM），通过观察动物日常状况、接种部位出现肿块时间，测定瘤体体积和质量、抑瘤率以及进行组织病理学观察，初步评价CKBM的抗肿瘤疗效。结果人肝癌组织裸鼠移植瘤保持了人肝癌组织特性，并能通过同体移植传代；观察发现CKBM对人肝癌荷瘤裸鼠的抑瘤率达45.71%，对癌细胞生长有一定的抑制作用。结论在成功建立人肝癌组织裸鼠移植瘤模型基础上，观察发现CKBM具有一定的抗肿瘤疗效。 关键词：肝癌；裸鼠；移植瘤；动物模型；抑瘤率 中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)03 - 0398 - 05 DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.03.018 Establishment and application of implantation model of human hepatocellular carcinoma in nude mice WANG Quan-kai1, YANG Quan-hui2, GUO Jing2, XIE Guang-yun1, CUI Tao1, XU Rong-kun2, XU Jian-ning1 1. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China 2. Institute of Basic Medical Sciences Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100005, China Abstract:Objective The human hepatocellular carcinoma model was established by implantation in BALB/c nude mice. Its characteristics were certified in the model which was used for the observation of antitumor efficacy. Methods Human hepatocellular carcinoma were sc implanted to BALB/c nude mice for the establishment of the implantation model of the human hepatocellular carcinoma in BALB/c nude mice. The nude mice were exposed to the pharmaceuticals from CK Life Sciences Limited by ig on day 15 after the implantation to find out its healing efficacy through the animal reflecting, the occurring time, volume, weight of tumors, the rate of tumor inhibited, and pathological histology. Results The characteristics of human hepatocellular carcinoma could be kept with passaging by autograft. The tumor inhibiting rate of the pharmaceuticals was 45.71%, showing the certain inhibitory effect on growth of tumor cells. Conclusion A certain antitumor efficacy of the pharmaceuticals made by CK Life Sciences Limited is found out on the basis on the human hepatocellular carcinoma model in nude mice established successfully. Key words: hepatocellular carcinoma; nude mice; implanted tumor; animal model; tumor inhibitory rate 人类肝癌的基础和临床实验研究多数都借助于实验动物模型。目前，以人肝癌组织移植裸鼠建立的动物移植瘤模型是最接近人类肝癌的整体实验模型，是肝癌基础和临床实验研究理想的动物模型。