常用试剂和培养基
常用试剂和培养基
Sterile water bottles
200 ml, 500 ml, or 950 ml water.
Autoclave.
0.05 M CaCl2(per 200 ml)
CaCl2·2 H2O 1.5 g
Add 198 ml water.
Autoclave.
0.5 M CaCl2(per 200 ml)
CaCl2·2 H2O 15.0 g
Add 188 ml water.
Autoclave.
0.1 M MgSO4(per 200 ml)
MgSO4(anhydrous) 2.4 g
Add 200 ml water.
Autoclave.
10% MSG(for 200 ml)
Glutamic acid (Na) 20.0 g
Add 188 ml water.
Autoclave.
40% Glucose(per 200 ml)
Glucose(dextrose) 80.0 g
Add water to 200 ml
(~145-150 ml).
Autoclave.
10% CAA(per 200 ml)
Casein Acid Hydrolysate 20.0 g
Add 186 ml water.
Autoclave.
10% Yeast(per 200 ml)
Yeast extract 20.0 g
Add 150-160 ml water. Autoclave.
Add 150 ul ?-mercaptoethanol
after autoclaving.
20X Tryptone/NaCl(per 200 ml)
Tryptone 40.0 g
NaCl 20.0 g
Add 190 ml water. Autoclave.
Add 150 ul ?-mercaptoethanol
after autoclaving.
10X M9 stock(for 200 ml)
Na2HPO4(anhydr.) 12.0 g
KH2PO4 6.0 g
NaCl 1.0 g
NH4Cl 2.0 g
Add 196 ml H2O. Autoclave.
Note: leave out NH4Cl to prepare 10X M9-N.
10X M9 - N stock(for 200 ml)
Na2HPO4(anhydr.) 12.0 g
KH2PO4 6.0 g
NaCl 1.0 g
Add 196 ml H2O. Autoclave.
Note: leave out NH4Cl!
100X P(for 200 ml)
KH2PO418.1 g
K2HPO4 5.0 g
pH to 6.3 with 10 N KOH!
Add 192 ml H20. Autoclave.
1X SM(for 200 ml)
NaCl 1.16 g
MgSO40.20 g
Gelatin (2%) 1.00 ml or 20 mg Add 190 ml H2O, then add:
Tris (1 M, pH 7.5) 10.0 ml
Autoclave.
2% Gelatin(per 500 ml)
Gelatin 10 g
Add 500 ml water.
Autoclave.
20% Succinate(for 500 ml)
Succinic acid 100 g
KOH 90 g
Add to 400 ml ice cold water.
Measure pH to 6.4, filter sterilize.
10X TBE(electrophoresis buffer)
Tris base 108.0 g
Na2EDTA 9.3 g
Boric Acid 55.0 g
Bring volume to 1 L with water.
Use double distilled water.
pH should be 8.3; if not adjust dropwise with conc. NaOH.
Water agar stock(for 190 ml)
Agar 3.0 g
Add 190 ml H2O.
Autoclave, store in 60C water bath.
R agar stock
200 ml500 ml
Tryptone........ 2.0 g 5.0 g NaCl............ 1.0 g 2.5 g Agar............ 3.0 g 7.5 g
Add H2O......... 194.0 ml 485.0 ml
Autoclave, store in 60C water bath.
LB agar200 ml1000 ml
Tryptone ...... 2 g 10 g
NaCl .......... 1 g 5 g
Yeast extract . 1 g 5 g
Agar .......... 3 g 15 g
Add H2O ...... 193 ml 990 ml
Autoclave, store in 60C water bath. LB agar can also be made by adding 10 ml 10% yeast extract and 10 ml 20X Tryptone/NaCl to 190 ml WA.
NZ200 ml500 ml
NZ amine .... 2.0 g 5.0 g
NaCl ........ 1.0 g 2.5 g
MgSO4(anhydrous).. 0.2 g 0.5 g
Add 10 M NaOH (1 drop/100 ml) after adding water.
Autoclave.
For agar media:
Agar ........ 2.4 g 6.0 g
Stir before and after autoclaving.
GYPC to WA stock: 200 ml1000 ml
Glucose (40%) ..... 2.0 ml 10.0 ml
Yeast extract (10%) 4.0 ml 20.0 ml
100X P ............ 2.0 ml 10.0 ml
CAA (10%) ......... 4.0 ml 20.0 ml
Succinate (20%).... 1.0 ml 5.0 ml
Add appropriate antibiotics.
Pour plates.
ORS minimal200 ml1000 ml
10X M9 ......... 10 ml 50 ml
Succinate (20%). 2 ml 10 ml
MSG (10%) ...... 2 ml 10 ml
Glucose (40%) .. 1 ml 5 ml
MgSO4(0.1 M) .. 1 ml 5 ml
CaCl2(0.5 M) .. 200 ul 1 ml
1000X vitamins . 200 ul 1 ml
Water .......... 184 ml 920 ml
Omit succinate and add 10 ml glucose for storage medium.
E. coli minimal200 ml1000 ml
10X M9 .......... 20 ml 100 ml
MgSO4(0.1 M) ... 2 ml 10 ml
CaCl2(0.5 M) ... 0.2 ml 1 ml
1000X vitamins .. 0.2 ml 1 ml
Glucose (40%) ... 2 ml 10 ml
XC minimal200 ml1000 ml
10X M9 .......... 5.0 ml 25 ml
MgSO4(0.1 M) ... 1.0 ml 5 ml
CaCl2(0.5 M) ... 0.2 ml 1 ml
200X 7 aa stock.. 0.2 ml 1 ml
Glucose (40%) ... 0.5 ml 2.5 ml
Glycerol (50%) .. 4.0 ml 20 ml
Nif plates
10X Nif buffer 100 ml
10X trace elements 100 ml
1000X vitamins 1 ml
Sterile dd H2O 799 ml
Agarose 6 g
Succinate (20%) 20 ml
(Succinate is already 0.4% from that in 10X nif buffer)
10X Nif buffer1000 ml
K2HPO434.02 g KH2PO457.06 g Succinate (20%) 200.00 ml pH should be 6.4 after 10X dilution.
1000X ORS vitamins
Nicotinic acid 2.0 mg/ml Pantothenate 1.0 mg/ml Biotin 0.2 mg/ml Stir, filter sterilize.
