基因工程中酵母菌表达系统的特点和作用

巴斯德毕赤酵母表达系统

学习感悟：原核基因和真核基因有区别（浙科版高中生物中没有此教学内容），因此，从基因文库中提取还是人工合成的目的基因（这两种方法得到的真核基因是有区别的，涉及基因结构内含子的问题），据资料，都可以通过酵母菌（真核细胞）转录，优点是翻译过程还可以加工，这也就是科学家开发酵母表达系统的原因之一。并不是有些试题所说的，人工化学合成的基因不能转录。以下就是来自于《丁香通》的节选内容，以便了解酵母菌表达系统。

基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。

一、酵母表达系统的特点

酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。

酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。

应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。

解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0－8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。

另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。

二、常用酵母表达系统（宿主－载体系统）

（1）酿酒酵母表达系统

酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30

kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表

达的宿主菌。

酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列（ARS），能够独立于酵母染色体外进行复制

，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。

（2）甲醇营养型酵母表达系统

甲醇营养型酵母包括汉森酵母属（Hansenula），毕赤酵母属（Pichia），球拟酵母属（Torulopsis）等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I（AOX1），二羟丙酮合成酶（DHAS）、甲酸脱氢酶（FMD）等。

巴斯德毕赤酵母具有翻译后修饰功能，如信号肽加工、蛋白质折叠、二硫键形成和糖基化作用等其与糖基化位点其他哺乳动物细胞相同。

（3）裂殖酵母表达系统

裂殖酵母不同于其他酵母菌株，它具有许多与高等真核细胞相似的特性，它所表达的外源基因产物具有相应天然蛋白质的构象和活性。遗憾的是，目前对它的研究较少。

三、利用酵母菌表达外源基因的步骤

以巴斯德毕赤酵母表达外源基因为例，包括如下步骤：

将目的基因克隆入毕赤酵母表达载体，收获阳性重组表达质粒。

用适当的限制性内切酶消化阳性重组质粒，使之线性化。

将线性化的阳性重组质粒转化入巴斯德毕赤酵母菌株（如GS115，KM71）。

将转化物接种HIS4缺陷平板进行第一轮筛选。

用不同浓度的G418平板进行第二轮筛选。

挑选10－20个克隆进行小规模诱导培养，鉴定外源基因的表达量。

挑选高水平表达菌株进行大规模诱导培养以制备外源基因的表达蛋白质。