人肝癌组织裸鼠移植瘤模型是指把人肝癌组织块接种于裸鼠皮下建立的实验动物模型，常用于筛选抗肿瘤药物和制剂、实验性治疗和抗肿瘤机制研究[1]。基于为肝癌实验和临床研究以及药物筛选提供体内实验系统的目的，本研究建立了人肝癌组织裸鼠移植瘤模型，对其特性进行鉴定，并应用于抗肿瘤药物长科制剂（CKBM）疗效的观察。 1材料与方法 1.1实验动物 BALB/c（nu/nu）裸小鼠（由北京维通利华实验动物技术有限公司提供）。饲养于中国医学科学院基础医学研究所/中国协和医科大学基础医学部 收稿日期：2013-06-03 作者简介：王全凯（1977—），男，北京人，主管技师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132199 E-mail: kylewang@https://www.360docs.net/doc/d27352551.html, *通信作者许建宁，硕士生导师，研究方向为毒理学。Tel: (010)83132592 E-mail: jnx999@https://www.360docs.net/doc/d27352551.html,
星形胶质细胞瘤病理变化介绍
星形胶质细胞瘤病理变化介绍 星形胶质细胞瘤是常见的胶质瘤，尤其好发于30到40岁的年龄阶段，所以对它的病理特征必须注重了解，可以用右眼观察了解是否有结节或者具它的状况，或者是在光镜下检查。 1，肉眼观察：肿瘤大小可为数厘米大的结节至巨大肿块不等，一般境界不清，在肿瘤组织出现坏死出血时，似与周边组织境界分明，但边界外仍有瘤组织浸润。瘤体灰白色，质地视瘤内胶质纤维多少而异，或硬、或软、或呈胶冻状外观，并可形成大小不等的囊腔。由于肿瘤的生长，占位和邻近脑组织的肿胀，脑的原有结构因受挤压而扭曲变形。 2，光镜下：肿瘤细胞形态多种多样，肿瘤细胞核的多形性，核分裂像，瘤细胞密度，血管内皮增生程度以及瘤组织坏死。
3，星形细胞瘤预后较好，按瘤细胞形态又分为纤维型、原浆型、肥胖型和混合细胞型等亚型。其中以纤维型星形细胞瘤（fibrillary astrocytome）最常见，瘤细胞分化好，但呈浸润性生长，瘤细胞之间可见红染的原纤维性背景。原浆型星形细胞瘤（protoplasmic astrocytoma）较少见，瘤细胞体积小，形态较一致，胞突少而短。肥胖细胞型星形细胞瘤（gemistocytic astrocytoma）瘤细胞体积较大，胞浆丰富，半透明，核偏位。电镜下在瘤细胞胞浆中可见成束排列的中间丝。星形细胞瘤胞浆均表达胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、S-100蛋白和波形蛋白（Vimentin）。 4，间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma）预后较差，光镜下表现为瘤细胞密度增加，核异型性明显，核深染可见核分裂像，血管内皮细胞增生等，为恶性肿瘤的征象。 5，胶质母细胞瘤（glioblastoma）又分为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform, GBM）和巨细胞型胶质母细胞
移植性肿瘤动物模型
移植性肿瘤动物模型 目前临床所使用的抗肿瘤药物，大多数是通过动物移植性肿瘤实验法筛选而被发现的，移植性肿瘤动物模型是现代肿瘤研究中应用的最广最有价值的模型。其优点包括：（1）可使一群动物被同时接种同样量的瘤细胞，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活率近100%；（2）对宿主的影响相类似，易于客观判断疗效；（3）可在同种或同品系动物中连续移植，长期保留供试验用；（4）试验周期一般较短，试验条件易于控制等。但是这类肿瘤生长速度快、增殖比高、体积倍增时间短、肿瘤生命性质简单，与人类肿瘤具有明显不同；特别是与人类的致死性实体恶性肿瘤生命性质、与生长发生机制差异更大。存在着能够为现代肿瘤基础生命科学研究模拟人类恶性肿瘤综合生命性质的局限性、片面性。现在世界上保有近500种的动物移植瘤，但常用于筛药的不到40种，多数为小鼠肿瘤，其次是大鼠和仓鼠移植瘤，包括小鼠L1210淋巴白血病，艾氏腹水瘤，Friehd病毒白血病，肉瘤180，Lewis肺癌，腺癌755，白血病615，白血病P388，Walker-256，吉田肉瘤，肉瘤45，Liol淋巴瘤，Dunning 白血病，白血病L5170Y，P1534淋巴白血病，P1798淋巴肉瘤，LPC-1浆细胞瘤，淋巴瘤8，Gardner淋巴肉瘤，B16或Cloadman黑色素瘤，Ridaway 骨肉瘤，肉瘤37，P315白血病，Ｗagner癌肉瘤，Mur hy-sturm淋巴肉瘤，Jensen肉瘤，Geurin氏癌，仓鼠十二指肠腺癌和人体肉瘤HSL第1代杂交鼠移植。它们对抗癌药作用的敏感性大致可分为敏感，中度敏感，低敏感和不敏感瘤株四类，同样敏感株对抗癌药的疗效水
