河北科技大学仪器分析

现有五肽,在280nm处有吸收峰,中性溶液中朝阴极方向泳动;用FDNB测得与之反应的氨基酸为Pro; carboxy-peptidase进行处理,第一个游离出来的氨基酸为Leu;用胰凝乳蛋白酶处理得到两个片段,分别为两肽和三肽,其中三肽在280nm处有吸收峰;用CNBr处理也得到两个片段,分别为两肽和三肽;用胰蛋白酶处理后游离了一个氨基酸;组成分析结果表明,五肽中不含Arg. 试定该短肽的氨基酸序列.

本人总结：仪器分析及波谱分析总结

仪器分析名词解释有：红移、蓝移、程序升温、梯度淋洗、尺寸排阻色谱（凝胶色谱）、朗伯比尔定律、正向色谱。反向色谱。

蓝移和红移：针对的是具有共轭结构的物质在不同条件下（比如不同的酸性、碱性等条件下）的共轭结构发生改变，从而导致最大吸收波长发生移动，共轭结构越大发生红移，反之发生蓝移。共轭有p-π、n-π、σ-π共轭。含有孤对电子的N、S、O等存在孤对电子易发生p-π共轭。（红移和蓝移为去年考题）

苯胺和盐酸反应成盐后会发生蓝移还是红移为什么？（与去年考题相类似）

苯胺中的N近乎sp2杂化（实际上还是sp3杂化），孤对电子占据的轨道可与苯环共轭（发生p-π共轭），电子云可分散于苯环上，使氮周围的电子云密度减小。

在盐酸存在条件下，苯胺和盐酸生成苯胺的盐酸盐，苯胺上的孤对电子为盐酸和苯酐共用，p-π共轭消失，最大吸收波长变短，向短波长方向移动即发生蓝移。

程序升温：根据不同物质汽化温度不同，温度随时间线性或者非线性的升温，将不同汽化温度的物质分离，从而达到测定含量。

梯度淋洗：根据不同物质极性不同，通过改变流动相的配比来改变流动相的极性，根据相似相溶原理将不同极性的物质分离，从而定量分析。朗伯比尔定律：可以通过计算吸光系数及强度

不饱和度：体现分子内部不饱和键的多少情况。双波长法定量；用于两种混合物的定量。

步骤：

（1）在波长λ1时根据朗伯比尔定律测定纯的物质a和b的吸光系数，得到ελ1a、ελ1b（为常数），为测定计算值

（2）在波长λ2时根据朗伯比尔定律测定纯的物质a和b的吸光系数，得到ελ2a 、ελ2b（为常数），为测定计算值

（3）在波长λ1时根据朗伯比尔定律测定混合物的吸收得到公式Aλ1a+b=ca×L×ελ1a＋cb×L×ελ1b（4）在波长2时根据朗伯

比尔定律测定混合物的吸收得到公式Aλ2a+b=ca×L×ελ2＋cb×L×ελ 2 b Aλ1a+b、Aλ2a+b、ελ1a、ελ1b、ελ2a 、ελ2b、L 为常数，以上两式联立，两个公式，两个未知数，可以解得ca、cb。

原子吸收光谱定量分析方法：

方法一：标准曲线法

步骤：以苯甲醇为例

（1）绘制标准曲线：准确称量4~7份不同质量的苯甲醇，溶解后配置成4~7份稀溶液（因为使用朗伯比尔定律的前提是稀溶液），再在苯甲醇的最大吸收波长λ处分别测定前面配置的稀溶液的吸光度A。以A为纵坐标，被测物质的浓度C为横坐标，绘制A~C标准曲线。

（2）在相同实验条件下测定试样溶液的吸光度AX，再在绘制的标准曲线上查得试样溶液的浓度CX，不过该方法为读取的数据，存在较大的误差。

方法二：标准加入法（去年考题）

（1）取相同体积的试样溶液两份，分别移入容量瓶A、B中。

（2）另取一定量的标准溶液加入B中，之后将两份溶液定容。

（3）在相同条件下，测出A、B两份溶液的吸光度。设A瓶中待测物质浓度为CX，B瓶中的加入的标准物质的浓度为CO（CO通过计算可以得到），A瓶中溶液吸光度为AX，B瓶

中的吸光度为AO，则得到AX=KCX 和AO=K(CX+CO)（其中K=ε×L）两个式子作比AX/Ao=CX/( CX+CO)

