果酒

实验四果酒酵母发酵及菌种保藏

一、实验目的和内容

1．掌握果酒酿造的原理并对筛选果酒酵母菌种进行发酵性能测定（起酵时间、产酒精度、耐受性能）。

2．用商业酵母进行小型酿酒实验，掌握果酒酿造一般工艺流程，并对自酿果酒进行感官品评和理化分析检测（糖度、酸度、酒精度）。

3．了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。

4．学习几种常用菌种保藏方法：斜面传代保藏方法、液体石蜡保藏方法、沙土管保藏方法、冷冻干燥

二、实验原理果酒发酵：果浆或果汁中的葡萄糖和果糖在酵母菌的作用下，最后生成酒精和二氧化碳。可用以下反应式来说明：

果酒发酵是一个极其复杂的生物化学现象。在每一步反应过程中都有酶的参与，除了最后生成酒精、二氧化碳和少量的甘油、高级醇类、醛类物质之外，还会生成二磷酸己糖、磷酸甘油醛、丙酮酸、乙醛等许多中间产物。

果酒的发酵分主发酵和后发酵两个阶段，主发酵是将发酵液的糖分变成酒精，后发酵是继续分解残糖为酒精，加速酒的转化，使酒更加稳定。用人工培养的酵母发酵的称为人工发酵，利用天然酵母发酵的称为自然发酵。按照工艺的不同又可分为渣汁混合发酵和渣汁分离发酵两种形式。

三、实验仪器与材料

样品：新鲜水果及压榨汁。试剂：亚硫酸钠、乙醇、无菌水、10%HCl、95%乙醇、

器皿：三角烧瓶(250 mL)、电热炉、10ml移液管、榨汁机、玻璃棒、100ml容量瓶、100ml量筒、烧杯、玻璃棒、旋转蒸发仪等。

四、实验方法与步骤

1．自选酵母发酵性性能的检测试验：用商业菌种发酵果酒

（1）果酒酿造的工艺流程

雪梨→分选、清洗→破碎→护色→压榨→巴氏杀菌→成分调整→活化酵母→发酵→过滤→陈酿→倒灌→澄清→装瓶

（2）工艺简述

选果：选用八九成熟的果实, 糖含量高，产酒率高, 总酸、挥发酸、单宁含量低,有香气产生的鲜果为原料,一般的雪梨含糖量达到9.3%,含酸量只有0.16%。

清洗：用清水反复冲洗,沥干水分后待用。鸭梨果皮和果核易发生褐变,果皮具芳香味，清洗后去除果核。

破碎护色：由于梨皮较厚，肉质坚硬，石细胞含量多，因而破碎工序是提高出汁率的重要工序，破碎果块的大小要适宜，一般为3～4毫米。为防止果实与空气接触发生氧化褐变，破碎工序要采取护色措施，可加入50～70 mg/ L SO2 + 10 mg/ L Vc 。

榨汁：由于果实中果胶含量较高，破碎后直接取汁时出汁率低，且汁液混浊，可加入0.2％的果胶酶使果胶分解，酶解温度35～45℃，处理2小时。

杀菌：为达到果酒的生物稳定, 果实榨汁后要马上添加SO2以抑菌, 或榨汁后进行巴氏杀菌, 巴氏杀菌同时还可起到抑制酶活性的作用

成分调整：（1）浓缩原汁：原梨汁本身的总糖含量低, 直接发酵酒精度偏低, 为了提高酒精度, 在原梨汁中加入原汁量5%的果胶酶,酶解后，调整总糖含量。调糖可采用加入白砂糖和浓缩梨汁的方法，用18g 转化为1°酒，计算制作12°酒需要加的白砂糖，充分摇晃使分布均匀。（2）调酸加入一定量亚硫酸钠, 当果汁中含有0.1%的二氧化硫时，即可抑制杂菌活动。甜酒0.8%-1%，一般PH>3.6或可滴定酸<0.65%时加入柠檬酸调整酸度，以利正常发酵。

活化酵母：添加0.3%-0.5%活性干酵母，使用前应放入3%-5%的葡萄糖溶液，37℃水浴0.5-1h后添加到果汁中，30℃的发酵温度，充分发酵5天。在发酵过程中, 每天定时对梨酒中的还原糖和酒精度进行测定, 直至还原糖和酒精度变化很小, 结束发酵。发酵中每天要轻轻摇瓶一、二次，将泡帽摇入发酵酒液中