裸鼠移植瘤方法建立
1.细胞准备： 1.1用PBS 清洗细胞两遍，加入胰酶消化，吹打离心，无血清培养基清洗两次， 然后用无血清培养基将细胞重悬，进行细胞计数，使得200μL 悬浮液里面含有1×107个细胞。总共需要细胞: 18（只）*200ul*1.2=4.32ml×107个，将混合好的细胞放于4°C冰盒运至动物房。 2.裸鼠准备： 2.1 3周龄小鼠饲养一周后，每只于右侧腋腹壁皮下接种MDA-MB-231和MCF-7细胞1×107/200μ L。每日观察肿瘤生长情况, 待出瘤后使用游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积=(D×d 2 )/2(D表示肿瘤的长径, d 表示肿瘤的短径)。（注射器型号BD一次性使用无菌胰岛素注射器规格：1ml 25G） 2.2 当肿瘤体积约为80 mm 3 时(100至150左右)，将裸鼠进行随机分成3 组（肿瘤大小，体重尽量接近），每组3只。对照组，TO901317组，DADS组。 每天（每天给药？会不会太频繁？可以查阅相关类似成药的半衰期或综合国外文献的数据）将实验组灌胃TO901317，剂量为25mg/kg/d，将粉末状的TO901317 溶解到蓖麻油（或芝麻油以及生理盐水）里，每只裸鼠注射含有TO901317 的蓖麻油200μL；对照组注射等体积的蓖麻油。连续注射两周。（12号灌胃针头，每次用后一定要煮沸消毒）（灌胃进针时针头偏右，一般就不会进肺了） 腹腔注射DADS，剂量为50mg/kg (含10%小牛血清的D ME M培养液（最好使用生理盐水）)每次注射200 μL , 隔日注射, 连续7次给药。 2.3每2～3d观察测量1次, 计算肿瘤相对体积(RTV)。以每组动物移植瘤体积的平均值, 绘制移植瘤生长曲线。实验结束时在超净工作台上对裸鼠进行拍照，完整剥离肿瘤，用游标卡尺对肿瘤的大小进行测量，用电子天平称量移植瘤重量，用手术剪取出肿瘤，拍照。照相结束后，用剪刀将每个肿瘤分成 3 份，一份用来提取总RNA，一份用来提取组织内总蛋白质，这两份组织放到冻存管里，冻于液氮罐中，第三份用来做免疫组化，因此，该样本须置于4%的多聚甲醛（有毒，小心配置）固定剂中进行固定。 备注： 1. 裸鼠饲养情况裸鼠有专门的SPF饲养动物房，买裸鼠前动物住的盒子、垫料、水和饲料要消毒。提前准备好，一般送裸鼠的单位会配备专门的SPF箱子，接到裸鼠后在专门裸鼠动物房进行交接。这个有个通风台也要提前消毒预备好。裸鼠到达目的饲养地后一般是饲养1-2周才开始试验，这也是国际上的通行规定。盒子要每2-3天消毒一次，根据裸鼠的排泄情况而定，所以要有替换的盒子。一般来说各个医院的动物房这些盒子比较紧缺，需要提前计算好。别到时候需要更换的时候找不到盒子。 2.动物接种数量根据你离心后细胞计数的数量。然后是用多少的液体稀释，一般是PBS。如果你培养后经 过离心收集到的细胞总数是1*108次方。也就是10*107次方/5×106个= 20个。那你可以稀释到4ml，每次给予0.2ml，正好可以接种20只裸鼠。根据肿瘤细胞的类型和你所给予的干预情况，一般接种3周瘤子可以达到0.5-1.2cm左右。 用左手揪起来一块皮，然后在揪起来的皮和身体之间那里注射，就是皮下而不是皮内了 先把针头插进去，然后挑起来，看清楚不是体内而是皮下，也没有戳穿皮肤，然后再开始注射 裸鼠的皮皱皱的，很容易揪起来一块，如果不麻醉就是用手拎着注射针头很容易戳到别的地方 放在4度30~40分钟对细胞活力影响不大。用哪种液体悬浮细胞也都行，用无血清培养基效果可能会好一点点。 应该是用PBS或HANKS液处理的,建议不要用无血清培养基或者其他培养液.里头成分复杂: 1,虽然裸鼠免疫缺陷,但是培养基成分复杂,有时还会有致敏原什么的,引起不必要的麻烦. 2,只要能够维持一定的渗透压,持续一个小时肯定是没有问题的,这点PBS或HANKS液就够了,而且影响因素少. 裸鼠对于实验环境又很敏感，特别是在给予药物处理之后。 不知道大家给药的灌胃器或注射器是否消毒？药液是否无菌过滤？ 3、操作是否严格
人CHG_5胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析