Trace elements
MgSO4(0.1 M) 25 ml CaCl2(0.5 M) 5 ml Na2MoO4(1 mg/ml) 5 ml
FeCl3(1 mg/ml) 5 ml Water 460 ml
YEM(per 500 ml)
K2HPO40.5 g MgSO47 H2O 0.2 g NaCl 0.1 g Mannitol 10.0 g
Yeast extract 0.4 g Agar 15.0 g pH to 6.9
YEM substitute(per 200 ml)
To 180 ml WA stock:
10X M9 8.0 ml
Mannitol (20%) 20.0 ml
Yeast extract (10%) 1.6 ml
SM10 selective media(for storage)
10X versatile Mg 100 ml
Thiamine 5 ml
Threonine 5 ml
Leucine 5 ml
Glucose (40%) 10 ml
Water 875 ml
Amino acids
SM10 stocks: Thiamine (0.337%)
Threonine (0.71%)
Leucine (0.79%) Klebsiella: Histidine (0.31%)
10X versatile Mg(for 200 ml)
MgSO4 2.0 ml
Thiamine (1 mg/ml) 2.0 ml
CaCl20.2 ml
200X PLT(for 200 ml)
Proline 9.20 g
Leucine 1.60 g
Thiamine 0.67 g
Autoclave.
Mg PLT
10X versatile Mg 100 ml
200X PLT 5 ml
40% glucose 10 ml
Water 885 ml
Z buffer (lacZ assays)
200 ml1000 ml Na2HPO47 H2O .... 3.22 g 16.10 g
NaH2PO4H2O ...... 1.10 g 5.50 g
KCl .............. 0.15 g 0.75 g
MgSO4(0.1 M) .... 1.00 ml 0.20 ml
?-mercaptoethanol. 2.70 ml 0.54 ml
Filter sterilize.
ONPG stock
4 mg/ml in phosphate buffer (pH 7)
Phosphate buffer(pH 7.0) per 100 ml:
Na2HPO47 H2O 1.64 g
NaH2PO4H2O 1.38 g
0.2 M Na2CO3(100 ml)
Na2CO3(anhydr.) 10.6 g
Jensen's Medium (Sesbania)
10X Macro nutrients (1000 ml):
K2HPO43 H2O 2.6 g
NaCl 2.0 g
MgSO40.97 g
CaCl210.0 g
FeCl36 H2O 1.4 g
KNO3 3.0 g
Jensen's Medium (Sesbania)
1X solution (1000 ml):
K2HPO43 H2O 0.20 g NaCl 0.20 g MgSO47 H2O 0.20 g CaHPO4 1.00 g FeCl36 H2O 0.10 g or Fe EDTA 0.26 g KNO3 .(only for 10X) 3.00 g
Jensen's Medium (1942)
see Vincent 1970 p. 75.
per Liter:
K2HPO43 H2O 0.2 g NaCl 0.2 g MgSO47 H2O 0.2 g CaHPO4 1.0 g FeCl36 H2O 0.1 g or Fe-EDTA 0.26 g Dilute 1:5 when used.
15 ml diluted medium/pouch.
1000X Micronutrients(200 ml)
H3BO3572 mg
MnCl2406 mg ZnSO4H2O 44 mg CuSO45 H2O 16 mg NaMO4BH2O 18 mg
Co2+ 20 mg
Ni2+ 20 mg
Nodule grinding buffer(500 ml)
50 mM KH2PO4(pH 7.6), 0.15 M NaCl
K2HPO4(1M) 3.25 ml
KH2PO4(1M) 21.75 ml
NaCl 4.38 gm
Add to 450 ml distilled water, pH to 7.6, and adjust volume to 500 ml.
Rapidyne germicide
For working solution:
Dilute concentrated stock at 0.6ml/L.
1 M Tris-Cl (500 ml)
To 400 ml, add:
Tris base 60.5 g
Add conc. HCl to pH
bring to volume.
Tris buffer mixtures for pH
pH Tris HCl Tris base
7.0 .923 .077
7.1 .905 .095
7.2 .90 .10
7.3 .865 .135
7.4 .84 .16
7.5 .82 .18
7.6 .78 .22
7.7 .74 .26
7.8 .67 .33
7.9 .63 .37
8.0 .50 .50
Southern Transfer solutions
I. 0.25 N HCl:
21.5 ml conc. HCl (11.6N) to 1 liter volume.
II. 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl:
87.7 g NaCl, 20.0 g NaOH to 1 liter volume.
III. 1.0 M Tris, 1.5 M NaCl:
121.1 g Tris base, 87.7 g NaCl, pH to 8.0 with conc. HCl (~50
ml), adjust to 1 liter volume.
IV. 20X SSC:
175.3 g NaCl, 88.2 g Na3citrate, pH to 7.0 with conc. HCl (~1
drop), adjust to 1 liter volume.
Random-primer oligonucleotide labelling
Mix:
9.00 ul DNA (not more than 200 ng)
1.25 ul hexamers
Boil, then place on ice, then add:
5.0 ul HEPES buffer
5.0 ul nucleotides [in 250 mM Tris (pH 8), 25 mM MgCl2, 50 mM
?-mercaptoethanol]
1.0 ul BSA (40 mg/ml)
0.5 ul Klenow
5.0 ul -32P CTP
Let reaction go at room temperature for at least 4 hours, or overnight.
MS MEDIUM FOR ARABIDOPSIS
To 990 ml H2O add:
Sucrose ........... 10.0 g
MOPS .............. 0.5 g
Agar .............. 8.0 g
Adjust pH to 5.7 with 1 M KOH.
Autoclave.