解得CX即可得到含量。

色谱分类

气相色谱、液相色谱、高效液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、凝胶色谱、聚酰胺吸附色谱等为常用方法凝胶色谱的分离原理：分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。即分子量大小不同的化合物，在三维网状结构的空间里（类似于立体结构的筛子）小分子容易进入网状结构内部，大分子在网状结构的表面，在流动相的洗脱（冲洗）作用下，大分子在表面运动，小分子在内部运动，内部阻力大，外部阻力小，流动相先将大分子洗脱出来，先出峰。小分子后洗脱出来，后出峰。从而达到定量分析。

凝胶色谱使用范围：适用于大分子物质和小分子物质的定性，定量分析。比如青霉素内聚合物含量的测定以及血液中的蛋白质和小分子物质糖类等的分离定量。聚酰胺吸附色谱的分离原理：原理：氢键吸附。一般认为系通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。

简述正相色谱和反相色谱分离化合物的异同点。(好像去年考来着）

正相分配色谱：固定相：水、缓冲溶液

流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂

洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之化合物极性越大，越后出柱。

应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。

反相分配色谱：固定相：石蜡油、化学键合固定相

流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂

洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之化合物极性越小，越后出柱。应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等

色谱定性定量方法：

多组分定性：步骤：

（1）系统适应性试验（通俗讲就是寻找何种极性的混合洗脱剂能够将混合物洗脱分离或者用某种混合液能否将混合物分开）

比如：以ＨＰＬＣ将Ａ、Ｂ的混合物分离定性为例，用某种标准展开剂，在薄层板上进行点样展开，即进行薄层色谱（ＴＬＣ）。看看哪种展开剂能够将Ａ、Ｂ两种物质分开，且有适宜Rf值（比移值）。假设为标准展开剂合适的展开剂，用作洗脱液。则可以进行色谱分离定性。分离前提是相对保留值大于１.

（２）进行色谱出峰后根据保留时间，该实验同等实验条件下的波谱对比，可知道混合物各自为哪些物质。

定量方法：根据色谱图上各个吸收峰，可将各个吸收峰积分，求和，计算比例（一般液相色谱仪在吸收峰上右击可查看各物质的含量）。

紫外-可见吸收光谱：一般测定的是物质的共轭结构多少，共轭结构过多，会发生红移，吸收波长达到可见区域（大于400nm），物质就会显色，物质体现出的颜色为其吸收光颜色的互补色。比如右图为酞菁染料的分子式。

红外光谱：体现出分子内官能团的吸收，可以一次判断有哪些官能团。

质谱：体现出的是分子碎片的质核比，或者是分子离子峰的质核比，一般最大的质核比为分子量，也有特殊情况会发生曼氏重排等，测出的不是分子量。

核磁：核磁体现的是C、H图谱，有数种，一般考察为氢谱和碳谱，氢可以判定哪两个氢连

在相邻的两个碳上。根据氢谱可以推断氢所连的碳是哪一种，比如说甲基、亚甲基等。根据氢谱可以确定氢的种类，比如说羟基上的氢、醛基上的氢等。碳谱可以确定谈的种类，比如说羰基碳等。碳谱中的偏共振去偶谱可以判断碳是伯仲叔季碳（即该碳连接着几个碳）。还可以根据C-H图谱分析哪个碳与哪种氢相连。

注：不可能依据一个图谱可以确定复杂物质的结构式，通常是紫外-可见光谱、红外光谱、质谱、核磁四中方法相互佐证，猜出结构。猜出结构后需要对结构式反推验证机构是否正确。以下问题不会考，是对仪器分析各种光谱运用的价值的介绍

紫外-可见吸收光谱【意义】对于分子中含有共轭双键、α，β不饱和羰基结构的化合物以及芳香化合物的结构鉴定来说是一种重要的手段。通常主要用于判断化合物的骨架类型，在某种情况下如黄酮，香豆素类化合物，可用于测定化合物的精细结构。

红外光谱【意义】IR是化合物分子结构的客观反映，如未知物与已知物的IR完全一样，即可确定为此化合物。未知物可根据各种基团的（振动频率）吸收峰的位移（波长）和吸收峰位置移动的规律，推测分子中的功能基、化合物类型、结构异构，区别芳环的取代图式及构型、构象。

质谱【意义】（1）测定分子量，确定分子式（2）通过碎片离子的m/z推测结构或复核分子的部分结构. 质谱是把化合物分子用一定反式裂解后生成的各种离子，按其质量大小排列而成的图谱。以离子的质荷比（m/z）为序。

核磁【意义】NMR是具有磁矩的原子核（1H ，13C等）在磁场的作用下以射频进行照射，产生能级的跃迁而获得的共振信号。从而对H、C所处的化学环境进行分析。