文章编号:100025404(2003)0420287204论著人CHG25胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性分析 徐承平,卞修武 (第三军医大学附属西南医院病理学研究所,重庆400038) 提 要:目的 建立人脑胶质瘤裸鼠脑内原位移植动物模型并探讨其生物学特性。方法 采用瘤细胞悬液接种法,将人脑CHG25胶质瘤细胞接种于裸鼠大脑实质内。分别于接种后8、14、19、24和30d处死动物并行病理检查、胶质纤维酸性蛋白免疫组化、染色体核型分析及透射电镜检查。结果 肿瘤移植成瘤率为100%,肿瘤生长稳定,肿瘤病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型。结论 本移植瘤模型能作为研究胶质瘤发生、生物学特性以及治疗研究的可靠动物模型。接种后14d左右是利用该模型进行实验的最佳时机。 关键词:胶质瘤;动物模型;原位移植;裸鼠 中图法分类号:R2332;R732352;R730.264 文献标识码:A Establishment of orthotopic implantation model of human CHG25glioma cell line in nude mice and analysis of its biological features X U Cheng2ping,BI AN X iu2wu(Institute of Pathology,S outhwest H ospital,Third Military Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o establish an orthotopic im plantation m odel of human glioma in nude mice and investi2 gate its biological features.Methods The human CHG25glioma cells were inoculated into brains of nude mice.The animals were sacrificed at day8,14,19,24and30after inoculation.The tum ors were examined with light micro2 scope,electron microscope,kary otype analysis and immunohistochemical stain for glial fibrillary acidic protein.Re2 sults G liomas were formed in100%in nude mice,and the growth of tum ors was stable.The tum ors showed the m orphological of human glioma with the immunophenotype.Conclusion The glioma m odel in nude mice is a reliable animal m odel for the study of the tum origenesis and biological characteristics and therapy.The14th day af2 ter inoculation might be suitable for experimental study. K ey w ords:glioma;animal m odel;orthotopic im plantation;nude mice 恶性胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤之一,其侵袭性强、发病率高、位置特殊、预后差,严重威胁着人类健康。建立一个可靠的胶质瘤异种移植瘤模型,是研究胶质瘤生物学特性和各种体内实验研究的基础。近年研究表明,肿瘤的原位移植(Orthotopic im2 plantation)动物模型是目前最为理想而可靠的肿瘤模型[1],但在脑部进行胶质瘤的原位移植瘤实验难度较大。为此,我们采用本室已建立的人脑恶性胶质瘤细胞系CHG25细胞接种于免疫缺陷动物裸鼠脑内,建立了一种人脑胶质瘤原位移植动物模型。 1 材料与方法 111 胶质瘤细胞来源及培养 人脑间变性星形细胞瘤细胞系CHG25由本室建立[2],按本 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970268) 作者简介:徐承平(1972-),男,重庆市涪陵人,硕士研究生,医师,主要从事肿瘤诱导分化治疗和血管生成方面的研究。