陈酿、倒灌：主发酵结束，及时进行酒渣分离，防止酒、渣接触时间过长而产生较大的苦杂味。分离后，进入后发酵即陈酿阶段，继续完成残糖发酵、产生香味和老熟。其温度的掌握是低于主发酵温度。此阶段（约10天）形成的沉渣即酒脚，因其中的酵母菌体开始死亡自溶，会影响酒的风味和导致蛋白质浑浊，也要及时倒桶除去。在此后，一般要再倒一次桶，间隔时间可以延长。倒桶后要装满酒液，并用酒精或酒渣（脚）蒸馏的白酒封口，防止杂菌污染和空气氧化增强了酒的营养和保健功能。或用硅藻土澄清法：用量不超过420克／1000升；明胶—单宁法：0.5％的明胶液和1％的单宁液的最适用量分别为7.5％和7％

过滤：澄清后的梨汁还需除去沉淀及不稳定的悬浮颗粒，可用硅藻土过滤机过滤，硅藻土用量0.01％左右，采用0.3～0.35兆帕的过滤压力。板框式过滤机、超滤设备、薄板过滤、微孔薄膜过滤。

（3）发酵性能测定

测定一个发酵周期内酒精度及含糖量变化，绘制发酵曲线，并对自制果酒进行感官评定，分析测定理化指标（糖度、酒度、酸度）。

还原糖、总糖的测定：直接滴定法。

总酸的测定：中和滴定法。

酒度的测定：蒸馏法。

附：总糖和还原糖的测定（一）──费林试剂比色法

1. 实验原理斐林氏溶液与还原糖共沸，其中斐林氏溶液中的Cu2+被还原糖还原为Cu2O（砖红色）时，反应达到终点，过量的还原糖使次甲基蓝指示剂蓝色褪去，显露出Cu2O的红色即为终点。

2.试剂费林甲液：称取68.29g硫酸铜（CuSO4·5H2O），溶于蒸馏水中并稀释到1000ml。

费林乙液：称取346g酒石酸钾钠及100g NaOH，溶于蒸馏水中，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000ml，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。

0.25％葡萄糖标准溶液：准确称取2.500g经98-105℃干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入1000ml容量瓶中，加入5ml浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000ml。

3.器具：电热恒温水浴锅，调温电炉，250ml锥形瓶，滴定管。

4. 操作步骤

1）标定预备试验：吸取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水，摇匀，在电炉上加热至沸，在沸腾状态下用制备好的葡萄糖标准溶液滴定，当溶液的蓝色将消失呈红色时，加2滴次甲基蓝指示液，继续滴至蓝色消失，记录消耗的葡萄糖标准溶液的体积。

2）标定正式试验：戏取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和比预备试验少1 mL 的葡萄糖标准溶液，加热至沸，并保持 2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。

计算

式中：F——费林溶液A、B各 5 mL相当于葡萄糖的克数，g；m——称取葡萄糖的质量，g；V——消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。

3）葡萄酒样品还原糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100 mL容量瓶中，使之所含还原糖量为0.2～0.4g，加水定容至刻度。吸取费林溶液A、B各5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含还原糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持 2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于 1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按式（4）计算。

4）葡萄酒样品总糖测定：准确吸取一定量的样品（V1）于100mL容量瓶中，使之所含总糖量为0.2～0.4 g，加 5 mL盐酸溶液，加水至20 mL，摇匀。于68±1℃水浴上水解15 min，取出，冷却。用200 g／L氢氧化钠溶液中和至中性，（加入2滴酚酞，用NaOH溶液滴定至微红色）。调温至20℃，加水定容至刻度（V2）。吸取费林溶液A、B各 5.00 mL于250 mL三角瓶中，加50 mL水和一定量的试样（试样所含总糖量为0.2-0.4g），加热至沸，并保持2 min，加2滴次甲基蓝指示液，在沸腾状态下于1 min内用葡萄糖标准溶液滴至终点，记录消耗的葡萄糖标准溶液的总体积。按下式计算。

式中：X——总糖或还原糖的含量，g／L；F——费林溶液Ⅰ、Ⅱ各5 mL相当于葡萄糖的克数，g；V1——吸取的样品体积，mL；V2——样品稀释后或水解定容的体积，mL；V3——消耗试样的体积，mL；G——葡萄糖标准溶液的准确浓度，g／mL；V——消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL。所得结果表示至一位小数。

5. 注意事项

1）本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（Cu2＋量固定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中Cu2＋的含量是定量的基础，所以在样品处理时，不能用铜盐作为澄清剂，以免样液中引入Cu2＋。

2）碱性酒石酸铜甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。

3）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

4）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。

5）样品溶液应预测，其目的：一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可了解样品溶液浓度是否合适，浓度过大或过小应加以调整，使预测时消耗样液量在10ml左右；二是通过预测可以知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1ml左右的样液，只留下1ml左右样液在继续滴定时加入，以保证在1分钟之内完成继续滴定工作，提高测定的准确度。

