细胞培养实验室操作准则2014.10版
细胞培养实验室操作准则
任何首次准备开展细胞实验的人员必须首先认真阅读以下准则，然后在已经熟练掌握细胞培养操作技术人员的指导下开始进行细胞实验，并在以后的实验过
程中严格遵守各项准则。
一、细胞实验准备
1.进入细胞房前要换鞋，穿无菌服（干净实验工作服），戴手套，接触细胞前喷75%酒精消毒手套。
2.将所需实验用品：培养基（完全培养基、空白培养基）、胰酶（含ETTA）、枪头（1ml、200ul、10ul)、离心管，预先放置到超净工作台，打开紫外照射30min 后开始细胞实验。
3.观察细胞前，用75%酒精纱布擦拭显微镜镜头及台面，进行消毒后方可开始观察细胞。
4.观察细胞主要包括：细胞数量（汇合度）、形态、分布情况（是否均匀）、有无漂浮的死细胞和污染等，观察完及时放回培养箱。（如图，汇合度约90%，分布均匀）
5.每次开始细胞实验前，需关闭紫外照射，打开超净台风机及灯。用含75%酒精的纱布擦拭超净工作台。超净台内物品放置情况：左侧（各式枪头，及可常温放置的试剂如PBS等），右侧（5ml枪头及镊子），废弃瓶位于右上角，尽可能远离操作区域，正前方为枪和酒精灯，培养基及胰酶放置左侧便于取用。
6.超净台在使用前后，都需用含75%酒精的纱布擦拭台面至纱布上看不到明显脏物为止，每天操作后废液缸需清洗用紫外照射，此外，从外面拿进超净台的东西都要喷75%酒精消毒。
7、每周四需更换培养箱中高压过的超纯水，每周五对超净台（包括风机）、细胞培养房卫生进行打扫，每月对培养箱进行消毒清洗，确保细胞不受污染。
8、检查培养箱的CO2含量是否正常，如出现异常及时联系细胞平台相关负责人。
9、5mL枪头清洗高压的流程:(1)用洗洁精将枪头超声一遍（2）更换干净的自来水超声清洗3遍（3）用超纯水超声清洗1遍（4）将枪头捞出后再用超纯水荡洗3遍（5）放入烘干箱烘干（6）装在铁盒中，注意枪头放置顺序一致，放入高压锅，选择橡胶类（7）高压后放入烘干箱烘干后方可拿入细胞房使用
1ml、200ul、10ul装入枪盒后放入高压锅高压烘干后方可拿入细胞房使用
二、细胞传代
1.细胞传代前要观察细胞，细胞汇合度达到80%-90%时可以进行传代。图片
2.以25cm2培养瓶为例：打开培养瓶瓶盖，将盖子地面朝下放在超净台台面上，然后将培养瓶倾斜，用量程5ml的枪将旧培养基吸走，然后用量程1ml枪加1ml 空白培养基轻轻摇匀清洗，用5ml枪将清洗的培养基吸走。注：75cm2加3ml空白培养基清洗
3.加入胰酶（含EDTA）500ul；然后轻轻摇晃培养瓶，注意让所有细胞都要接触到胰酶，放入37度培养箱消化。注：75㎡大瓶加1500ul胰酶、6孔板加300ul 胰酶、12孔板加200ul胰酶
4.消化时间长短根据不同细胞有不同选择，镜下观察大部分细胞变圆，见大部分细胞脱落即可终止消化。
5.25cm2培养瓶加入2ml完全培养基终止消化。注：75cm2培养瓶加5ml完全培养基终止消化、6孔板加1.5ml完全培养基终止消化、12孔板加1ml完全培养基终止消化。
6.用5ml枪头轻轻吹打细胞后，观察底部大部分细胞已脱落，然后倾斜培养瓶，将细胞混悬液转移到15ml离心管，800r/min条件下离心3min。
7.离心时，准备新的培养瓶，标记好细胞的名称、日期、代数。
8.离心结束后，弃上清液。缓缓沿壁加入5ml新鲜的完全培养基，计数（方法参见后面）。
9.重悬细胞，用量程5ml枪，枪打到第一档，深入管底部，轻轻吸取离心管底部的整个沉淀的细胞团和培养基，然后沿管壁缓慢匀速打下，枪头随着液面的的上升而逐渐上提，这样可避免产生气泡。按此方法反复几次，待细胞混匀后，吸取细胞混悬液，加入新培养瓶，按所需比例进行传代即可。
细胞传代的比例是根据所需细胞的数量以及时间来决定。如需急用可用低的比例（1:2,1:3）传代，并每天换液，如时间充裕，不用时可适量加大传代比例（1:4,1:5），并3天换液，减少细胞的代数，暂时不用细胞只需留一小瓶培养即可。
10.进行十字型摇匀，有序放入培养箱中。
注意事项：
1、需要进行细胞实验前，合理扩大培养，尽量安排在同一代数情况下做实验。
2、在进行细胞实验时，不可同时处理两种及以上细胞，避免交叉污染。
三、细胞计数：（计数前操作与传代相同）
1、消化后的细胞充分混匀后，用10ul枪吸取l0ul细胞混悬液，再吸取10ul 台盼蓝，在1.5ml离心管中将两者混和均匀后，将20ul混合液注入计数板。
2、打开计数器，确认红色指示灯亮起，蓝色指示灯在第几格，一般为第一格，旋转选择正确区域。
3、打开计数软件“count star”,标明日期及细胞名称，选择比例1:1，细胞类型为，注意观察细胞分布，如果不均匀，应重新混匀后计数。
4、记录内容：细胞总数，死细胞数，细胞活力（一般活力在95%以上）及活细胞数。（活细胞数用于计算接板所需的细胞量）
5、将计数板及时从count star取出，关闭软件，计数完成。
四、细胞接种：
1、细胞计数完后，正确计算所需的细胞量和培养基的量，取一洁净的皿，将细胞混悬液和完全培养基分别加入皿内。
2、混匀：先用5ml枪混匀，然后取排枪混匀后，先加一孔到96孔板中，去镜下观察分布是否均匀，如若不均匀需再次混匀，确保均匀后再加入。避免产生气泡，如有少许气泡可用10ul枪头戳破。每次吸取液体后需观察高度是否一致和准确。
3、对于接板的细胞，96孔板可先静置一会再放入培养箱，避免摇动，以免细胞
集中在中央。
例如：需接一块96孔板，细胞密度为0.5*105，细胞计数----活细胞数为5*105个/ml
需稀释的倍数为5*105除以0.5*105等于10倍，一块96孔板需要12ml，故需细胞悬液的体积为12ml除以稀释位数10等于1.2ml，其余的量用完全培养基补足。
注意事项：
无论是接种在6孔板、12孔板、24孔板和96孔，培养皿或者培养瓶中，都需要先加入一孔、一个培养皿或一个培养瓶在镜下观察细胞悬液分布是否均匀，若发现细胞有抱团、成束现象需重新混匀后方可接种。
附不同板底面积
五、细胞冻存：
1、订购新细胞之前需查阅相关的文献，选择合适的细胞，并仔细阅读说明书（培养的条件包括培养基等），准备好细胞培养所需的相关试剂及耗材。