电话:(023)68752246 通信作者:卞修武,E2mail:bianxiu wu@https://www.360docs.net/doc/d27352551.html, 收稿日期:2002203212;修回日期:2002208209室常规方法培养,即用含10%小牛血清(河南郑州产品)的RP2 MI1640(Hyclone公司)完全培养基,另添加适量HEPES、双抗(100UΠml青霉素及100μgΠml链霉素)、3%谷氨酰胺,置37℃、5%C O2混合气体孵箱中培养,细胞换液时间为1～2d,每3～5d传代1次,传代前用0125%胰酶消化。 112 瘤细胞悬液的制备 取对数生长期的单层培养CHG25细胞以0125%胰酶消化,收集细胞,离心去上清,用无菌生理盐水离心洗涤2次,将细胞悬浮于生理盐水中,台盼蓝染色细胞活力测定大于90%,并进行细胞记数,调整细胞浓度为2×106Πml,置于冰上备用。接种细胞量1×104Π只。 113 实验动物和接种方法 使用本校实验动物中心引进的近交系雌性BA LBΠc nuΠnu 无胸腺裸小鼠14只,体重15～20g。鼠龄5～7周,饲养于SPF 级无菌净化室内。接种部位为裸鼠右侧大脑尾状核。整个接种过程在层流超净台中进行。裸鼠经1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,俯卧位固定头颅,75%酒精消毒头顶部皮肤后,接种部位的确定参照文献[3]并作适当修改,即在裸鼠额部距颅中线右侧215mm,冠状缝前1mm处先用直径为1mm的牙科钻小心钻穿颅骨,然后用吸有5μl瘤细胞悬液的微量进样器经孔垂直进入脑实质中,进针深度为针尖距颅骨表面315mm,注射前 782 第25卷第4期2003年2月 第 三 军 医 大 学 学 报 ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE V ol.25,N o.4 Feb.2003
小鼠移植瘤模型动态观察
小鼠移植瘤模型动态观察 摘要：利用小鼠移植瘤模型动态观察血管生成拟态的时空变化。方法：采用B16黑色素瘤细胞和C57小鼠制作小鼠恶性黑色素移植瘤动物模型，成瘤后根据随机数字表每天随机抽取一只小鼠处死，共12d，获得肿瘤样本114例。常规HE染色和CD31、PAS染色。显微镜下分别计数肿瘤组织中央区和外周区的高倍视野（400）下血管生成拟态以及内皮依赖性血管。结果：在移植瘤形成的第1～8天，肿瘤组织内存在血管生成拟态。第9～12天该结构被内皮依赖性血管替代。肿瘤中央区、外周区血管生成拟态密度均呈现先递增后递减趋势；两个区域内的血管生成拟态密度比较：在第1～6天内肿瘤中央区高于外周区，在第7～8天肿瘤外周区高于中央区。内皮依赖性血管在肿瘤组织的中央区和外周区呈现递减趋势。两个区域内的内皮依赖性血管密度比较：在第1～7天肿瘤中央区内皮依赖性血管密度高于外周区，在第8～12d两个区域内的内皮依赖性血管密度无明显差别。血管生成拟态密度与肿瘤组织的坏死率之间呈密切负相关（r=-0.978,P<0.05）；内皮依赖性血管密度与肿瘤组织坏死率之间亦存在负相关（r=-0.230,P<0.05）。结论：黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态是肿瘤细胞为适应环境而产生的一种暂时性的血液供应方式，与内皮依赖性血管并存于肿瘤组织内。随肿瘤生长变化而与内皮依赖性血管之间存在一定的时空变化规律。 【关键词】血管生成拟态；肿瘤血管生成；恶性黑色素瘤 血管生成拟态是一种与传统的肿瘤血管生成途径完全不同的、不
依赖内皮细胞的全新的肿瘤细胞的血液供应方式。1999年由美国lowas大学的Maniotis和Folberg等提出，他们对眼葡萄膜恶性黑色素瘤微循环研究时发现恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用，模拟血管壁结构形成可输送血液的管道，从而重塑肿瘤的微循环，并且与宿主血管相连通，使肿瘤获得血液供应，命名为血管生成拟态[1～6]。 2005年10月河北北方学院学报（医学版）第5期2005年10月张凡等：小鼠黑色素瘤移植瘤中血管生成拟态的时空变化第5期血管生成拟态概念的提出丰富了肿瘤血液供应理论，但目前对它与内皮依赖性血管之间的演变规律缺乏认识，本研究在前期研究的基础上首次提出了血管生成拟态的时空变化概念：即血管生成拟态是肿瘤血液供应的一种暂时性替代模式，在肿瘤发生发展的一定时期内存在，在肿瘤的不同区域存在不同的变化趋势，并利用小鼠移植瘤模型连续观察对我们的假说进行验证。 1 材料和方法 1.1 实验动物 C57小鼠购自北京军事医学科学院动物室，6～8周龄，共20只，雌雄各半，体重25～30g，编号后天津医科大学实验动物中心洁净实验室饲养。 1.2 实验方法先将黑色素瘤细胞株B16复苏，1640细胞培养基上培养6d，使细胞排满瓶底，0.2%胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞密度达到1107/ml。75%酒精消毒小鼠鼠蹊部，每只小鼠鼠蹊部皮下注射0.2ml细胞悬液。每天观察动物生命体征及肿瘤细胞生长状况，10d