When cooled add sterile stock solutions of:
KNO3............... 20.0 ml 940 mM (95.00 g/L)
NH4NO3............. 20.0 ml 1000 mM (80.04 g/L)
KH2PO4............. 12.5 ml 100 mM (13.60 g/L) MgSO47H2O......... 15.0 ml 100 mM (24.65 g/L)
CaCl27H2O......... 10.0 ml 300 mM (44.00 g/L) Glycine............ 2.67 ml 10 mM Nicotinate......... 0.4 ml 10 mM Thiamin............ 0.02 ml 10 mM PyridoxineHCl..... 0.24 ml 10 mM Myoinositol........ 5.5 ml 100 mM
FeSO47H2O ........ 1.0 ml (2.780 g/100 ml)
Na2EDTA ........... 1.0 ml 100 mM (3.720 g/100 ml) MnSO44H2O......... 1.0 ml 100 mM (1.690 g/100 ml) ZnSO44H2O......... 3.0 ml 10 mM (0.288 g/100 ml) H3BO3 ............. 1.0 ml 100 mM (0.618 g/100 ml) KI................. 0.5 ml 10 mM (0.166 g/100 ml) CuSO45H2O ........ 0.01 ml 10 mM (0.170 g/100 ml) Na2MoO42H2O ...... 0.1 ml 10 mM (0.242 g/100 ml)
CoCl26H2O ........ 0.01 ml 10 mM (0.238 g/100 ml)
B5 MEDIUM FOR ARABIDOPSIS
To 990 ml H2O add:
Sucrose ........... 20.0 g
MOPS .............. 0.5 g
Agar .............. 8.0 g
Adjust pH to 5.7 with 1 M KOH.
Autoclave.
When cooled add sterile stock solutions of:
KNO3............... 26.3 ml 940 mM (95.00 g/L)
NaH2PO4H2O........ 11.0 ml 100 mM
MgSO47H2O......... 10.0 ml 100 mM (24.65 g/L) (NH4)2SO3.......... 10.0 ml 100 mM
CaCl27H2O......... 3.3 ml 300 mM (44.00 g/L) Myoinositol........ 5.5 ml 100 mM Thiamine........... 3.0 ml 10 mM Nicotinate......... 0.8 ml 10 mM PyridoxineHCl..... 0.48 ml 10 mM
10X Micronutrients. 10.0 ml (see below) Sequestrene 330 Fe. 10.0 ml (0.28 g/100 ml)
For Callus Inducing Medium (CIM) add:
2,4-D..................... 0.50 ml
Kinetin................... 0.05 ml
For Shoot Inducing Medium (SIM) add: IAA....................... 0.15 ml
6-dimethylaminopurine..... 5.00 ml
10X Micronutrients(per 100 ml)
MnSO44H2O......... 0.6 ml 100 mM (1.690 g/100 ml) ZnSO44H2O......... 10.07 ml 10 mM (0.288 g/100 ml) H3BO3 ............. 4.9 ml 100 mM (0.618 g/100 ml) KI................. 4.5 ml 10 mM (0.166 g/100 ml) CuSO45H2O ........ 2.3 ml 10 mM (0.170 g/100 ml) Na2MoO42H2O ...... 1.0 ml 10 mM (0.242 g/100 ml) CoCl26H2O ........ 1.0 ml 10 mM (0.238 g/100 ml)
LB (Luria-Bertani) Broth
Bacto-Tryptone 10 g
Bacto-Yeast Extract 5 g
NaCl 5 g
H2O up to 1L
If desired, adjust the pH 7.5 with NaOH.
CA (Complete Agar)
Casein Hydrolysate 10 g
Yeast Extract 5 g
K2HPO4 4 g
Agar 15 g
H2O up to 1 L
Stab Agar
Nutrient Broth 10 g
NaCl 5 g
Agar 6 g
H2O up to 1 L
Mix well and autoclave for 15 min at 121 C.
S.O.C. (from BRL)
1X 100 ml
2 % Bacto-Tryptone 2.0 g
0.5 % Yeast Extract 0.5 g
10 mM NaCl 2.92 g
2.5 mM KCl
3.73 g
20 mM MgCl220.2 g
20 mM MgSO424.6 g
20 mM Glucose 9.0 g
Mix above, bring to 100 ml, and filter through a sterile 0.45 μm filter. Store the stock solution at -20 C or -70 C.
Bacillus Thuringiensis Medium
Component G/L
Glucose 3.0
(NH4)2SO4 2.0
Yeast Extract 2.0
K2HPO43H2O 0.5
MgSO4*7H2O 0.2
CaCl2*2H2O 0.08
MnSO4*4H2O 0.05
Add componenets to distilled water. Mix throughly and bring pH to 7.3. Autoclave for 15 min at 15 psi -- 121°C
几种常见培养基作用
1.中国蓝平板：含有牛肉粉、蛋白胨、乳糖、琼脂、氯化钠、中国蓝、玫瑰红等成份。是一种弱选择性（亦有学者称为无抑制性）选择培养基。成份中的中国蓝为指示剂，玫瑰红为弱抑制剂，仅能抑制革兰阳性菌生长，而对大肠杆菌没有抑制作用，发酵性革兰阴性杆菌因分解乳糖能力不同，在此平板上的菌落颜色不同，便于鉴别菌种。根据菌落形态，可做出相应的处理或报告。例如：大肠埃希菌菌落呈蓝色；痢疾志贺菌呈淡红色；鼠伤寒沙门菌呈淡红色。 2.巧克力平板：普通营养琼脂成份添加进氯化血红素，万古霉素，辅酶A。用途：除可以分离奈瑟菌，嗜血杆菌外，由于加入了万古霉素，可抑制绝大多数的革兰阳性菌的生长，在分离培养上具有重要意义，不能用血平板来替代。巧克力平板含有嗜血杆菌生长需要的营养因子X因子和V因子。其原理为：绵羊血中的V因子通常处于被抑制状态，加热到80～90℃12Min即可破坏红细胞膜上的不耐热抑制物，可使V因子释放，故嗜血杆菌在加热的血琼脂培养基即巧克力琼脂培养基上生长较佳。 3. TCBS：含酵母膏粉蛋白胨氯化钠柠檬酸钠硫代硫酸钠胆酸钠牛胆粉蔗糖柠檬酸铁溴麝香草酚兰麝香草酚兰琼脂；其中：氯化钠可刺激弧菌的生长；蔗糖是可发酵的糖类；胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH（8.6）可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群；霍乱弧菌对酸性环境比较敏感，因此该pH值可增强其生长；硫代硫酸钠与柠檬酸铁反应作为检测硫化氢产生的指示剂；溴麝香草酚兰和麝香草酚兰是pH指示剂。