6）必须严格控制反应液的体积，标定和测定时消耗的体积应接近，使反应体系碱度一致。热原一般采用800W电炉，电炉温度恒定后才能加热，热原强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致；否则加热至沸腾所需时间就会不同，引起蒸发量不同，使反应液碱度发生变化，从而引入误差。沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。因此，测定时应严格控制上述条件，力求一致。平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。

滴定酸的测定—中和滴定法

1. 实验原理利用酸碱中和的原理，以氢氧化钠标准溶液直接滴定葡萄酒（果酒）样品中的滴定酸，用酚酞指示剂指示滴定终点，由所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积计算葡萄酒（果酒）中滴定酸的含量。

2. 试剂酚酞指示剂溶液，10g/L ：称取酚酞1.0g，溶于60mL乙醇中，用水稀释至100mL。0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液。氢氧化钠标准溶液，c(NaOH)＝0.1mol/L。

1）配制

将氢氧化钠配成饱和溶液，注入塑料瓶（或桶）中，封闭放置至溶液清亮，使用前虹吸上层清液。量取5mL 氢氧化钠饱和溶液，注入1000mL不含二氧化碳的水中，混匀。

2）标定

称取0.6 g于105～110 ℃烘至恒量的基准邻苯二甲酸氢钾，精确至0.0001 g。溶于50 mL不含二氧化碳的水中，加入2滴酚酞指示剂溶液，以新制备的氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈微红色为其终点。同时做空白试验。

3）计算

按下式计算氢氧化钠标准溶液的浓度：C＝m/(V1-V2) ×0.2042

式中：C ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；m ——基准邻苯二甲酸氢钾的质量，g；V ——滴定时所消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；V1 ——空白试验消耗氢氧化钠溶液的体积，mL；0.2042——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的邻苯二甲酸氢钾的质量。

3. 操作步骤

1）样品的测定

取调温至20 ℃的样品2.00-5.00 mL(取样量可根据酒的颜色深浅而增减)置于250 mL三角瓶中，加入中性蒸馏水50 mL，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，摇匀后，立即用氢氧化钠标准溶液（c(NaOH)＝0.1mol/L）滴定至溶液微红色为终点，并保持30s内不变色，记录所消耗氢氧化钠标准溶液的体积V1。起泡葡萄酒和加气起泡葡萄酒需排除二氧化碳后，再进行测定。

2）空白的测定

吸取中性蒸馏水50mL置于250mL三角瓶中，同时加入2滴酚酞指示剂溶液，其余操作同1。

3）结果计算

按下式计算滴定酸的量，以g/L表示：

式中：X ——样品中滴定酸的含量，g/L；c ——氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；V1 ——样品滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V0 ——空白滴定时，消耗氢氧化钠标准溶液的体积，mL；V2 ——吸取样品的体积，mL；Si ——与1.00mL氢氧化钠标准溶液[c(NaOH)=1.000mol/L]相当的，以克表示的试样主体酸的质量。S酒石酸＝0.075；S苹果酸＝0.067；S柠檬酸＝0.064；S草酸＝0.045

酒度的测定

1．采用酒精计法测定葡萄酒(果酒)中酒精度。2）适用于各种类型葡萄酒(果酒)中酒精度的测定，结果表示为体积百分数，即%(v/v)，保留一位小数。

2. 实验原理以蒸馏法去除样品中的不挥发物质，利用酒精计和温度计直接读取酒精度和温度的示值，并加以温度校正，求得20℃时乙醇的体积百分数，即酒精度。

3. 实验材料全玻璃蒸馏器、酒精计、量筒。

4. 操作步骤1）用一洁净、干燥的 100 mL容量瓶准确量取 100 mL（具体取样量应按酒精计的要求增减）样品（液温 20℃）于500 mL蒸馏瓶中，用50蒸馏水连续三次冲洗容量瓶，连接酒精蒸馏装置，加热蒸馏，直到蒸出的液体大约100毫升时，用蒸馏水定容至100mL

2）将试样倒入洁净、干燥的100 mL量筒中，静置数分钟，待其中气泡消失后，放入洗净、干燥的酒精计，再轻轻按一下，不得接触量筒壁，同时插入温度计，平衡5 min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查附录，换算成20℃时酒精度。所得结果表示至一位小数。

数据

F值的测定，葡萄糖标准溶液配了两次，第一次500ml不够，又配了100ml，故有两个值。第一次，m=1.25 V=23.4 F=0.0585 第二次

m=2.5 V=29.6 F=0.074

糖度的测定，25℃，8度换成20℃，7.1度