胶质瘤细胞的培养及应用
胶质瘤细胞的培养及应用 Prepared on 24 November 2020
胶质瘤细胞的培养及其应用 【摘要】胶质瘤细胞及组织培养的方法日益成熟，近些年来有了一些新的改进，已经广泛应用于胶质瘤实验的多方面研究：放疗、化疗、生物治疗等方面细胞学实验以及的建立。 【关键词】胶质瘤；；应用 据统计大约9%的人类肿瘤是脑肿瘤，而脑肿瘤中90%是胶质瘤［1］。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤。在成人致命原发脑肿瘤中，高级别恶性胶质瘤最常见，确诊后中位生存期为9~12个月［2］，而且这些患者是经过积极治疗的，包括外科切除、放疗、化疗等。这些治疗的失败部分归咎于胶质瘤细胞侵袭性生长以及与周围正常脑组织交错，因而外科手术难以完全切除［3］；同时由于其异常的生物学特性，对放、化疗的抗拒，导致术后放、化疗失败；而且经常以同级别或高级别复发［4］。因此需要开辟新的治疗方法如生物治疗以及开发新的治疗药物，这些新的治疗方法及新药研制都需要以为依据。目前关于胶质瘤的常用研究方法有临床实验和基础实验。其中常用的基础实验有细胞实验以及动物实验。细胞学实验是基础，是利用培养的细胞进行实验，从细胞水平、分子水平揭示胶质瘤的细胞特性。它具有许多优点：可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动［5］；研究的条件可以人为控制；研究的样本比较均一；研究的内容便于观察、检测和记录；可以用于许多领域的研究；相对而言比较经济。 1 胶质瘤的历史 1925年，Fish培养人恶性胶质瘤细胞获得成功，开创了体外研究胶质瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1个人胶质瘤细胞株TC178，使体外长期连续动态观察胶质瘤细胞成为可能。 20世纪70年代以来，随着基础培养技术的迅猛发展，胶质瘤细胞的体外培养和克隆技术日趋成熟。近年来更是探索出许多新的培养方法，并应用于各项研究。目前胶质瘤的细胞培养技术比较成熟，已经建立了许多胶质瘤品系，如国内的人脑恶性胶质瘤体外SHG-44，是1980年取材于额叶的组织块经胰酶消化，单层静止培养而成的；细胞形态有星形、梭形；流式细胞光度仪测定，此细胞以四倍体为主，G1期占%、S期占%、G2/M期占%；免疫组化提示本细胞中存在S-100和GFAP；存于苏州大学附属第一医院神经外科细胞实验室。已经明确的胶质瘤细胞系（株）有许多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后还会不断建立新的品系。 2 目前常用培养方法及应用 现有的胶质瘤形式主要有：单层细胞培养、三维/立体培养及联合培养等。 单层及应用传统意义上的单层细胞培养可以分为原代培养以及传代培养两类。前者是从供体获得组织后的初次培养，后者一般为利用现有的细胞系（株）。两种培养方法各有优缺点，而且都已经得到广泛的应用。目前国内研究胶质瘤的多采用细胞系，这主要是因为国内已经有许多胶质瘤细胞系，品系明确、易于培养；但连续性细胞系由于连续传代，细胞的形态、结构、功能发生了一定的变化，传代代数越多，发生的变化也越大，因
人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立
人脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植双荧光模型的建立 于宁;李张昱;高鑫;郭剑锋;陈四方;朱宏伟;叶永造;谭国伟 【期刊名称】《中华神经医学杂志》 【年(卷),期】2016(015)006 【摘要】目的建立裸鼠的人脑胶质瘤细胞原位移植双色荧光模型. 方法体外培养转染有增强型红色荧光蛋白(ERFP)的人U87细胞(ERFP-U87),制成细胞悬液后接种于表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的裸小鼠脑部右侧尾状核区域,活体成像系统上动态观察肿瘤的生长,4周后HE染色移植瘤组织切片,荧光显微镜下观察肿瘤细胞与宿主基质细胞的关系. 结果表达EGFP的裸鼠在活体成像系统下可见全身组织器官均带有绿色荧光.接种ERFP-U87细胞后1周于移植部位可见红色荧光,且随时间的增加而增强.HE染色移植瘤组织显示肿瘤细胞较正常细胞深染,核大,可见分裂相及多核;荧光显微镜下观察可见肿瘤组织与宿主基质分别呈现红、绿色荧光,肿瘤组织与鼠脑组织界限不清,可见肿瘤发生血管,正常内皮细胞形成血管,部分管壁有肿瘤细胞包绕,肿瘤组织中呈现绿色荧光. 