利用指示剂来区分是否发酵蔗糖：副溶血性弧菌不发酵蔗糖，菌落呈蓝绿色。霍乱弧菌发酵蔗糖产酸，菌落呈黄色。TCBS常用于致病性弧菌的选择性分离，是GB2008、SN标准指定培养基。 4.MAC平板：即麦康凯琼脂培养基，用于大肠杆菌和大肠菌群的分离培养(05药典)，主要成分：蛋白胨脙胨猪胆盐(或牛、羊胆盐) 氯化钠琼脂乳糖1%结晶紫水溶液0.5%中性红水溶液。麦康凯平板的原理：利用胆盐来抑制革兰阳性细菌的生长，而对伤寒等沙门菌有促进生长的作用．利用乳糖发酵，中性红的颜色可把分解乳糖和不分解乳糖的细菌区别开．沙门菌及志贺菌呈无色菌落，大肠埃希菌呈桃红色菌落． SS培养基 2.原理 培养基中牛肉膏、蛋白胨等为营养物;煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸橼酸钠等抑制非病原菌生长,而胆盐能促进某些病原菌生长。因大肠埃希菌等能迅速分解乳糖产酸并与胆盐结合成胆酸,故形成中心混浊的粉红色菌落;病原菌不能分解乳糖。菌落呈透明无色,枸橼酸铁能指示硫化氢的产生,使菌落中心呈黑色。硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺菌及沙门菌的有害作用并中和煌绿和中性红染料的毒性作用,且能使大肠埃希菌的红色菌落颜色鲜明。 3.用途 用于分离肠道致病菌。 SS琼脂培养基是分离沙门菌及志贺菌属的强选择性培养基,它对大肠埃希菌有较强的抑制 作用,而对肠道病原菌则无明显抑制作用。因此,可以增加粪便等标本的接种量,从而提高病原菌的检出率,是目前公认比较满意的培养基。 附注:大肠埃希菌属细菌在此培养基虽不易生长,但亦不被杀灭,故挑选病原菌菌落时,应仅挑取菌落的中心部分,否则易将其四周的杂菌一并挑入,影响结果。
常用培养基的制备及注意事项(1)
常用培养基的制备及注意事项 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢 产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培 养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。 3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
培养基的配置和灭菌
培养基的制备与灭菌 一、目的要求 1.掌握微生物实验室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。 2.掌握培养基的配置原则和方法。 3.掌握高压蒸汽灭菌的操作方法和注意事项。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基：是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供细菌生长繁殖之用。 高压蒸汽灭菌：主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。将灭菌的物品放在一个密闭和加压的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅内水沸腾而产生蒸汽。待蒸汽将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀继续加热。此时蒸汽不溢出，压力增大，沸点升高，获得高于100℃的温度导致菌体蛋白凝固变性，而达到灭菌的目的。 三、实验材料 1.药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。 2.仪器及玻璃器皿：天平、高压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。 四、操作步骤 （一）玻璃器皿的洗涤和包装 1．玻璃器皿的洗涤 玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将三角瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中．用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。 2．灭菌前玻璃器皿的包装 （1）培养皿的包扎：培养皿由一盖一底组成一套，可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。 （2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌进入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1~1.5cm。塞棉花时．可用一外围拉直的曲别针、将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。 先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，有手将移液管压紧．在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折叠打结，准备灭菌。 （二）液体及固体培养基的配制过程1．液体培养基配制 （1）称量（假定配制1000ml培养基） 按培养基配方比例依次准确地称取3.0g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0gNaCl放入烧杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中．牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。 （2）溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量（如约700ml），用玻棒搅匀，然后，在石棉网上
实训五 常用培养基的制备
实训五常用培养基的制备 目的要求熟悉培养基制备的基本程序，会制备常用的培养基，会测定并矫正培养基的pH。 仪器及材料高压蒸汽灭菌器、电热干燥箱、电炉、天平、量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、三角烧瓶、标准比色管、精密pH试纸、纱布、牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、氢氧化钠、脱纤绵羊血等。 方法与步骤培养基制备的基本程序配料→溶化→测定及矫正pH→过滤→分装→灭菌→无菌检验→备用。 (一)肉膏汤培养基 1．成分牛肉膏3～5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。 2．制法将牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加水后，加热溶解。矫正pH至7.4～7.6，过滤分装。置高压蒸汽灭菌器内，121.3℃20min灭菌即成。 3．用途可供一般细菌生长，同时也是制作一般培养基的基础原料。 (二)营养琼脂培养基 1．成分肉膏汤1000ml，琼脂粉20～30g。 2．制法将琼脂粉加入肉膏汤内，煮沸使其完全溶解，矫正pH7.4～7.6，过滤分装于试管或三角烧瓶中，以121.3℃灭菌20min。可制成试管斜面、高层培养基或琼脂平板。 此培养基可供一般细菌的分离培养、纯培养，观察菌落特征及保存菌种等，也可作特殊培养基的基础。 (三)血液琼脂培养基将灭菌的营养琼脂冷至45～50℃,以无菌操作，加入5%～10%的无菌血液(或脱纤血)，然后倾注灭菌平皿或分装试管制成斜面。供营养要求较高的细菌分离培养，亦可供溶血性的观察和保存菌种用。 (四)半固体培养基肉汤培养基中加入0.3%～0.5%琼脂粉制成，用于菌种的保存或细菌运动性观察。 (五)肉渣汤(疱肉)培养基于每支试管中加入2～3g牛肉渣及肉膏汤5～6ml，液面盖以一薄层石蜡油，经121.3℃20～30min灭菌后保存冰箱备用。此培养基用于厌氧菌的培养，必须注意，此培养基在使用时，将肉渣培养基置水浴锅煮沸10min，以驱除管内存留的氧气。 (六)pH的测定与矫正 1．精密pH试纸法取精密pH试纸一条，浸入欲测的培养基中，半秒后取出与标准比色卡比较，如为酸性，滴加1mol/L氢氧化钠中和酸。在滴加1mol/L氢氧化钠后，应充分摇匀，再用试纸测定，直至调到pH在所需的范围内。 2．标准比色管法 (1)取与标准比色管大小一致的试管2支，按(实图5-1)每管内加入不同的溶液。①培养基5ml(对照管)；②标准比色管；③培养基5ml加0.02%酚红指示剂0.25ml；④蒸馏水管。 (2)对光观察比较两侧观察孔内颜色是否相同，培养基若为酸性(一般呈酸性)，则向③管中慢慢加0.1mol/L氢氧化钠，每滴一次，将试管内液体摇匀，直至③④两管
