血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展

胱抑素C是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并完全降解，而肾脏是清除循环中胱抑素C的惟一器官，血清胱抑素C浓度主要由肾小球滤过率决定。此外，血清胱抑素C检测不受年龄、性别、炎症、饮食、体重以及肝功能变化的影响。由此可见，胱抑素C是一种理想的反映肾小球滤过率变化的内源性标志物。

肾小球受损时血中的Cys C升高比较显著，肾小球、肾小管均受损时，血、尿中的Cys C 均升高比较显著，有利于临床医生判断肾小球、肾小管是否受损，以便及时采取相应的治疗措施。

血清胱抑素C测定的临床意义及方法学进展

摘要在肾小球滤过功能试验中，血清肌酐、尿素及内生肌酐清除率是最常用的指标。由于以上指标尚存诸多不足，故人们一直在寻找新的反映肾小球滤过率变化的指标。胱抑素 c 是一种低分子量蛋白质，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素 c仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的理想的内源性标志物。血清胱抑素 c浓度在作为肾功能试验时优于血清肌酐浓度。至于胱抑素 c测定的方法学，已有快速、简便且可自动化的“颗粒加强免疫比浊法”的最新报道，使血清胱抑素 c测定的广泛临床应用成为可能。

关键词：胱抑素 c；肾功能试验； gFR；肌酐

胱抑素 c（ cystatin c）是一种低分子量蛋白质， grubb等首先报道其血清浓度与 gFR 密切相关，可作为肾小球滤过功能指标[1]。近年来有关胱抑素 c测定的临床应用及方法报道日渐增多，本文就胱抑素 c的结构与功能，作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物及方法学进展作一综述。

1胱抑素 c的结构与功能

胱抑素 c，以前也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13KDa,由120个氨基酸残基组成，是一种分泌性蛋白质。细胞先合成一个带信号肽的前体蛋白，编码胱抑素 c的基因位于人类第20号染色体，大约为4.3Kb，包含3个外显子，基因上游45-50核苷酸处为“ tATA盒样”序列（ aTAAAA）。胱抑素 c基因5′-侧翼区 gC含量较高，转录起始位点上游400bp序列的 g+C＞70%，富含 gC的“岛”也包括外显子1及内含子1、5′侧的一部分，整个富含gC“岛”约900bp， g+C含量为73%。此区域 cpG/GpC比值接近于1，因此此区 cpG是非甲基化的。在胱抑素 c基因5′侧翼1Kb 序列中发现了2个“ gC盒”（ gGGCGG），此区也发现了增强子核心样序列（ gTGGAAGG）。

由以上可见，胱抑素 c基因5′侧翼序列与“看家基因”的启动子区具有相同的特性，即缺乏典型的“ cAAT盒”、富含 gC、有与转录因子 spl结合的“ gC盒”。故可将胱抑素 c 基因看作是“看家基因”（ house-keeping gene），即此基因在所有组织恒定持续地转录及表达。 northernx印迹也发现胱抑素 c基因在所有的被观察的组织均表达，包括肾、肝、胰、肠、胃、肺及胎盘

[2]。

由于胱抑素 c是一种分泌性蛋白质，故广泛地存在于各种体液中，如脑脊液、血液、唾液、精浆等。至于胱抑素 c的确切生物学功能目前还了解不多，研究发现胱抑素 c是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成员之一，是目前发现的对组织蛋白酶 b抑制作用最强的抑制物，对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、组织蛋白酶 h及 l也有抑制作用，故胱抑素 c的一个生理学功能可能是调节半胱氨酸蛋白酶的活性。胱抑素 c基因突变可导致遗传性胱抑素c淀粉样血管病（ hCCAA），可发生脑动脉血管破裂，这是目前发现的直接与胱抑素 c相关的临床疾病。

2胱抑素 c作为反映肾小球滤过功能的内源性标志物

由于胱抑素 c基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体胱抑素 c产生率相当恒定。因胱抑素 c是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素 c的唯一器官，所以血清胱抑素 c浓度主要由 gFR决定，由此可见胱抑素 c是一种理想的反映 gFR变化的内源性标志物。

grubb及 simonsen等[1]首先研究了血中低分子量蛋白质（β2-微球蛋白、视黄醇结合蛋白、胱抑素 c）浓度与 gFR（51 cr-EDTA清除率）的相关性，发现血清胱抑素 c、β2-微球蛋白及视黄醇结合蛋白浓度的倒数与 gFR的相关系数γ分别为0.75、0.70及0.39，血清肌酐浓度倒数与 gFR的相关系数γ为0.73。可见胱抑素 c是低分子量蛋白质中与 gFR最相关的内源性标志物，甚至优于血清肌酐。血清β2-微球蛋白浓度由于在炎症、肿瘤及免疫疾病时也可升高，故不是理想的 gFR内源性标志物，视黄醇结合蛋白的代谢十分复杂，且部分与前白蛋白结合，不能自由经肾小球滤过，故血清视黄醇结合蛋白浓度的倒数与 gFR 相关性最差，不能作为 gFR的内源性标志物。胱抑素 c即使在炎症状态下，其产生率也不会改变，血清浓度受年龄、性别、疾病的病情变化的影响较小。 pergande等用99m tc-DTPA 清除率作为肾小球滤过功能的“金标准”（＜1.36ml/s为肾小球滤过功能受损，分析了胱抑素 c、β2-微球蛋白及肌酐的血清浓度的诊断敏感性，结果发现它们诊断肾功能异常的敏感性分别为88.2%、64.7%及52.9[3，4]。随后 newman报道[5]血清胱抑素 c、肌酐浓度诊断异常 gFR的敏感性分别为78.1%及57.1%，各自浓度倒数与 gFR（51 cr-EDTA清除率）的相关系数分别为：0.81、0.50。 kyhse andersen[6]及 filley[7]的最近临床应用也表明血清胱抑素 c浓度与 gFR的相关性优于血清肌酐浓度。 rOC（ receiver operating Characteristic）作图分析发现，通过改变“分割限”（ cutoff limit）使胱抑素 c的诊断敏感性下降至70%时，其诊断特异性仍可达75%；而通过改变血清肌酐浓度的“分割限”，使其诊断敏感性下降至50%时，才能获得100%的特异性，使敏感性增加至100%时，其特异性接近于零。各自 rOC 曲线下面积相差显著（ p＜0.001），说明胱抑素 c的诊断准确性明显优于血清肌酐。