结论双色荧光胶质瘤动物模型可作为胶质瘤基础研究的理想模型.%Objective To establish the double fluorescent animal models of orthotopic transplantation of human glioma cells into nude mice and provide dynamic observation of occurrence and development of gliomas.Methods Human U87 cells were transfected with enhanced red fluorescent protein (ERFP) and then inoculated into the right caudate nucleus of nude mice with enhanced green fluorescent protein (EGFP).Dynamic observation of tumor growth was carried out by in vivo imaging.HE staining was performed on the
如何进行小鼠肿瘤模型的建立及鉴定教程文件
如何进行小鼠肿瘤模型的建立及鉴定 实验肿瘤学的需要导致肿瘤动物模型的产生,借以研究人类肿瘤的病因、发生、发展以及治疗和预防。肿瘤动物模型可来自于动物的自发肿瘤、诱发肿瘤和移植性肿瘤。 一前两者由于对动物品系要求严格、实验周期较长或缺少实验一致性而较少使用。移植性肿瘤动物模型具有特性明确、生长一致性好、实验周期短、瘤株分布广泛、可反复复制等优点,在肿瘤研究中占有重要地位。可移植性肿瘤,是把动物或人的肿瘤移植到同系、同种或异种动物,经传代后,组织类型和生长特性已趋稳定,并能在受体动物中继续传代,又称为可移植性肿瘤细胞。二可移植性肿瘤移植于同系或同种动物,称为同种移植,是国内外最常用的肿瘤动物模型复制方法之一。同种移植的优点是,可供选择使用的细胞系或细胞株多,许多细胞系在世界范围分布广泛,并且这些细胞的生物学特性已经比较明确,一般都有明确的背景资料,使一群动物同时接种同样量的瘤细胞,生长速度一致、个体差异较小,成活率高,易于对照观察,这些都是便于科研成果相互比较和交流的有利因素 三在接种过程中，应把握注射深度，否则易造成内脏损伤。接种后三天即开始观察有无肿瘤形成。本实验具有周期短、制作方便、成功率比较高、较好重复性和稳定性的明显优势，是一种较为理想的肿瘤实验动物模型，值得推广。 肝癌肿瘤模型建立： 抗肿瘤药物及制剂的药效学评价，可通过建立小鼠荷瘤数据模型，探索肿瘤生长的本质及其发生发展的规律，探究其抗肿瘤效果。 方法：小鼠右腋下注射H22肿瘤细胞，注射部位发生癌变，小鼠肿瘤生长明显，切片结果证明实验成功，模型构建完成，使小鼠荷瘤，观察肿瘤生长，记录体重数据并建立动物模型。 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1动物及分组：取20只昆明鼠随机分成A组（10只），B组（5只），C组对照组（5只），编号饲养。 1.1.2试剂：无菌水，生理盐水，台酚蓝，2%冰醋酸，甲醛，乙醇，二甲苯，石蜡等。 1.1.3仪器：离心机，显微镜，计数板，电子称，超净工作台，温箱，切片机等。 1.2实验方法 1.2.1模型建立：取H22肿瘤细胞，3000转离心分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4%台酚蓝染色并镜检计数，制成浓 度为3*106个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。 1.2.2：细胞计数：细胞计数液2%冰醋酸溶液。 取50微升细胞悬液加入450微升的细胞计数液中计数。 1.3记录： 接种完成后,逐日观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退,用游标卡尺，每周测量肿瘤长径a和短径b ,并计算平均直径,即r = (a + b) /2，每天称量小鼠体重和肿瘤并记录，绘制曲线。 1.4制备组织切片： a处死小鼠，将肿瘤组织切成1*1*0.4cm的小块。 b将切块的组织置于螺口瓶中，加入40%甲醛固定，过夜。
恶性胶质瘤的细胞起源为少突胶质前体细胞(OPC)