培养基制备的基本方法和注意事项
培养基制备的基本方法和注意事项 1.培养基配方的选定 同一种培养基的配方在不同着作中常会有某些差别。因此，除所用的是标准方法，应严格按其规定进行配制外．一般均应尽量收集有关资料．加以比较核对．再依据自己的使用目的加以选用，记录其来源。 2 ．培养基的制备记录 每次制备培养基均应有记录，包括培养推各称，配方及其来源．和各种成份的牌号。最终pH 值、消毒的温度和时间制各的日期和制备者等，记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。 3.培养基成分的称取 培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱．最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后．还应进行一次检查。 4.培养基各成份的混合和溶化 培养基所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅，以防有微量铜或铁混入培养基中，使细菌不易生长。最好使用不锈钢锅加热溶化．也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化。在锅中溶化时、可先用温水加热并随时扰动，以防焦化、如发现有焦化现象、该培养基即不能使用，应重新制备。 待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使所有成分完全溶化．迄至煮沸。如为琼脂培养基，应先用一部分水将琼脂溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后将两溶液充分混合。在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后必须加以补足。 5.培养塞pH 的初步调整 培养基各成分完全溶解后，应进行pH 的初步调正，因培养基在加热消毒过程中、pH 会有所变化，例如，牛肉浸液约可降低.而肠浸液pH 却会有显着的升高。因此，对这个步骤，操作者应随时注意探索经验、以期能掌握培养基的最终pH ，保证培养基的质量。 pH 调正后，还应将培养基煮沸数分钟，以利培养基沉淀物的析出。
常用缓冲液及培养基配方
常用缓冲液及培养基配方 LB液体培养基： Bacto-蛋白胨10g 酵母抽提物5g 氯化钠10g 加950ml蒸馏水溶解，用5N氢氧化钠调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。LB固体培养基： 每升LB液体培养基中加入12g琼脂粉，高压灭菌后保存。 SOB液体培养基 Bacto-蛋白胨20g 酵母抽提物5g NaCl 0.5g 加950 ml水溶解，加入250mmol/L KCl 溶液10ml，用5 N NaOH调pH至7.0，定容至1000 ml，高压灭菌后保存。使用前加入5ml经灭菌的2mol/LMgCl2。 SOC液体培养基 SOB中加入经灭菌的葡萄糖溶液至终浓度为20mmol/L。 麦康凯固体培养基 每1000ml水中加52g培养基粉，煮沸溶解后分装，高压灭菌。 NA固体培养基 牛肉浸膏3g 酵母浸膏1g 蛋白胨蔗糖琼脂粉 5g 10g 15g 加950ml蒸馏水溶解，调pH至7.0，定容至1000ml，高压灭菌后保存。 TB培养基： 将下列组分溶解在0.9L水中： Bacto-蛋白胨12g 酵母抽提物24g 甘油4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/ 0.72 mol/L K2HPO4的溶液。高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌。 溶液Ⅰ 葡萄糖2.25 g 50mmol/L 1mol/L Tris·Cl(pH8.0) 6.25ml 20mmol/L 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 5ml 10mmol/L 调pH至8.0后，用水定容至250 ml，高压灭菌后保存。 溶液Ⅱ 10 mol/L NaOH 2ml 10% SDS 10ml 用水定容至100 ml，现配现用。 溶液Ⅲ 5 mol/L 醋酸钾60ml
实验室常用培养基的配制方法
实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin (100 mg/ml) IPTG (24 mg/ml) X-Gal (20 mg/ml) LB培养基■组份浓度 100 mg/ml Ampicillin ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3. 用0.22 μm滤器过滤除菌。 4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。 ■组份浓度 24 mg/ml IPTG ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3. 用0.22 μm滤器过滤除菌。 4. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃保存。 ■组份浓度 20 mg/ml X-Gal ■配制量 50 ml ■配制方法 1. 称量1 g X-Gal置于50 ml离心管中。 2. 加入40 ml DMF（二甲基甲酰胺），充分混合溶解后， 定容至50 ml。 3. 小份分装（1 ml/份）后，-20℃避光保存。 ■组份浓度 1%（W/V）Tryptone，0.5%（W/V）Yeast Extract， 1%（W/V）NaCl ■配制量 1 L ■配制方法 1. 称量下列试剂，置于1 L烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2. 加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3. 滴加5 N NaOH（约0.2 ml），调节pH值至7.0。 4. 加去离子水将培养基定容至1 L。 5. 高温高压灭菌后，4℃保存。
植物常用培养基附加配制说明
备注：培养基和激素母液配制方法 （1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶， 不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。 （2）200×Fe盐溶液 称取1.39g FeSO4?7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2?EDTA溶于热水（B液）； 将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。 （3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法 称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解； 加水定容至100ml，4℃保存。如果出现沉淀，需要重新配置。 （4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法 称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200m l，4℃保存。 （5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法 称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。 （6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制 称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。使用前加入灭菌培养基。 （7） 0.5mg/ml KT和ABT的配法 称取50mg kenetin或ABT生根粉，先用少量1N KOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。 （8）其他附加物的溶解及配制 A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。4℃保存。 B、称取1g L-半胱氨酸(Cys) 溶于2mL 0.2mol/L或10%的NaOH溶液, 用蒸馏 水稀释定容至10mL，现用配制。4℃保存。 C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。4℃保存。 D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。4℃保存。 E、潮霉素（Hyg B），商品已溶解，筛选时一般加5、8、12mg/L梯度浓度。
