拟南芥血红蛋白1(AtGLB1)超量表达载体和RNAi表达载体的构建及转化

第29卷第4期2010年 8月华 中 农 业 大 学 学 报

J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y V o l .29 N o .4

A u g

.2010,413~416收稿日期:2009-11-19;修回日期:2010-01-18

*广东省自然科学基金项目(8451009101001243)和广州市属高校科技计划项目(08C 029

)资助**通讯作者.E -m a i l :w a n g z h e n g

x u n @163.c o m 杨礼香,女,1972年生,博士,讲师.研究方向:植物发育分子生物学.E -m a i l :y a n g

l x @g z h u .e d u .c n .拟南芥血红蛋白1(AtGLB1)超量表达载体

和RNAi 表达载体的构建及转化*

杨礼香 王正询** 柯德森 巫锦雄

广州大学生命科学学院,广州510006

摘要 为研究拟南芥血红蛋白1基因(A t G L B 1)的功能,将A t G L B 1基因构建入超表达载体p M D 和R N A i

载体p Z Y I 中,并采用花序浸染法将重组质粒转化拟南芥C o l u m b i a 得到了转基因植株三对超表达株系和R N A i 株系的纯合体进行N o r t h e r n 分析,结果表明:超量表达的拟南芥株系中A t G L B 1的表达水平比野生型高很多,

而表达被抑制的R N A i 株系中几乎检测不到A t G L B 1基因的表达三这些A t G L B 1表达水平不同的拟南芥株系的获得可为该基因功能的后续研究以及在农业生产中的应用奠定一定基础三

关键词 拟南芥血红蛋白1;超表达;R N A i

中图分类号 Q786 文献标识码 A 文章编号 1000-2421(2010)04-0413-04

血红蛋白存在于整个生物界三植物中的血红蛋

白至少有3类:共生的血红蛋白二非共生的血红蛋白二截短的血红蛋白[1]

三非共生的血红蛋白可以分为2类,血红蛋白1(H b 1)和血红蛋白2(H b 2)

三H b 1几乎存在于整个植物界,生物和非生物胁迫都可以诱导H b 1的表达,

如细菌侵染二低氧胁迫二渗透胁迫二寒冷胁迫二营养缺乏等[

2-4

]三非共生血红蛋白1具有过氧化物酶类似活性并参与N O 的代谢,因此在许多生物中的功能都是与N O 的代谢或清除相关[5]

三拟南芥中的非共生血红蛋白1(A t G L B 1或A H b 1

)在低氧胁迫中的作用已经研究得比较清楚三A t G L B 1通过与低氧胁迫下大量产生的一氧化氮(N O )反应形成S -亚硝基血红蛋白,从而清除了N O ,

减少了低氧胁迫下N O 的释放[6-7]

三同时,在低氧胁迫下A t G L B 1有助于提高过氧化氢(H 2O 2)

清除系统的活性,从而降低了细胞中H 2O 2的含量,减少了低氧对植物细胞的伤害[8

]三然而,A t G L B 1在

其他胁迫反应中的作用机理还不是太清楚三在许多生物和非生物胁迫中都产生活性氧和N O ,因此A t -G L B 1可能也参与调节那些产生活性氧和N O 的胁迫反应三研究A t G L B 1在其他胁迫反应中的作用具有非常重要的意义,尤其是与农业生产密切相关的胁迫(如寒冷二盐二干旱二虫害等)三为此,本研究通过转基因方法获得了不同A t G L B 1表达水平的拟

南芥株系,旨在阐明植株对寒冷二盐二干旱二虫害等胁迫的耐受性与A t G L B 1表达水平间的关系,

并对A t G L B 1在农业生产中的应用进行探讨三

1 材料与方法

1.1 试验材料

E s c h e r i c h i a c o l i D H 5α二G V 3101菌株,p B l u e -s c r i p t I I S K (-)二p M D 二p

Z Y I 质粒,拟南芥c D N A 文库为笔者所在实验室保存三质粒提取试剂盒二D N A 回收试剂盒等购自上海生工生物工程有限公司,限制性内切酶二连接酶二D N A 分子质量标准等购自大连宝生物公司,其它化学试剂为国产分析纯三1.2 pBluescript ⅡSK(-)/AtGLB 1的构建根据A t G L B 1序列设计5?端引物A t G L B 15(5?