1、买来后传一个25cm2小瓶，记为第一代---P0，若细胞状态不好可每天换液，长满后1:3传3个小瓶，记为第一代P1，然后根据细胞的生长速度长满后按1:6传6个大瓶，记为P2，保种5大瓶，另一大瓶可开始用于实验，以此类推，详细记录细胞的代数。冻存时写上细胞名称、冻存日期及细胞的代数。
2、细胞消化离心后，去掉上清液，快速加入冻存液，充分混匀后装入冻存管。
3、一般一瓶75cm2的瓶子可冻存3-4小管，标号细胞名称，冻存日期和细胞代数，用封口膜封口，放入程序性降温盒置于-80℃冰箱过夜，第二天置于液氮中
保存。
4、放入液氮时，注意放入正确的位置，记录好冻存细胞的位置，顺序按时间先后排，时间前的放外面。
六、细胞复苏
1、复苏前准备：将所需物品放入超净台，打开紫外照射约半小时，75%酒精擦拭台面。
2、准备15ml离心管，加入5ml培养基。
3、提前打开37℃水浴锅预热，从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其全部融化，更换新手套。
4、用75%酒精喷洒冻存管后，擦拭台面，打开盖子，1ml枪头吸出细胞悬液，加到含培养基的离心管，充分混匀；
5、离心，800r，3min；
6、弃去上清液，重悬细胞，加入完全培养基到25cm2的小瓶子，在显微镜下观察细胞状态，然后放入37℃培养箱静置培养；
7、注意观察细胞状态，及时换液。
8、细胞复苏后，根据细胞的特性，按适当的比例传到75cm2的大瓶子，每天换液，长满后立即保种，并记录细胞的代数，细胞状态稳定后方可开始实验。
8、复苏后观察细胞如果发现一小瓶有很多细胞，立即传到大瓶子
七、细胞加药
(完整word版)2015 动物细胞培养技术实验报告
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞工程知识点
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
动物细胞培养基本操作
实验一动物细胞培养 细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。 细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。 细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等 为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。 本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。 Ⅰ清洗与灭菌 一、实验目的 能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。 二、实验原理 清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。 三、实验材料、用品
细胞培养基础知识详解-细胞的复苏、传代和冻存
细胞培养基础知识详解 细胞的复苏、传代和冻存实验操作指导 整理：江耀伦李美娣 1 细胞复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 1.1实验前准备 （1）将水浴锅预热至37℃ （2）用75％酒精擦拭紫外线照射30min的生物安全柜内部台面。 （3）在生物安全柜中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 1.2 细胞复苏培养 （1）根据细胞冻存记录取出需要复苏的细胞。 （2）迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 （3）约1-2 min后冻存管内液体完全溶解，取出放入离心机中以1000 rpm/min速度离心3~5 min。 （4）用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入生物安全柜内。吸弃上清液，向离心管内加入1 mL培养液，吹打制成细胞悬液。 （5）将细胞悬液分装入培养瓶或者培养皿内，将培养瓶/培养皿放入37℃，5％ CO2的培养箱内过夜后换液继续培养，换液的时间由细胞情况而定。 1.3 初学者易犯错误 （1）水浴锅未预热或者未预热到37℃。 （2）水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 （3）离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 （4）一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 1.4 细胞传代 1.4.1 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶
子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的生物安全柜内台面和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4.2 细胞传代 （1）取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入生物安全柜内。 （2）从培养箱内取出细胞：注意培养瓶取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （3）将培养瓶放入生物安全柜后打开瓶口，同时用酒精棉擦拭瓶口消毒。 （4）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （5）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （6）弃去胰蛋白酶液，加入新鲜的培养液终止反应。小心吹打成细胞悬液。 （7）将细胞悬液吸入10 mL离心管中。平衡后将离心管放入离心机中，以1000 rpm/min离心5 min。 （8）弃去上清液，加入适当体积的培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 （9）将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （10）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/mL。最后要做好标记。 （11）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养，传代细胞2-4 h后开始贴附在瓶壁上。 1.4.3 注意事项 （1）严格的无菌操作 （2）适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能 无菌操作基本技术 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力 5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。 实验用品 1. 种类︰ 1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。 1.2. TC 级培养盘表面均有coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask, plates, dishes, roller bottle 等，依实验需要使用。 1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml 1.4. 塑料离心管: 15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP) 为不透 明材质，polystyrene (PS) 为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。 1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。 1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100 ml, 250 ml,500 ml,1000 ml 2. 清洗︰ 2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。 2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。 3. 灭菌︰ 3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121 oC, 15 lb, 20 分钟，置于
细胞培养技术考试重点
名词解释： 1.群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。是由于表示群体细胞指数生长期内细胞分裂活动的程度，是判断细胞生长是否旺盛的重要指标。 2.接触抑制（contact inhibition）：细胞相互接触后失去运动的现象。 3.密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多和生存空间消失所引起的细胞增殖的抑制现象。 4.肿瘤干细胞(tu mor stem cells，TSC)表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能。TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。 5.细胞汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 6.饱和密度(Saturation density)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细 胞悬液内可达到的最大细胞数。 7.二倍体细胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。 8.二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。 9.组织工程：是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 10.细胞融合(Cell fusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。 11.细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 12.三维培养：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。 13.平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）：简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。兼具缓冲和调节溶液的酸碱度、维持渗透压、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。 14.生长基质（growth substratum）：培养器皿表面包被的一层能改善生长表面的特性，促进细胞粘附和贴壁的物质。 15.去分化（dedifferentiation）：指已成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。 16.消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。 17.消毒 disinfection 杀死物体上病原微生物的方法。 灭菌 s terilization 杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 18.转化细胞系：指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定的表型改变的细胞系。 19.杂交瘤技术：又称单克隆抗体制备技术，是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴 细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。 20.指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 21.干细胞：是指具有无限或较长期的自我更新能力、多种分化潜能和高度增殖能力的细胞。 22.全能干细胞，如ES细胞。全能干细胞可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的 各种组织和器官。