芽孢杆菌常用培养基配方
芽孢杆菌常用培养基配方 （按理说，该实验的所有培养基都在这了，后红字更为清楚些。。。摘自百度） 一、肉汤琼脂培养基：蛋白胨10g ，牛肉膏15g ，NACL15g ，蒸 馏水1000ml ，琼脂18g 。调节PH7.2,0.1MPA20min 灭菌。如果用液体做培养基，则去掉琼脂即可。100 mL/组，其中20 mL 液体培养基/250 mL△中（内装玻璃珠10颗）；50 mL固体斜面培养基分装在试管中：5mL/支，10支。 2、或是（J-琼脂培养基：胰蛋白胨5g,酵母膏15g, 磷酸 氢二钾3g,葡萄糖2g, 琼脂20g, 蒸馏水1000ml。调节 PH7.3—7.5Mpa 30min灭菌。） 二、过氧化氢酶测定 1、试剂：3-10%过氧化氢 2、接种与培养：一般将测试菌种接种于肉汤琼脂斜面上，30度下 培养1-2天。 3、试验方法：取一干净载玻片，在上面加一滴3-10%的双氧水， 挑取1环1-2天的的菌苔，在双氧水溶液中涂抹，如有气泡出 现（O2），作为过氧化氢酶阳性，无泡为阴性。也可以将过氧 化氢液直接加入斜面上，观察气泡的产生。 三、需氧性测定
1、培养基：酪素水解物20g,葡萄糖 10g, ,NACL5g,HOCH2SO3Na1g,HSCH2COONa2g,琼脂15g,蒸馏水1L。调节PH7.2，分装试管，0.06Mpa，30min灭菌，培养基不摆斜面。 2、接种与观察：用一小环的肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中 （穿刺管底），一般与30 度培养3-7天观察结果。若芽孢杆菌在琼脂柱表面生长为好氧菌，沿穿刺线生长则为厌氧菌。四、酪素水解（用于检测不同种类的芽孢杆菌是否具有分解酪素的 特点） 1、培养基 （1）脱脂牛奶制备取新鲜牛奶，煮沸后去掉上层油脂，再经离心脱脂（3000r/min,10min）,除去上层油脂，即为脱脂牛奶。（2）牛奶平板的制备取50ml的脱脂牛奶放入一只三角瓶中，另外称1.5g琼脂置于含有50ml蒸馏水的另外3只三角瓶中，然后将两液分开灭菌，0.06Mpa-20min，带冷至45-50摄氏度时， 速将两液混匀倒平板，即为牛奶平板。将平板倒置过夜，使表面水分干燥。 2、接种与观察 将测试菌种以三点法点接在牛奶平板上，一般于30度培养1,3,5,7和14天，如菌落周围和下面呈透明，表明酪素已被分解。
选择性培养基
葡萄糖肉浸液肉汤Dextrose Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养 配方：（g/L）牛肉粉3.0 氯化钠5.0 蛋白胨10.0 磷酸氢二钾2.0 葡萄糖10.0 pH 值7.5 ±0.1 25℃ 原理：蛋白胨、牛肉粉提供氮源、维生素和生长因子；氯化钠维持均衡的渗透压；磷酸氢二钾为缓冲剂；葡萄糖提供碳源。 用法：称取本品30.0g,煮沸溶解于1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15 分钟,备用。质量控制：在36± 1℃培养24 小时。质控菌株溶血性链球菌单增李斯特氏菌大肠杆菌沙门氏菌27853 25922 14028 生长情况（10-8）+++ （10-8）+++ +/+/ 匹克氏肉汤基础A Pick’s Broth BaseA 用途：用于溶血性链球菌的增菌培养 配方：（g/L）胰蛋白胨10.0 牛心浸粉20.0 叠氮钠0.065 结晶紫0.002 pH 值7.3-7.5 原理：25℃胰蛋白胨、牛心浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子；脱纤维兔血（或羊血）为溶血性链球菌提供大量生长因子；结晶紫和叠氮钠为选择性抑菌剂。 用法：称取本品30.0g,加热溶于1000ml 蒸馏水中,分装, 121℃高压灭菌15 分钟, 冷至50℃左右时,加入脱纤维羊血,混匀。 质量控制：在36± 1℃培养18-24 小时。 肉浸液肉汤培养基Meat Infusion Broth 用途：用于溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的增菌培养（GB 标准） 配方：（g/L）牛肉粉3.0氯化钠5.0蛋白胨12.0 磷酸氢二钾2.0 pH 值7.5 ±0.1 原理：蛋白胨和牛肉粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；磷酸氢二钾为缓冲剂；氯化钠可维持均衡的渗透压。 用法：称取本品20.0g,溶解于1000ml 蒸馏水中,121℃高压灭菌15 分钟,备用。 质量控制：在36± 1℃培养18-24 小时。25℃ 质控菌株溶血性链球菌金黄色葡萄球菌大肠埃希氏菌沙门氏菌 菌株编号ATCC32210 ATCC25923 ATCC25922 ATCC14028 生长情况+++ +++ +++ +++ 浑浊浑浊浑浊浑浊 叠氮钠葡萄糖肉汤Azide Dextrose Broth 用途：用于链球菌的增菌培养 配方：（g/L）胰蛋白胨15.0 牛肉浸粉4.5 氯化钠7.5 葡萄糖7.5叠氮钠0.2 pH 值7.0 - 7.4 原理：胰蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源；葡萄糖提供碳源；叠氮化
常用培养基的配制
常用培养基的配制 （一）营养琼脂培养基 【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。 【成分】牛肉膏 3g NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼脂 20g 【pH值】7.2±0.2 【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基 【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃20min高压灭菌备用。 （三）半固体培养基 【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g 【pH值】7.6 【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。 （四）营养肉汤培养基 【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成分】蛋白胨 10g 氯化钠 5g 牛肉粉（牛肉浸汁） 3g 【pH值】7.2±0.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，分装小试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min 高压灭菌备用。 （五）葡萄糖蛋白胨水培养基 【用途】供甲基红试验及V-P试验之用。 【成分】蛋白胨5g 葡萄糖5g K2HPO4 (K2HPO4·3H2O) 5g (0.65g) 【pH值】7.0～7.2 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装试管，每管2～3ml，经112.6 ℃ 20min高压灭菌备用。 （六）伊红美蓝培养基（EMB培养基）
培养基母液的配制方法