C G G G A T C C A T G G A G A G T G A A G G A A A G A T T G T G 3?)和3?端引物A t G L B 13(5?C G G G A T C C T T A G T T G -G A A A G A T T C A T T T C A G C T T T 3?),两端引物均带有B a m HⅠ的酶切位点三利用上述2个引物从c

D N A 文库(

P R L -2)(B i o l o g i c a lR e s o u r c e C e n t e ra t O h i o S t a t e ,U S A )中扩增A t G L B 1的开放阅读框(94?变

性3m i n ;94?变性1m i n ,55?复性1m i n ,72?延伸1m i n ,30个循环;72?延伸10m i n )三用B a m H Ⅰ酶切后,将目的基因连接到p B l u e s c r i p

t ⅡS K (-)上,得到p B l u e s c r i p tⅡS K (-)/A t G L B 1三质粒p B l u e -

华中农业大学学报

第29卷

s c r i p tⅡS K (-)具有A m p i c i l l i n (A m p

)抗性,T 3和T 7启动子分别位于其多克隆位点的两侧(图1-a )三用A t G L B 15引物分别和T 3(5?A T T A A C C C T -C A C T A A A G G G A A 3?)二T 7(5?T A A T A C G A C T -C A C T A T A G G G3?)引物一起,以单菌落为模板,菌落P C R 筛选程序同扩增A t G L B 1三A t G L B 15和T 3能扩增出的为反向插入,A t G L B 15和T 7能扩增出目的带的为正向插入三选取具有正向插入的阳性克隆进行酶切鉴定后,测序鉴定

三

图1 p B l u e s c r i p

t (a )和p Z Y I (b )质粒中的酶切位点F i g .1 D i g e s t i o n s i t e s o f v e c t o r p B l u e s c r i p

t (a )a n d p Z Y I (b )1.3 pMD/AtGLB 1植物表达载体的构建

将测序鉴定后的重组质粒p B l u e s c r i p

t ⅡS K (-)/A t G L B 1转入大肠杆菌中大量扩增质粒,然后再用B a m H Ⅰ酶切,得到A t G L B 1酶切片段;将p

M D 用B a m HⅠ酶切后,去磷酸化三将B a m HⅠ酶切的A t G L B 1片段与酶切并去磷酸化后的p M D 连

接,将连接产物转化入D H 5α感受态细胞中三菌落P C R 筛选含有正向插入的重组质粒p M D /A t G L B 1的菌落,接菌提质粒后,进行酶切鉴定三1.4 RNAi 载体的构建

R N A i 载体的构建是在同一个载体p Z Y I 中插入一个正向和一个反向的目的基因拷贝三首先插入

第1个拷贝:用B a m HⅠ酶切p B l u e s c r i p

tⅡS K (-)/A t G L B 1后回收片段,并用同样的酶酶切p Z Y I 载体并去磷酸化;将两者连接后转化,用正向引物为

C a MV 35S (5?G A A A C C T C C T C G G A T T C C A T 3?

)和A t G L B 13进行菌落P C R ,筛选含有正向插入的重组质粒p Z Y I /A t G L B 1的菌落三接菌提质粒后用B a m HⅠ酶切鉴定三因为p B l u e s c r i p t ⅡS K (-)上的X h o Ⅰ和S a c Ⅰ酶切位点排列顺序与p Z Y I 上的刚好相反(图1),用X h o Ⅰ和S a c Ⅰ从p B l u e s c r i p

t ⅡS K (-)/A t G L B 1上双酶切下的片段插入p Z Y I 后,其方向则为反向三因此,为确保2个拷贝的插入方向刚好相反,第1个拷贝的插入方向就应为正向三然后插入第2个拷贝:用X h o Ⅰ和S a c Ⅰ双酶切

p B l u e s c r i p tⅡS K (-)/A t G L B 1后回收片段,并用这2个酶酶切已经连接有第1个拷贝的p Z Y I /A t -G L B 1重组质粒三将两者连接后转化,P C R 筛选含有正确插入的重组质粒p Z Y I /A t G L B 1/A t G L B 1的菌落三接菌提质粒后用X h o Ⅰ和S a c Ⅰ双酶切鉴定三1.5 拟南芥转化和鉴定

拟南芥转化采用的方法是花蕾浸泡法[9

]三收获转化后的拟南芥种子,并用卡那霉素(K a n 50

m g

/L )对转基因拟南芥植株逐代进行鉴定和筛选,得到纯合株系三用T R I z o l 法提取拟南芥幼苗的总R N A ,用紫外分光光度计测定D 260n m 和D 280n m 值来

确定R N A 的浓度和纯度三将R N A 变性后在琼脂糖凝胶中电泳,将电泳后的胶置于转膜装置中将R N A 转到硝酸纤维素膜上三转膜10~16h 后,取出杂交膜,并用铅笔做好标记,放在紫外交联仪上交