表1各种测定方法比较

方法检测限

μ g/L

%测定时间参考范围x± sD（范围），

mg/L

分析样

品数

rID3001138h 1.3±0.26(0.72～1.7)46

eIA3010 ~1216h 1.1±0.42(0.63～2.5)30 rIA 1.3n.d.16～21h0.96±0.20(0.6～1.7)100 fIA1n.d.lor3h n.d.

eIA n.d.n.d. 4.5h 1.1±0.1520 eIA 1.94～55h0.75±0.65(≤20岁)85

1.34±0.95(＞20岁)189

eIA0.1954～8 1.5h 1.25±0.22(0.86～1.7)50 eIA0.93～92h 1.78±0.26(女)33

2.14±0.31(男)33

pETIAm150 2.0～

3.2

7min(0.61±1.21)27 pETIA273～55min＜1.25

pENIA1703～56min(0.64～1.04)30 3血清胱抑素 c测定的方法学

由于血清中胱抑素 c浓度较低，故其测定方法需较高的分析灵敏度及特异性。 lofberg 等首先用单向免疫扩散法（ rID）及酶免疫测定法（ eIA）对胱抑素 c含量进行测定，按照目前的标准，当时报道的这两种方法不仅费时，而且检测限也差（分别为300、30μ g/L）。随后，又有较简单且更灵敏的放射、荧光及各种酶免疫测定（ rIA、 fIA及 eIA）的方法报道，以改善胱抑素 c测定的可靠性。1993年 pergande等[3]报道了一种夹心酶免疫测定方法，其检测限虽然很低（0.9μ g/L），但测定时间仍较长，无法常规应用，更无法用于急诊测定。以上各种测定方法均属非均相测定方法，很难自动化，因此限制了胱抑素 c的广泛临床应用。胶乳免疫测定是一种均相测定方法，在胶乳颗粒上包被抗体，与抗原结合时颗粒发生凝集，此方法很容易自动化。 kabanda等于1994年报道的测定胱抑素 c的胶乳颗粒凝集法是一种颗粒计数免疫测定法[8]。 kyhse andersen等[6]于同年报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法（ particle-enhanced turbidimetric immunoassay, PETIA），使胱抑素 c 测定的时间缩短至5min左右，且可在自动生化分析仪上进行，使胱抑素 c测定的常规应用成为可能。随后， newman等也报道了类似方法

[9]。1997年， finney等报道了一种能快速自动测定胱抑素 c的颗粒增强散射免疫比浊法（ particle-enhanced nephelometric immunoassay, PENIA），其测定结果与 pETIA法相关性良好[10]。各种胱抑素 c测定方法的比较见表1。

从表1可见，单纯就检测灵敏度而言， rID法最差，而 eIA、 rIA及 fIA法[11～14]均优于 pETIA及 pENIA法。由于 rIA法存在放射性污染， fIA法需昂贵的仪器，以及 rIA、 fIA、eIA法测定时间长，且不能全自动化，无法用于临床大批量标本的测定。 pETIA及 pENIA 法虽然检测灵敏度差些，但仍可达150μ g/L左右，远远低于健康人血清胱抑素 c浓度的下限值，可满足临床需要；这两种测定方法基本上不受血红蛋白、胆红素、类风湿因子、甘油三酯的影响，回收率可达95%～109%，批内及批间变异系数均较小（＜4.5%）；加上这两种方法可全自动化，故在血清胱抑素 c测定的常规临床应用中可首选 pETIA或 pENIA法。

各位研究者所报道的血清胱抑素 c浓度的参考范围有一定的差异，这一方面是由测定方法不同所致，另一方面与所用胱抑素 c标准品的来源不同有关，现应用的胱抑素 c标准品有3种类型：①从人尿中纯化的胱抑素 c；②纯化的人类胱抑素 c，并用重组胱抑素 c 定值；③重组胱抑素 c，并溶于马血清。 pergande等用一种尿蛋白标准品，发现血清胱抑素 c浓度存在性别差异，其它研究者利用其它标准品时未发现性别差异。因此，应制定有关标准品制备的统一标准，以便进行方法比较及参考范围的建立。

4小结

在肾脏疾病治疗中已涌现出许多新方法，如抗炎药物、肾移植及透析等。在应用这些方法的过程中，肾移植后排斥反应的监测及肾毒性药物肾毒性监测等。均需一种快速、简单且能准确地反映 gFR变化的指标[15]。无论从理论上还是实践中，血清胱抑素 c的测定均优于血清肌酐的测定，加上能自动化的检测的 pETIA及 pENIA方法的建立，已使胱抑素 c的广泛临床应用成为可能。在今后的实践中，应注意测定方法的标准化问题；观察血清胱抑素 c 浓度在不同肾脏疾病状态下的变化规律；应在更大的人群内测定血清胱抑素 c浓度，以分析是否存在年龄及性别相关的差异；从而最终确定胱抑素 c的敏感性及特异性。