培养基母液的配制方法 一、实验目的 1.了解无菌操作 2.掌握培养基母液的配制方法 二、实验原理 配制培养及时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。 三、实验器材和药品 器材：电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉。药品：NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、 MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、 ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、 CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、 Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素 (维生素B1)、甘氨酸。 四、实验步骤 1、大量元素母液的配制
各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍用天平称取，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。后用蒸馏水定容到 1000ml的容量瓶中，即为10倍的大量元素母液。到入细口瓶，贴好标签保存于冰箱中。配制培养基时，每配1L培养基取此液100ml。 表1 MS培养基大量元素母液制备 注意： (1) 配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca2+、SO42－、Mg 2+和H2PO4一等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解，药品采用等级较高的分析纯，各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合，混合时应注意先后顺序。特别应将Ca2+、SO42一、Mg 2十和H2PO4一等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。
常用10种培养基的配置和质控标准
小结：常用10种培养基的配置和质控标准 （1）基础肉汤 成分和配制方法： 蛋白胨10g NaCl5g 牛肉膏5g 酵母膏3g DW1L pH7.4～7.6 15磅30min高压灭菌，倾注无菌试管备用。 每次新配制时做质控 阳性质控：ATCC 25923金黄色葡萄球菌接种基础肉汤中，35℃温箱24h肉汤混浊。 无菌试验：<100管抽检5%,>100管随机抽取10管未接种的基础肉汤35℃温箱 24h培养，无细菌生长。 平行试验：质控时，要求新旧批号的培养基同时做 用途：供培养对营养要求不高的细菌增菌用；作其他选择培养基的基础液。 储存 干粉：室温保存，由于容易受潮，所以开瓶后务必将盖拧紧。 培养基：2-8℃保存一个月 （2）普通营养琼脂 成分和配制方法： 基础肉汤100ml 琼脂2g 15磅30min高压灭菌，倾注平板备用。
注：可购买国内生产的瓶装营养琼脂粉，按上面的说明配制。 质量控制： 质控频度每次新配制时做质控 质控方法 阳性质控：ATCC 25923金黄色葡萄球菌或ATCC25922大肠埃希菌接种营养琼脂上，35℃温箱24h细菌生长良好。 无菌试验：<100块抽检5%,>100块随机抽取10管未接种的营养琼脂35℃温箱 24h培养，无细菌生长。 平行试验：质控时，要求新旧批号的培养基同时做 用途： 供培养对营养要求不高的细菌。 作无糖基础培养基。 加血成血平板。 加血加热75℃以上，再加上生长添加剂就成巧克力平板。 储存 干粉：室温保存，由于容易受潮，所以开瓶后务必将盖拧紧。 培养基：2-8℃保存半个月 （3）葡萄糖肉汤 成分和配制方法： 蛋白胨10g 朊胨10g NaCl5g 牛肉膏5g 酵母粉3g 葡萄糖4g 枸橼酸钠3g 硫酸镁3g DW1L
实验一常用器皿包扎与培养基的配制和灭菌
实验一常用器皿包扎与培养基的配制和灭菌 一、实验目的 1学会常用器皿包扎方法 2学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤 3学会实验室灭菌锅的使用方法 二、常用器具和仪器 试管(testtube)，德汉氏小管(Durhamtube)，玻璃吸管 (glasspipette)，吸器，微量加样器(micropipette)，吸嘴(tip)，培养皿(petri dish)，三角瓶(erlenmeyer flask)，接种铲(inoculatingshovel),玻璃涂布器(glassspreade)，接种环(inoculatingloop)，接种钩(inoculating hook)，接种针(inoculating needle)，小塑料离心管(Eppendorf tube)，滴瓶(dropper bottle )，双层瓶(double bottle)，酒精灯⑻ cohol burner)，煤气喷头(coal gas sprinklerhead，试剂瓶，量筒，烧杯，温度计，石棉网，漏斗，烘箱，卧式灭菌锅，手提式灭菌锅，无菌操作台/ 室，过滤除菌设备，厌氧操作设备，小型发酵罐，离心机，培养箱/摇床，冷冻干燥机，蒸馏水器，超声波清洗仪，磁力搅拌器。 三、玻璃器皿的包装 1、培养皿的包装方法一：用旧报纸密密包紧，一般以5-8 套培养皿作一包。包好后用干热或湿热灭菌(见无菌操作技术)。 方法二：将培养皿放入金属(不锈钢)筒内，干热灭菌。金属筒配有盖子，内部还有一个可以放培养皿的带底框架。框架可以从筒内提出，以便装取培养皿。 包好的培养皿 金属筒和内部的框架 塑料培养皿架 2、吸管的包装
各种培养基的制作方法
配方一萨氏（Sabouraud's）培养基 蛋白胨10克琼脂20克麦芽糖40克水1000毫升 先把蛋白胨、琼脂加水后，加热，不断搅拌，待琼脂溶解后，加入40克麦芽糖（或葡萄糖），搅拌，使它溶解，然后分装，灭菌，备用。 1.营养肉汤培养基 牛肉膏 0.3克 蛋白胨 1.0克 NaCl 0.5克 水 100毫升 pH 7.0～7.2 在烧杯中加水，称取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，加热溶化后，调节pH值至7.0～7.2。分装，加棉塞，高压蒸汽灭菌即成。常用于培养细菌。 2.营养琼脂培养基 在营养肉汤培养基中增加20克琼脂即成。常用于培养细菌。 3.肉汁蛋白胨液体培养基 牛肉 500克 蛋白胨 10克 NaCl 5克 pH 7.1～7.2 取新鲜牛肉500克，去净脂肪、筋腱后，绞碎或剁碎，加水1000毫升浸泡，15℃下放置12小时或50℃下放置半小时。用纱布将肉汁过滤，补足失水。向肉汁中加入蛋白胨和食盐。将肉汁加热，放入苏打（碳酸钠）至红色，调整pH值。分装，高压蒸汽灭菌。 将上述已灭菌的培养基用棉花滤去凝集的蛋白质，制成液体培养基，如需制成固体培养基，可在每100毫升液体中加入2克琼脂，加热溶化后，分装，再次进行高压蒸汽灭菌。常用于培养细菌。 4.高氏一号培养基（淀粉琼脂培养基） 可溶性淀粉 2克 K2HPO4 0.05克 MgSO4·7H2O 0.05克 KNO3 0.1克 NaCl 0.05克
FeSO4 0.001克 琼脂 2克 水 100毫升 pH 7.2～7.4 在烧杯中加水95毫升，加热至沸腾，取可溶性溶粉2克，用5毫升水调成糊状，倒入沸水中和匀。再称取其它药品，陆续加入烧杯内（待一种药品溶解后，再加入第二种药品）。待全部药品溶解后，停止加热，补足失水，调pH值至7.2～7.4。分装后，高压蒸汽灭菌。本培养基常用于培养放线菌。 5.马铃薯蔗糖培养基 马铃薯 200克 蔗糖 10克 琼脂 20克 水 1000毫升 自然pH 称取200克马铃薯片，加水1000毫升，煮沸半小时，用纱布过滤，补足失水。在上述滤汁中加入10克蔗糖、20克琼脂，加热使琼脂熔化。分装后，高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 6.麦芽汁培养基 将从啤酒厂买来加有啤酒花的麦芽汁，装入锥形瓶中，加塞高压蒸汽灭菌。常用于培养酵母菌。 7.察氏培养基 NaNO3 2克 K2HPO4 1克 KCl 0.5克 MgSO4 0.5克 FeSO4 0.01克 蔗糖 30克 琼脂 15～20克 水 1000毫升 自然pH
常用细菌培养基配方
常用抗生素 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml） 溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 常用培养基 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨10g 酵母提取物5g 氯化钠10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。(实验室一般都不调PH) SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨20g 酵母提取物5g 氯化钠0.5g 1 mol/L 氯化钾2.5ml
