提RNA 逆转录 qRT-PCR步骤模板
【一、提RNA】
一、实验准备:
1、试剂:75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、
2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇),放-20℃冰箱预冷;
3、预冷离心机(1.5mL EP管用的);
4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;
二、操作步骤:
01、弃上清(不回收,直接倒去);
02、1mL/孔 PBS洗两遍(不回收,直接倒去,随后用200μL枪吸尽PBS);
03、每孔加500μL Trizol,轻晃,随后室温放置2min左右;
04、枪头吹打,吸出放入1.5mL 进口EP管;
05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol);
06、4℃离心机,12000g,15min;
07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中(注意:只能吸到上清);
08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置10-30min(15min);
09、4℃离心机,12000g,10min;
10、倒掉液体,加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀;
11、4℃离心机,7500g,5min;
12、倒掉上清,加入1mL预冷的75%乙醇,混匀;
13、4℃离心机,7500g,5min;
14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠;
15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水,吹打溶解;
16、测浓度(先知楼21楼测RNA浓度,带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头);
三、注意事项
01、如果当时不测RNA浓度,可暂时把RNA放在-20℃冰箱。但长时间(>24h)保存,需要放在-80℃冰箱;
02、异丙醇作用是沉淀RNA,作用比乙醇好;
03、
04、
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08、
09、
【二、测RNA浓度】
一、实验准备:
01、先知楼21楼-2109教室,一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA 专用)、本子+笔;
二、操作步骤:
01、登记;
02、打开电脑==>打开“N”软件==>点击“Nucleic acid”==>选择“OK”==>选择“RNA”;
03、灭菌dd H2O清洗2-3遍,擦干;
04、DEPC水校零:即加DEPC水一滴,点击“Blank”,擦干;
05、测RNA:加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;
06、记录数据,包括RNA浓度(<1000ng/μL)、260/280;
07、灭菌dd H2O清洗2-3遍,擦干;
08、-80℃冰箱保存;
三、注意事项
230nm代表有机物水平(碳水化合物),260nm代表RNA 水平,280nm代表蛋白水平,260/230表示有机物量,260/280代表RNA提取量;
1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长,最佳测量值的范围为0.1-1.0。如果不在此范围,稀释或浓缩样品,使之在此范围内;如果吸光度小于0.05,检查是否存在操作因素(如移液不准确,样品内有悬浮物等)影响。DNA 样品的A260 吸光度值是否>0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值<0.1);
2.A280nm、A270nm是蛋白最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 的A260/A280比值为1.8,纯RNA为2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。比值=1.5 相当于50%蛋白质/DNA溶液.酚的最大吸收峰在270nm。
3. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长,比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA 和 RNA 的A260/A230比值为2.5。若比值小于2.0 标明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。
4. A320nm或A340nm 为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,标明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。纯样品的A320一般是0。
5. A260/A280和A260/A230 是核酸纯度的指示值。纯度好的DNA或RNA,在pH7-8.5 下A260 / A280的比值应该在2.0 或2.5。纯净的样品比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物、盐(胍盐)等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。当0.5%BSA蛋白质污染时,蛋白污染会导致260和280的数值都下降,其净结果是260/280比值下降,但260/280的比值变化并不显著,正如分子克隆3所说。但蛋白残留会导致230的数值显著上升,显著影响260/230的比值。也就是说,如果RNA样品的260/280=1.7,260 /230=0.5,那么就应该考虑污染原因不是胍盐残留,而是蛋白残留.用分光光度计测量RNA时,用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多,那样就很容易被蛋白污染,所以现在一般取400ul左右。
6.当260/230<1时,只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。
【三、逆转录】
一、实验准备:
01、进口10μL枪头(qRT-PCR专用)、冰盒一个、200μL进口 EP管;
02、冰上融化1、2、4、2号试剂(提前半小时);
03、
二、操作步骤:
试剂盒:1. 2μL
2. 0.5μL(最后加入)
3. 0.5μL
4. 0.5μL
RNA 1000ng
DEPC水
----------------10μL体系
01、200μL进口管子:EP管加相应 DEPC水==>加1号试剂(2μL)==>加3号试剂(0.5μL)==>加4号试剂(0.5μL)==>加2号试剂(0.5μL)==>加RNA==>离心==>上机;
02、上机:OPEN==>点击“User”菜单下的“clx”,点击“Accept”==>选择“run”下面的到“exp001 rt”==>修改体系“10μL”(默认为25微升)==>点击“Start”,进入界面;
03、37.0℃ 15min==>85.0℃ 5s==>4.0℃ 60min;
04、4℃冰箱保存;
三、注意事项
01、加液尽量无气泡,枪不要打到底;
02、严格冰上操作,防止RNA降解;
【qRT-PCR】
一、实验准备:
01、试剂:Roche的SyBr Green(rox)
02、1.5mL EP管、0.2mL EP管、96孔板/八连冠;10μL、20μL、100μL、200μL、2.5μL、1000μL枪;
03、冰盒一个、Rox化冻(避光)、引物化冻(GAPDH)、cDNA、DEPC水;
二、操作步骤:
01、 Rox 10μL;
+ dd H2O 6μL;
+ P1(F) 1
+ P2(R) 1
+ cDNA 2
------------20μL体系
02、计算:每个样,X个抗体(至少包括GAPDH-内参,还有目的),三个副孔。
即如果六个样,2个抗体(GAPDH,PLK1),三个副孔。6*1*3=18≈20(PLK1),6*1*3=18≈20(GAPDH);
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
6/PLK16/PLK16/PLK15/PLK15/PLK15/PLK1
6/GAP6/GAP6/GAP5/GAP5/GAP5/GAP
4/PLK14/PLK14/PLK13/PLK13/PLK13/PLK12/PLK12/PLK12/PLK11/PLK11/PLK11/PLK1 4/GAP4/GAP4/GAP3/GAP3/GAP3/GAP2/GAP2/GAP2/GAP1/GAP1/GAP1/GAP PLK1
Rox:10*20=200μL
DEPC水:6*20=120μL
F:1*20=20μL
R:1*20=20μL
GAPDH
Rox:10*20=200μL
DEPC水:6*20=120μL
F:1*20=20μL
R:1*20=20μL
03、稀释cDNA 10倍(18μL DEPC水+2μL)==>配置Mix(Rox+ DEPC水+F+R)==>加样(一横排先加18μL mix(GAPDH),随后加入18μL mix(PLK1)。
随后六个孔加同一个cDNA;
06、去除气泡:加好样后,观察有无气泡。如果有气泡,弹开,随后>2000rpm离心,时间不定(5s即可);
07、上机+设置程序:
A、双击打开程序“StepOne Software v2.1 ”==>点击“ OK ”==>点击“Ignore & Continue Startup ”==>点击“Advanced Setup ”==>进入“ Experment Properties界面”;
B、Experment Properties界面:
将Expriment Name从Untitled 修改为“日期,如2015-12-17”,将User Name(Optional)修改为“CZL”;
Which instrument are you using to run the experiment ?中选择“96 wells”,一般无需修改;
What type of experiment do you want to setup ?中选择“Quantitation-Comparative C T(△△C T)”;
Which reagents do you want to use to detect the target sequence ? 中选择“SYBR Green Reagents”;
Which ramp speed do you want to use in the instrument run ? 中选择“Fast(~
40 minutes to complete a run)”;
C、Plate Setup界面-Define Targets and Samples界面:
Define Targets栏中:如果有GAPDH、PLK1、Akt、PI3K三个引物,则点击“Add New Target ”三下,出现“Target1、Target2、Target3、Target4”三个==>将其重命名;
Define Samples栏中:如果有6个样品(N;1.5;3;6;9;12),则点击“Add New Sample”,出现“Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个==>将其重命名;
Plate Setup界面-Assign Targets and Samples界面:
GAP/1GAP/1GAP/1GAP/2GAP/2GAP/2GAP/3GAP/3GAP/3GAP/4GAP/4GAP/4 Plk1/1Plk1/1Plk1/1Plk1/2Plk1/2Plk1/2Plk1/3Plk1/3Plk1/3Plk1/4Plk1/4Plk1/4 Akt/1Akt/1Akt/1Akt/2Akt/2Akt/2Akt/3Akt/3Akt/3Akt/4Akt/4Akt/4 PI3K/1PI3K/1PI3K/1PI3K/2PI3K/2PI3K/2PI3K/3PI3K/3PI3K/3PI3K/4PI3K/4PI3K/4 GAP/5GAP/5GAP/5GAP/6GAP/6GAP/6
Plk1/5Plk1/5Plk1/5Plk1/6Plk1/6Plk1/6
Akt/5Akt/5Akt/5Akt/6Akt/6Akt/6
PI3K/5PI3K/5PI3K/5PI3K/6PI3K/6PI3K/6
D、Run Method界面:设置温度;随后修改“Reaction Volume Per Well”,将其改为“20μL体系”;
E、点击“Start Run”
三、注意事项
01、注意一定要禁止气泡。
吸液体时,观察枪头中有没有气泡和液体;打加入液体时,延管壁加入,枪头只能打到第一档,随后观察枪头有没有打尽;
02、加入引物时,一定要涡旋混匀;
03、Rox加入后,一定要避光;
04、加入的液体一定要等量;