细胞培养基本操作
细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细 胞的过程。细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。 一、实验前准备 实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。 消毒双手和超净台。取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。 水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。 注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。 二、制备细胞悬液 吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。 离心：1000rpm，室温离心3min。 注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。 三、细胞培养 离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。 四、注意事项 1、解冻速度要快 在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻 存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 2、一次复苏细胞不宜过多 细胞在解冻时，需要迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。并且一次复苏细胞过多，容易忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 3、培养瓶上注明细胞类型，日期，人名。
动物细胞培养技术实验
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
细胞培养操作步骤
培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管 所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精…… 实验前准备： 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。 2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶 口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消 毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。 4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器 上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。 5.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出 实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 6.将培养瓶放于28℃,5%CO2的培养箱内培养，旋开瓶口少许。注意整个培养箱 底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h，瓶盖拧紧后拿出培养箱，置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况，及细胞形态。最后更换培养液。 二、培养液的更换
细胞培养实验室的设置及设备
一、细胞培养实验室的设置及设备 （一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。
无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。 空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。 表1 洁净室（区）空气洁净度级别表 洁净度级别尘粒最大允许数／立方米微生物最大允许数浮游菌／立方米沉降菌／皿 100级3,500 0 5 1 10000级350,000 2,000 100 3 100000级3,500,000 20,000 500 10 300000级10,350,000 60,000 - 15 无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。
细胞培养实验室构建方案-new