联三交联好的膜放入杂交炉中进行N o r t h e r n 杂交后,将杂交膜取出清洗后用保鲜膜包好置于磷屏夹内放射自显影三磷屏扫描,分析结果三

2 结果与分析2.1 pBluescript ⅡSK(-)/AtGLB 1的鉴定菌落P C R 筛选出含有具有正向插入的阳性克

隆后,提取重组质粒进行酶切鉴定三B a m HⅠ酶切重组质粒p B l u e s c r i p

t /A t G L B 1后,结果显示酶切出1条500b p 左右的带(图2),表明目的片段A t -G L B 1已插入到相应的克隆位点三测序后与G e n e -B a n k 中的A t G L B 1序列相比较,序列完全正确

三 1.未经酶切的重组质粒p B l u e s c r i p

t /A t G L B 1R e c o m b i n a n t p l a s m i d p B l u e s c r i p

t /A t G L B 1;2.B a m H Ⅰ消化后的重组质粒p B l u e s c r i p t /A t G L B 1R e c o m b i n a n t p l a s m i d p B l u e s c r i p

t /A t G L B 1d i g e s t e db y B a m H Ⅰ;M.D N A 分子质量标准D N A m a r k e r (D L2000,1000,750,500,250,100b p

).图2 重组质粒p B l u e s c r i p t /A t G L B 1的酶切鉴定F i g

.2 I d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t c o n s t r u c t i o n p B l u e s c r i p t /A t G L B 1w i t he n z y m ed i g

e s t i o n 2.2 pMD/AtGLB 1的鉴定

以转化了连接产物的单菌落为模板,用正向引

物3

5S 和A t G L B 13扩增,10个菌落中有2个单菌落(4#,6#)能扩增出500b p 左右的带(

图3),表明其中含有p M D /A t G L B 1质粒,且A t G L B 1片段是

4

14

第4期

杨礼香等:拟南芥血红蛋白1(A t G L B 1)超量表达载体和R N A i 表达载体的构建及转化

正向插入三从4#,6#单菌落中任意挑选1个,接菌提质粒后,用B a m HⅠ酶切,能切下1条500b p 左右的带(图4),表明A t G L B 1的插入正确

三

1~10.P C R 扩增产物P C R p r o d u c t s o f A t G L B 1g e n e ;M.D N A 分子质量标准D N A m a r k e r (D L2000).

图3 重组质粒p M D /A t G L B 1的P C R 鉴定

F i g

.3 I d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t c o n s t r u c t i o n p

M D /A t G L B 1w i t hP C

R 1.未经酶切的重组质粒p M D /A t G L B 1R e c o m b i n a n t p l a s m i d

p M D /A t G L B 1;2.B a m HⅠ消化后的重组质粒p M D /A t G L B 1R e -

c o m b i n a n t p l a s m i

d p M D /A t G L B 1d i g

e s t e db y B a m HⅠ;M.D N A 分子质量标准D N A m a r k e r (D L2000).

图4 重组质粒p M D /A t G L B 1的酶切鉴定F i g

.4 I d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t c o n s t r u c t i o n p M D /A t G L B 1w i t he n z y m ed i g

e s t i o n 2.3 RNAi 载体的鉴定

p Z Y I /A t G L B 1/A t G L B 1的构建也是以p B l u e -s c r i p t I I S K (-)/A t G L B 1的构建为基础的三1)第1个拷贝的插入鉴定三以转化了p Z Y I

/A t G L B 1质粒的单菌落为模板,将用正向引物35S

和A t G L B 13菌落P C R 筛选到的阳性克隆扩大培养提质粒,用B a m HⅠ酶切能切下1条500b p 左右的带,表明A t G L B 1片段已正向插入到p Z Y I 中三

2)第2个拷贝的插入鉴定三挑取转化了p Z Y I /A t G L B 1/A t G L B 1质粒的单菌落为模板,用引物35S 和A t G L B 13扩增,8个菌落中有3个单菌落(3#,4#,8#)能扩增出2条带,分别为500b p 和1000b p 左右(图5)三p Z Y I 载体中的I n t r o n 长度为500b p 左右,所以P C R 检测时扩增的500b p 和

1000b p 左右的带分别为正向插入的第1个拷贝A t G L B 1基因和第1个拷贝加上载体上的I n t r o n 三阳性克隆接菌提质粒后,用B a m HⅠ或S a c Ⅰ和

X h o Ⅰ酶切重组质粒,均能切下1条500b p 左右的带三表明A t G L B 1已经插入到2个酶切位点且插入方向正好相反

三

1~8.P C R 扩增产物P C R p r o d u c t s ;M.D N A 分子质量标准

D N A m a r k e r (D L2000).