实验室常用培养基的配制方法
五、实验室常用培养基的配制方法 Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml) 组份浓度100 mg/ml Ampicillin 配制量50 ml 配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0.22 μm过滤膜过滤除菌。 4.小份分装(1 ml/份)后，-20℃保存。 IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml) 组份浓度24 mg/mL IPTG 配制量50 mL 配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0 22 μm过滤膜过滤除菌。 4小份分装(1 ml，份)后，-20℃保存。 X-Gal (20 mg/ml) 组份浓度20 mg/ml X-Gal 配制量50 ml 配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.小份分装(1 ml/份)后，-20℃避光保存。 LB培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4。C保存。 LB/Amp培养基 组份浓度 1%(W/V) Tryptone 0.5%(W/V) Yeast Extract 1%(W/V) NaCl 0.1 mg/ml Ampicillin
实验常用培养基和基本特性
常用培养基及基本特性 1、RPMI-1640 Medium RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium（MEM） 也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。 3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。 4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12 DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mMHEPES缓冲液。 6、McCoy’s 5A McCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。
常用培养基的配方
伊红美蓝培养基 原理 一般用来鉴定大肠杆菌。 伊红为酸性染料，美蓝为碱性染料。 当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成紫黑色菌落，并带有绿色金属光泽。 在碱性环境中不分解乳糖产酸的细菌不着色，伊红和美蓝不能结合，故沙门氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。金葡菌在此培养基上不生长。 常用的伊红美蓝乳糖培养基，可用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌。如果有大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+，故菌落被染成深紫色，从菌落表面的反射光中还可以看到金属光泽。 用伊红美蓝培养基鉴定水中大肠杆菌 步骤如下： ①制作伊红美蓝培养基，趁热注入培养皿中，凝成平板，待用。 ②用灭过菌的锥形瓶盛取河水或沟水，按1：10稀释。 ③取0.1毫升稀释液接种于伊红美蓝培养基上。用平板划线分离法进行分离。 ④将划线后的培养皿倒置37℃温箱中培养18～24小时。培养基中会出现大肠杆菌菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽。 ⑤将菌落接种于斜面培养基上（由营养琼脂培养基制成）。 配置方法 蛋白胨 10g 乳糖 10g 磷酸氢二钾 2g 琼脂 20~30g 蒸馏水 1000ml 2%伊红水溶液 20ml 0.5 %美蓝水溶液 13ml 储备培养基的制备 先将琼脂加至900ml蒸馏水，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH为7.2~7.4。趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌器内以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 制法
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正PH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 麦康凯培养基 原理 1.全称麦康凯琼脂或是麦康凯培养基 2.一种用于分离鉴定细菌的培养基，大肠杆菌在其上呈红色或粉红色，有的菌落只是中间呈现红色。 配置方法 蛋白胨 17g 脙胨3g 猪胆盐(或牛、羊胆盐) 5g 氯化钠 5g 琼脂 17g 蒸馏水1000mL 乳糖10g 0.01%结晶紫水溶液 10mL 0.5%中性红水溶液 5mL 麦康凯-制法 1 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2。将琼脂加入600mL 加热溶解。将两液合并，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。 2 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至50～55℃时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板。 注：结晶紫及中性红水溶液配好后须经高压灭菌。 吲哚试验 吲哚（indol）试验有些细菌如大肠埃希菌、变形杆菌、霍乱弧菌等能分解培养基中的色氨酸生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色，是为吲哚试验阳性。 LB培养基 配方 胰化蛋白胨 1g 酵母提取物 0.5g NaCl 1g 琼脂 1.5-2g 水100ml LB培养基-LB培养基条件 LB培养基-固态培养基 LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。 LB固体培养基倒板 1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉
第五章 微生物的营养和培养基习题整理
第五章微生物的营养和培养基 一、选择题 1. 大多数微生物的营养类型属于：（） A. 光能自养 B. 光能异养 C. 化能自养 D. 化能异养 2. 蓝细菌的营养类型属于：（） A．光能自养 B. 光能异养C．化能自养 D. 化能异养 3. 碳素营养物质的主要功能是：（） A. 构成细胞物质 B. 提供能量 C. A，B 两者 4. 占微生物细胞总重量70%-90% 以上的细胞组分是：（） A. 碳素物质 B. 氮素物质 C. 水 5. 能用分子氮作氮源的微生物有：（） A. 酵母菌 B. 蓝细菌 C. 苏云金杆菌 6. 大肠杆菌属于（）型的微生物。 A. 光能无机自养 B. 光能有机异养 C. 化能无机自养 D. 化能有机异养 7. 自养型微生物和异养型微生物的主要差别是：（） A. 所需能源物质不同 B. 所需碳源不同 C. 所需氮源不同 8. 基团转位和主动运输的主要差别是：（） A. 运输中需要各种载体参与 B. 需要消耗能量 C. 改变了被运输物质的化学结构 9. 单纯扩散和促进扩散的主要区别是：（） A. 物质运输的浓度梯度不同 B. 前者不需能量，后者需要能量 C. 前者不需要载体，后者需要载体 10. 微生物生长所需要的生长因子（生长因素）是：（） A. 微量元素 B. 氨基酸和碱基 C. 维生素 D. B，C二者 11. 培养基中使用酵母膏主要为微生物提供：（） A. 生长因素 B. C 源 C. N 源 12. 细菌中存在的一种主要运输方式为：（） A. 单纯扩散 B. 促进扩散 C. 主动运输 D. 基团转位 13. 微生物细胞中的C素含量大约占细胞干重的：（） A. 10% B. 30% C. 50% D.70%