细胞培养实验室构建方案 （一）细胞培养实验室的设置 细胞培养实验室与其他一般实验室的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。 细胞培养实验室应分为以下几个区：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 1．无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰，一般地理位置在最后部分。 理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 （2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式b)外流式或称水平层流式。 净化工作台工作原理（大致相同）――通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 净化工作台应用注意： （1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。 （2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。 （3）使用净化工作台前，应先用75％酒精擦洗台面，并提前以紫外线灭菌灯照射30～50min处理净化工作区内积存的微生物。关闭灭菌灯后应启动风机使之运转两分钟后再进行培养操作。 （4）净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流流型不受干扰。
常用的五种动物细胞培养方式
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
动物组织细胞培养实验室的设计
（一）细胞培养实验室的设置 组织细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。目前，超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。 细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。 01 无菌操作区 （1）无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。理想的无菌操作室应划为三部分： a) 更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 b) 缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。 c) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。其大小要适当，且其顶部不宜过高（不超过2.5m）以保证紫外线的有效灭菌效果；墙壁光滑无死角以便清洁和消毒。工作台安置不应靠墙壁，台面要光滑压塑作表面，漆成白色或灰色以利于解剖组织及酚红显示pH的观察。 无菌操作间的空气消毒： 紫外线灯—－产生臭氧，并且室内温度及湿度均较高，不利于工作人员健康。空气过滤的恒温恒湿装置—－最好。
无臭氧紫外线消毒器 电子消毒灭菌器—－在高压电场作用下，电子管的内外电极发生强烈电子轰击，使空气电离而将空气中的氧转换成臭氧。臭氧是一种强氧化剂，能同细菌的胞膜及酶蛋白氢硫基进行氧化分解反应，从而靠臭氧气体弥漫性扩散达到杀菌之目的，消毒时没有死角。消毒后空间的残留臭氧只需30～40min即能自行还原成氧气，空气不留异味，消毒物体表面不留残毒。 （2）净化工作台：操作简单，安装方便，占用空间小且净化效果很好。一般细菌培养室使用的净化工作台主要有两种：a)侧流式或称垂直式 b)外流式或称水平层流式。 净化工作台工作原理（大致相同）—－通常是将室内空气经粗过滤器初滤，由离心风机压入静压箱，再经高效空气过滤器精滤，由此送出的洁净气流以一定的均匀的断面风速通过无菌区，从而形成无尘无菌的高洁净度工作环境。 侧流式工作台—－空气净化后的气流由左或右侧通过工作台面流向对侧，也有从上向下或从下向上流向对侧，形成气流屏障保持工作区无菌。工作台结构为封闭式。 外流式（水平式）工作台—－净化后的空气面向操作者流动，因而外方气流不致混入操作，但进行有害物质实验操作则对操作者不利。工作台结构为开放式（已少用）。 净化工作台应用注意： （1）净化工作台应安装在隔离好的无菌间或清洁无尘的房间内，以免尘土过多易使过滤器阻塞，降低净化效果，缩短其使用寿命。 （2）新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁工作，然后再采用药物灭菌法或紫外线灭菌进行灭菌处理。
细胞实验室
一．建设方案之动物细胞培养实验室（设备片） 在生命科学科领域中细胞学有着至关重要的地位，近年来细胞学发展迅速，并取得了相当大的进展，细胞学相关实验室的建设也是各个研究院及院校生物学科必备的实验室。 细胞相关实验所需仪器及耗材种类繁多，接下来就细胞培养实验室常用仪器作下简单介绍：一、纯水系统 细胞培养用水一般要求双蒸水（0.8MΩ以上），实际上普通蒸馏水经玻璃器皿中按标准方法蒸馏二次得到的双蒸水是不能满足要求的，而且水中的内毒素直接参与细胞凋亡，血清中内毒素含量越低，对细胞毒性越小，越利于细胞的生长和传代；内毒素含量过高，会直接导致细胞提前老化。因此建议配置正式的水纯化系统。 二、液氮罐 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃，因此，需要液氮罐。在此环境中，一般细胞可以保存十年具有活性。 三、超净工作台/生物安全柜 细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行，因此超净工作台或生物安全柜就必须配备。 四、CO2培养箱 CO2培养箱是细胞培养的必备仪器，它为细胞提供了一个体外培养的舒适环境，如适宜的温度、湿度、酸碱度、O2浓度等。细胞在体外培养时很容易受到各种细菌、微生物的感染，因此，CO2培养箱的灭菌和抑菌能力就显得尤为重要。 五、恒温水浴 从液氮或超低温冰箱中取出细胞冻存管需要立即放于37℃水浴中快速复苏之后才传代培养，因此，恒温水浴也是细胞实验室必备仪器。 六、超低温冰箱 细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般4℃下存放30 min，转放-20℃ 1 hour，再转入-70至-80℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)，这时就必须配备一台-86℃超低温冰箱。一般超低温冰箱保存细胞可达数月，对于不需要长期冻存的细胞，可暂时放于超低温冰箱保存。 七、离心机 细胞培养需要离心收集传代细胞，所以需要配置低速的常温离心机，对于后期细胞内容物的