图5 重组质粒p Z Y I /A t G L B 1/A t G L B 1的P C R 鉴定F i g

.5 I d e n t i f i c a t i o no f r e c o m b i n a n t c o n s t r u c t i o n p

Z Y I /A t G L B 1/A t G L B 1w i t hP C R 2.4 转基因植株的获得和鉴定

获得转基因拟南芥种子后,逐代筛选出具有卡那霉素抗性的纯合的转基因拟南芥三选取几个拟南芥株系提取其幼苗总R N A ,进行N o r t h e r n 杂交,

分析各个株系的A t G L B 1表达量三3个株系(35S?

A t G L

B 1二R N A i ?A t G L B 1和野生型)中A t G L B 1的含量差别很大三超表达株系中的A t G L B 1表达水平明显高于其它株系,而在R N A i 株系中几乎检测不到A t G L B 1m R N A 的存在(

图6)三这表明R N A i 导致了基因表达活性的丧失

三

1.野生型W i l d t y p e A r a b i d o p

s i s ;2~4.A t G L B 1超量表达株系A t G L B 1o v e r e x p r e s s i n g A r a b i d o p

s i s ;5~7.R N A i 抑制株系A t G L B 1s u p p r e s s e d A r a b i d o p

s i s .图6 N o r t h e r n 杂交分析A t G L B 1在各株系中的表达F i g .6 N o r t h e r nb l o t a n a l y s i s o f A t G L B 1e x p

r e s s i o n 3 讨 论

在植物中,通过增强型启动子上调和通过

R N A i 技术下调特异基因的表达,

已被广泛用于植物基因的功能研究中[10-11]三本研究中所用的p Z Y I

质粒是一种含有内含子的i h p R N A (i n t r o n _c o n t a i -n i n g h a i r p

i nR N A )表达质粒载体,已有研究发现其沉默效率比不含内含子的h p R N A 质粒要高很多[12

]三其工作原理是针对靶基因,设计将反向重复

序列构建到含内含子的p Z Y I 质粒中,

然后利用农杆菌介导转化整合到植物染色体中,通过反向重复序列转录形成含发夹结构的双链R N A ,

进而诱导R N A i 的产生三在本研究中,R N A i 的效果显著三5

14

华中农业大学学报第29卷

拟南芥A t G L B1在低氧胁迫中的作用方式已经非常明确[13]三最近,又有研究表明在拟南芥中超量表达棉花的血红蛋白1增强了植株的抗病能力和对N O的耐受性三而且棉花的血红蛋白1在拟南芥中的超量表达诱导了防卫基因P R-1二P D F1.2的组成型表达[14-15]三这表明棉花的血红蛋白1在植物抵抗病原体入侵的防御反应中起着非常重要的作用三拟南芥的血红蛋白1与棉花的血红蛋白1有82%的同源性,因此拟南芥的血红蛋白1很可能也有相似的功能三下一步将利用本研究所获得的不同A t G L B1表达水平的拟南芥株系对A t G L B1在各种胁迫,尤其是农业相关胁迫中的作用进行系统深入的研究三

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V e c t o r a n dR N A iV e c t o r o f A t G L B1

Y A N GL i-x i a n g WA N GZ h e n g-x u n K ED e-s e n WUJ i n-x i o n g

S c h o o l o f B i o l o g i c a lS c i e n c e s,G u a n g z h o uU n i v e r s i t y,G u a n g z h o u510006,C h i n a

A b s t r a c t T h e o v e r-e x p r e s s i o na n dR N A i c o n s t r u c t so f A t G L B1w e r e c o n s t r u c t e da n d t r a n s f o r m e d i n t o A r a b i d o p s i s p l a n t sw i t h f l o r a l d i p p i n g m e t h o d.N o r t h e r nb l o t a n a l y s i s o f A t G L B1e x p r e s s i o n i nh o-m o z y g o u sT3l i n e so f t r a n s g e n i c A r a b i d o p s i s s h o w e dt h a t A t G L B1m R N A w e r en o t i d e n t i f i e d i n l i n e s e x p r e s s i n g t h e A t G L B1R N A ic o n s t r u c t,w h i l el i n e so v e r-e x p r e s s i n g A t G L B1s h o w e das u b s t a n t i a l l y h i g h l e v e l o f A t G L B1m R N Ac o m p a r e dw i t h t h ew i l d-t y p e.T h e s t u d y l a i d f o u n d a t i o n f o r f u r t h e r r e s e a r-c h e s o n t h e f u n c t i o na n da p p l i c a t i o no f A t G L B1g e n e i na g r i c u l t u r e.

K e y w o r d s A t G L B1;o v e r-e x p r e s s i o n;R N A i

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