著名学者骆利群最新Cell文章 时间：2011年8月11日 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 摘要：来自俄勒冈大学分子生物学研究所，斯坦福大学生物系等处的研究人员利用先进技术发现了恶性胶质瘤的细胞起源为少突胶质前体细胞(OPC)，这不仅为恶性胶质瘤的治疗和临床诊断提供了新思路，而且也证明了这一重要的技术能用于确定其它许多类型肿瘤的细胞来源。这一研究成果公布在Cell 杂志上。 生物通报道：来自俄勒冈大学分子生物学研究所，斯坦福大学生物系等处的研究人员利用先进技术发现了恶性胶质瘤的细胞起源为少突胶质前体细胞(OPC)，这不仅为恶性胶质瘤的治疗和临床诊断提供了新思路，而且也证明了这一重要的技术能用于确定其它许多类型肿瘤的细胞来源。这一研究成果公布在Cell杂志上。 这项研究由著名华裔科学家，斯坦福大学教授骆利群，及其实验室成员，现俄勒冈大学助理教授宗辉（Hui Zong，音译）领导完成，其中骆利群教授在发育神经科学作出了重要贡献，他对于突触分枝以建立和维持神经回路领域的研究处于领先水平，其杰出成就的另外一个方面是神经追踪技术，骆利群教授改进了已沿用一百多年的经典方法，将对大脑发育研究产生极大的推动，HHMI特为此发了评论，称之为遗传学的重大进展。 恶性胶质瘤治疗一直是神经外科领域一道最棘手的研究课题，其发病率约占颅内原发肿瘤的50%，每年全球约有近60万中青年人死于该疾病。比如海洋生物学家Thor Heyerdahl (2002) 与电影批评家Gene Siskel (1999)等就是因为恶性胶质瘤死亡。 在这篇文章中，研究人员首先将胶质瘤病人体内发现的两种流行突变p53与NF1导入神
细胞系来源的异体移植肿瘤模型
Doses of inoculated ?uorescent cells R a d a n c e ×105 (p /s e c /c m 2/s r ) A C B D B12-Luc 皮下接种实体瘤模型B16-Luc 肿瘤转移模型 Bright B r i g h t L u c i f e r a s e V e n t r a l D o r s a l 12d 15d 18d 12d 15d 18d The days after tumor inoculation 12 1234567246810121415 18 V e n t r a l l u c i f e r a s e a c t i v i t y (×108) D o r s a l l u c i f e r a s e a c t i v i t y (×108) R e l a t i v e l u c i f e r a s e a c t i v i t y (×108) Days after operation NS 0.04U Bleomycin 52图1.?A–B.基于人结肠癌细胞系的颅内转移瘤模型。向裸鼠颈动脉注 射不同接种量的，带有Luciferase 荧光标记的人结肠癌细胞，并选取多个时间点通过活体成像术检测Luciferase 在颅内的表达水平。C.基于 A549Luc 细胞的原位CDX 肿瘤模型。Balb/C 裸鼠提前经气管插管注射生理盐水（NS）或博来霉素（诱导肺纤维状损伤以促使外源细胞成瘤）处理，饲养两周后再经气管插管注射1×106个A549Luc 细胞，继续饲养一周后进行活体成像，检查肺部成瘤情况。D.基于荧光标记B16Luc 黑色素瘤细胞的皮下/转移瘤模型。 细胞系来源的异体移植肿瘤模型 细胞系来源的异体移植肿瘤模型(Cell●line-derived●xenograft,●CDX)是将体外培养的人源或鼠源的肿瘤细胞系移植到免疫缺陷小鼠 体内而构建的肿瘤模型，其具有建模时间短，重复性好，成本低等特点。基于细胞系的肿瘤模型作为经典的体内实验方法，在肿瘤学研究和抗肿瘤药物研发过程中有着极大的需求。 依托超过120种经过验证的具有完善遗传背景的细胞系（部分常用细胞系见表1），南模生物可根据客户的研发需要提供各类基于细胞系的肿瘤模型服务。我们可以构建各类皮下，原位或者转移瘤模型，并针对相应的模型提供高度定制化的体内药效学服务。 可提供的服务类型： ●●肿瘤细胞系的基因修饰，包括过表达，基因敲除 ●●肿瘤细胞表型分析，包括增殖，凋亡，迁移，分化等 ● ●成瘤后的表型分析，包括肿瘤生长，转移，血管形成等 Case study 1：活体成像CDX 肿瘤模型 带有Luciferase 荧光标记的肿瘤细胞系可用于构建各类皮下，原位或转移型的CDX 肿瘤模型。Luciferase 报告基因系统以荧光素 （luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（firefly●luciferase）的活性，其优点是可以在小鼠存活的情况下反复测量，分析不同时 间点的荧光变化，以此来示踪肿瘤细胞的增殖与转移。