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细胞培养技术练习题 选择题 1.接种工具灭菌常采用（A） A. 灼烧 B. 高压 C.过滤 D.熏蒸 2.具有促进愈伤组织生产的物质是（ B ） A. 维生素 PP B. 维生素 B1 C.维生素 B6 D. 甘氨酸 3.微量元素母液的配制浓度（ B ） A.10 倍 B.100 倍 C.1mg/ml D.10mg/ml 4.配制 10 倍大量元素母液，所需硝酸铵（ C ） mg A.9000 B.3700 C.16500 D.4400 5.配制 100 倍有机物母液时，所需维生素B1 ( B )mg A.0.4 B.10 C.100 D.0.1 6.下列哪种不是组织培养常用的维生素（ A ） A. 维生素 B 2 B. 维生素 B 1 C.维生素 B6 D.维生素 C 7.下列哪种激素不属于生长素类（ C ） A.IAA B.IBA C.6-BA D.NAA 8.下面哪种是MS 培养基大量元素所用药剂（A） A.硫酸镁 B.硫酸亚铁 C. 硫酸锌 D.硫酸铜填空： 1、组织块的分离方法有机械分散法、剪切分离法、消化分离法。 2、目前，较常用的消化试剂有胰蛋白酶、胶原酶、EDTA 消化液。 3、接种培养瓶的细胞数量一般为5× 105-1× 106/ml。 4、培养细胞的污染一般包括微生物污染、细胞交叉污染、化学物质的污染。 5、细胞冻存时DMSO 常用的浓度为10%的浓度。 1. 体外培养的动物细胞其生长方式主要贴壁生长和悬浮生长两种，分别称为贴壁型细胞和悬浮型细胞。体外培养的动物细胞其生长方式以贴附生长为主。 2. 贴壁生长的体外培养动物细胞，按形态来分，大体分为成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形细胞型四种类型，最常见的为前两种。 3. 细胞在体外生长时具有一些特点，其中主要是贴附生长、接触抑制和密度依赖性。 4. 培养细胞生命期可分为原代培养期、传代培养期、衰退期三个阶段。 名词解释1、原代培养：原代培养也叫初代培养，是从供体进行细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。 2、组织块培养法：组织块培养是将组织剪切成小块后，接种于培养瓶进行培养。组织块培养法是常用的，简便易行的以 及成功率较高的原代培养方法。3、消化培养法：消化培养法是采用组织消化分散法将细胞间质包括基质、纤维等妨碍细 胞生长的物质去除，使细胞分散，形成悬液，从而易于外界吸收养分和排出代谢产物. 4、细胞生长曲线：细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细 胞生物学特性的基本参数之一。以培养时间为横轴，细胞浓度为纵轴作图，即得生长曲线。 5、传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。 问答题： 1、如何得到单细胞无性系？在细胞培养中，常由分散性较好的愈伤组织或悬浮培养物来制备单细胞，也可 以用纤维素酶和果胶酸酶从植物不同组织直接制备单细胞。由分离的单细胞经看护培养法、微室培养法或平板培养法， 即可得到单细胞无性系 2、单细胞培养有哪些方法？各有何含义及特点单细胞培养：看护培养；微室培养；平板培养 （ 1）看护培养法是指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 特点：①简便易行。②效果好，易于成功。③不能在显微镜下直接观察细胞生长过程。 （2）微室培养：即将细胞培养在很少量的培养基中。 特点：在培养过程中可连续进行显微观察，将一个细胞的生长、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来。 （3）平板培养法是把单细胞悬浮液与融化的琼脂培养基均匀混合，平铺一薄层在培养基底上的培养方 法。特点：可以定点观察；分离单细胞系比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换不畅。 3、说明每一种单细胞培养方法的要点？ （ 1）看护培养：①小三角瓶中加1cm 厚的固体培养基，灭菌②将 1cm 大小的愈伤组织块放在培养基中央。③在愈伤组织块上放 1cm2 无菌滤纸片，培养室中过夜④将单个细胞接种在滤纸上面⑤培养室培养f1 个月可见愈伤组织小块， 2-3 个月得到单细胞无性繁殖系。（ 2）微室培养：①载玻片和盖玻片火焰上消毒②在载玻片上涂一圈四环素眼膏，放一小段毛 细管。滴一小滴细胞悬浮液于凹穴中③盖上盖玻片，使之与悬浮液接触（3）平板培养：①制备单细胞悬浮液：用酶法或 机械震荡法将组织器官游离出单细胞。经过滤后的滤液即是。②悬浮液密度的调制： a 通过显微镜，观察记数板凹槽中 的悬浮液细胞数，并计算其密度。 b 一般平板培养要求细胞密度为1′103-1 ′105。③培养基的配制： 1）1.4%琼脂培养基 ; 2)0.7% 琼脂的条件培养基。④平板制作：按1:2 或 1:4 混合，制成 3mm厚的平板。⑤培养： 26°C 暗培养 21d，计算细胞团数，计算植板率 4、什么是细胞悬浮培养？简述成批培养和连续培养的的特点？细胞悬浮培养：是使离体的植物细胞悬浮在液体培养基 中进行的无菌培养。（ 1）成批培养的特点：①细胞生长在固定体积的培养基上，直至养分耗尽②用搅拌的方法使细胞团 和细胞均匀分布③细胞数目呈现慢—快—慢—停止生长的变化 d 必须更换新鲜培养基才能进行下一批培养（ 2）连续培养的特点：①由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象②可在培养期 间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快③适于大规模工业化生产
动物细胞培养及应用发展史
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。